שיטת הזרקת תאים חדשנית עם מינימום פלישה

Summary

שיטה זו מבטלת כל פלישה גדולה במהלך הזרקות תאים הנגרמת על ידי תמיסת תרחיף התא.

Abstract

הזרקה ישירה של תאים לרקמות היא תהליך הכרחי במתן תאים ו / או טיפול חלופי. הזרקת התא דורשת כמות מספקת של תמיסת השעיה כדי לאפשר לתאים להיכנס לרקמה. נפח תמיסת התרחיף משפיע על הרקמה, וזה יכול לגרום לפגיעה פולשנית גדולה כתוצאה מהזרקת התא. מאמר זה מדווח על שיטת הזרקת תאים חדשנית, הנקראת הזרקה איטית, שמטרתה למנוע פגיעה זו. עם זאת, דחיפת התאים מקצה המחט דורשת מהירות הזרקה גבוהה מספיק על פי חוק כוח הגזירה של ניוטון. כדי לפתור את הסתירה הנ"ל, נוזל לא ניוטוני, כגון תמיסת ג'לטין, שימש כתמיסת תרחיף התא בעבודה זו. לתמיסת ג'לטין יש רגישות לטמפרטורה, שכן צורתם משתנה מג'ל לסול בסביבות 20 מעלות צלזיוס. לכן, כדי לשמור על תמיסת השעיית התא בצורת ג'ל, המזרק נשמר מקורר בפרוטוקול זה; עם זאת, ברגע שהתמיסה הוזרק לגוף, טמפרטורת הגוף המירה אותו לסול. זרימת נוזל הרקמה הבין-תאית יכולה לספוג תמיסה עודפת. בעבודה זו, טכניקת ההזרקה האיטית אפשרה לכדורי קרדיומיוציטים להיכנס לשריר הלב המארח ולהשתיל ללא פיברוזיס מסביב. מחקר זה השתמש בשיטת הזרקה איטית כדי להזריק קרדיומיוציטים של חולדות ילודים מטוהרים ובצורת כדור לאזור מרוחק של אוטם שריר הלב בלב החולדה הבוגרת. לאחר חודשיים לאחר ההזרקה, הלבבות של הקבוצות המושתלות הראו שיפור משמעותי בתפקוד ההתכווצות. יתר על כן, ניתוחים היסטולוגיים של הלבבות המוזרקים לאט גילו קשרים חלקים בין המארח לבין קרדיומיוציטים מושתלים באמצעות דיסקים משולבים המכילים חיבורי צומת רווח. שיטה זו יכולה לתרום לטיפולים התאיים של הדור הבא, במיוחד ברפואה רגנרטיבית לבבית.

Introduction

ניהול תאים והחלפתם הם אסטרטגיות טיפוליות חדשות ומבטיחות לאיברים שניזוקו קשות. בין אסטרטגיות טיפוליות חדשניות אלה, רפואת הלב הרגנרטיבית משכה תשומת לב רבה. עם זאת, הדלקת הנגרמת על ידי פציעות מתווכת היווצרות צלקת במספר איברים 1,2,3,4. הלב האנושי מורכב מכ -10¹⁰ קרדיומיוציטים; לכן, תיאורטית^5,6, זה חייב להיות מטופלים עם יותר מ 10⁹ cardiomyocytes. מתן מספר רב של קרדיומיוציטים בשיטות הזרקה מסורתיות עלול להוביל לפגיעות משמעותיות^{ברקמה 7}. שיטה זו מספקת שיטת הזרקת תאים חדשנית עם פלישה מינימלית לרקמות.

מתן תאים לתוך פרנכימה איברים דורש זריקות. עם זאת, קיים פער בכך שההזרקה עצמה עלולה להוביל לפגיעה ברקמות. פגיעה ברקמות גורמת לדלקת מקומית ולהצטלקות חשוכת מרפא באיברים וברקמות, כמו גם לפגיעה ביכולת ההתחדשות ^8,9,10. ללב היונקים יש נטייה גבוהה מאוד לפתח צלקות במקום להתחדש, משום שהוא זקוק לתיקון פציעה מיידי על מנת לשאת את לחץ הדם הגבוה הנגרם על ידי תפקוד השאיבה המתמשך שלו¹¹. טיפול אבלציה מנצל נטייה גבוהה זו ליצירת צלקות וחוסם את המעגל הצפוי לעבור היווצרות צלקת באמצעות הפרעת קצב¹². במחקר קודם נצפה כי רקמת הצלקת בודדה את הקרדיומיוציטים המוזרקים בשריר הלב המארח. לפיכך, זהו נושא היעד הבא שיש להתגבר עליו כדי להשיג יעילות טיפולית משופרת ברפואה רגנרטיבית לבבית.

זרימת נוזל אינטרסטיציאלי ברקמה ממלאת תפקיד חיוני בהעברת חמצן וחומרים מזינים לתאים וסילוק הפסולת המופרשת מהתאים. המהירות הפיזיולוגית של זרימת נוזל אינטרסטיציאלי בכל רקמה/איבר שונה (הטווח הוא 0.01-10 מיקרומטר לשנייה)¹³. למיטב ידיעת המחבר, אין נתונים לגבי היכולת של רקמות/איברים בודדים לתמוך בכמויות נוספות של נוזלים ללא בצקת פתולוגית; עם זאת, ניסוי זה מנסה להשתמש במהירות הזרקה איטית כדי אולי להפחית את הפגיעה ברקמות, ואת התוצאות ניתן להשתמש כדי לקבוע את המעשיות של מושג זה.

Protocol

הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האתיות של האוניברסיטה הרפואית לניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדות האתיקה (מספר אישור: 23-104). כל בעלי החיים גודלו תחת מחזור אור-חושך קבוע בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים. כל כלי הניתוח המעוקרים, כגון מספריים, מלקחיים ושליפות, עברו אוטוקלאבינג וייבוש יסודי.

1. הכנת כדורי קרדיומיוציטים של חולדה ניאונטלית

1. אוסף לב חולדה בילוד
   1. עבור איסוף הלב, בצע הליך דומה לזה שתואר בדוח קודם⁷.
   2. יש לטבול חולדות ילודים (0-2 ימים לאחר הלידה) בתמיסות פובידון-יוד ואתנול 70% ברצף, ולאחר מכן להעביר אותן למארז אטום מלא באיזופלורן מאדים (הריכוז צריך להיות מעל 10% v/v) להרדמה עמוקה.
   3. לאחר אישור של חוסר הכרה על ידי אובדן פעילות לוקומוטורית, לערוף את ראשה של החולדה תוך אחיזת הגוף מאחור עם היד, ולאחר מכן לחתוך 2-4 מ"מ של רקמה מהמרכז הקדמי של כלוב הצלעות אל הקאודל ולאחר מכן בכיוון rostral באמצעות מספריים חדים.
   4. אחזו בעור האחורי כדי לפתוח את החתך ודחפו את הלב החוצה מכלוב הצלעות. חתכו את החדרים באמצעות מספריים וטבלו אותם במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיום (PBS(−)).
2. פיזור קרדיומיוציטים של חולדה בילוד
   1. טחנו את החדרים שנאספו מפוזרים בכמות מינימלית של מאגר מודעות (מאגר מודעות: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH₂PO 4, 5.6 mM גלוקוז, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO₄, pH 7.35) בכלי זכוכית קעורים אוטוקלאביים לחתיכות קטנות (1 מ"מ x 1 מ"מ) באמצעות מספריים מעוקלים.
   2. מעבירים את הרקמות הטחונות ואת הבוחש המיקרו-מגנטי לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ומפזרים את הרקמות לתאים בודדים עם 0.1% קולגן, 0.1% טריפסין, 20 מיקרוגרם/מ"ל DNase I ו-50 ננומטר טטרמתילרודאמין מתיל אסטר במאגר Ads ב-37°C על ידי ערבוב במשך 30 דקות.
   3. מפרידים את הצברים והתאים המפוזרים באמצעות שיקוע טבעי, אוספים רק את התאים המפוזרים לתוך צינור, ומעכלים שוב את צברי התאים השיוריים עם אותו מדיום עיכול.
   4. המשך בהליך זה עד שכל התאים מנותקים לחלוטין. כדי לאשר את הפיזור המלא של התאים, התבוננו בצינורות תחת מיקרוסקופ (עדשה אובייקטיבית 4x).
   5. אסוף את התאים המפוזרים באמצעות צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות ונתק אותם ב 1-2 מ"ל של מאגר מודעות.
3. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות של קרדיומיוציטים
   1. נתח את התאים באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות מסנני פסים של 556-601 ננומטר כדי לזהות אותות פלואורסצנטיים אדומים.
   2. בזהירות לבצע pre-gating כדי למנוע שברים כפולים¹⁴. הגדרות השער לסילוק כפול צריכות להיות בהתאם להוראות היצרן.
   3. הגדר את הפיזור קדימה על ציר ה-x ואת האות הפלואורסצנטי האדום על ציר ה-y. נצפו שלוש אוכלוסיות: אוכלוסייה נמוכה ביותר המכילה אריתרוציטים ותאים מתים, אוכלוסייה אמצעית המכילה שאינם קרדיומיוציטים, כולל פיברובלסטים ותאי אנדותל, ואוכלוסייה עליונה המכילה קרדיומיוציטים חדריים טהורים⁷.
4. הכנת כדורי קרדיומיוציטים אדומים עם תווית פלואורסצנטית
   1. מיין באופן סלקטיבי את cardiomyocytes, ואת הצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 150 x גרם. יש להמיס לחלוטין את כדורי התא ב-1 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי מהונדס אלפא (alpha-MEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS).
   2. מדוד את ריכוז התא באמצעות המוציטומטר ודלל את תמיסת תרחיף התא ל -3,000 תאים / מ"ל עם אלפא-MEM 10% FBS.
   3. פזרו אותם לצלחות 96 בארות לא דביקות תאים (100 מיקרוליטר לבאר), לצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-100 x גרם, ולתרבית ל-2-3 ד' באינקובטור תרבית תאים עם 5%_CO2 ב-37°C.
   4. לפני ניסויי ההזרקה, קצרו כדור קרדיומיוציטים מכל באר באמצעות שאיפה עם מדיום התרבית באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, ואספו אותם בצינור של 15 מ"ל.
   5. יש להכתים עם PKH26 בהתאם להוראות היצרן למעקב לאחר ההשתלה.

2. הכנות לשיטת ההזרקה האיטית

1. הכנת תמיסת מלאי הג'לטין
   1. שקלו את הג'לטין, המסו אותו במאגר המודעות כדי לייצר תמיסת W/V של 10% והפכו אותו לאוטוקלאב.
2. ייצור מכשיר הזרקת תאים
   1. תכנון כולל של המכשיר: הכינו את המכשיר שמוצג באיור 1. מערכת זו משולבת עם מנגנון קירור מזרק ומנגנון הזרקה ראשי.
   2. הכן את מנגנון ההזרקה העיקרי המתואר להלן:
      1. להזרקת כדור קרדיומיוציטים בילוד, השתמש במחט באורך 29 G, 50 מ"מ המצוידת במזרק.
      2. חברו מזרק העברת חשמל (18G, 1 מ"ל) גב אל גב באמצעות מזרק הזרקת תאים (איור 1). חבר את המחט של מזרק העברת הכוח לצינור פוליפרופילן דק עם יכולת הרחבה לומן נמוכה.
      3. לאחר מכן, חבר את הצד השני של צינור העברת החשמל למחט של אותו מזרק (18G, 1 מ"ל), והגדר אותו במשאבת מזרק. מלאו את שני מזרקי העברת החשמל והצינורות במים ללא בועות אוויר.
         הערה: כאשר בוכנה אחת של מזרק העברת הכוח נדחפת פנימה, הלחץ מועבר ישירות למזרק השני, והבוכנה בולטת.
   3. הגדר את מערכת קירור מזרק ההזרקה כמתואר להלן.
      1. סובב צינור נחושת (קוטר חיצוני = 1 מ"מ; קוטר פנימי = 0.3 מ"מ; עובי = 0.35 מ"מ) בחוזקה סביב החלק המכיל את התא של מזרק הזרקת התא, ומשאיר 10 מ"מ של צינור עודף בשני קצותיו.
      2. חבר את צינור הנחושת לצינורות פלסטיק גמישים. יתר על כן, חברו את הקצוות האחרים של צינורות הפלסטיק למשאבה חיצונית, מלאו את הקו במי קירור וקררו את המים על-ידי טבילת צינור הנחושת העודף בקרח כתוש (איור 1).
         הערה: מערכת קירור זו שומרת על תמיסת מתלה התא בצילינדר בטמפרטורה של כ- 2°C.

3. פיתוח מודל אוטם שריר הלב של חולדה על ידי חסימת עורקים כליליים מעורפלים

1. יש להרדים חולדות עירומות זכרים עם חסר חיסוני (F344/Njcl-rnu/rnu) באוויר המכיל 3% איזופלורן. מחדירים צינורית לקנה הנשימה ומחברים אותה למכונת ההנשמה.
2. חבר צינורית לוופורייזר איזופלורן עם בקר כדי לשמור על ריכוז איזופלורן של 3%, ובכך לשמור על הרדמה מספקת. ודא שאין תגובה לגירויי כאב. החל משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש.
3. תקן את הגפיים עם סרטים כירורגיים חתוכים על צלחת כירורגית מחוממת 40 מעלות צלזיוס. סובבו את גוף החולדה מימין לציר הגוף והשתמשו בבית השחי השמאלי כשדה ניתוחי.
4. הסר את השיער בתחום הניתוח באמצעות קרם depilatory לנגב את העור עם povidone-יוד. בעזרת מספריים חדים, חותכים חתך של 1.5 ס"מ בעור ובשריר החזה הראשי.
5. אשר את החלל הבין-קוסטלי השלישי וקרע את השרירים הבין-קוסטליים והצדר הקוסטלי באמצעות מיקרו מלקחיים עם קצוות קהים. שמור על החזה פתוח באמצעות retractor. הסר בעדינות את קרום הלב הדק עם מלקחיים.
6. כדי לבנות מודל אוטם של הדופן הצידית של הלב, מצאו את המיקום 1 מ"מ קאודלי לקצה האטריום השמאלי כדי לזהות את העורק הכלילי האטום, העבירו תפר משי 7-0, גרפו רקמה ברוחב 2.5 מ"מ ובעומק 2.5 מ"מ מהגבי לגחון, וקשרו את הרקמה בחוזקה.
7. לאשר קשירה מוצלחת על ידי כיווץ חלש דיסטלי מן הליגטורה. לאחר הסרה עדינה של המשענת, מניחים תפר משי 5-0 בין החלל הבין-קוסטלי השני והרביעי, וסוגרים את בית החזה.
8. להפחית את ריכוז isoflurane ל 1%. תפרו בעדינות את השריר והעור עם משי 5-0. יש להפחית את ריכוז האיזופלורן ל-0% ולהמתין כ-5 דקות עד לתחילת נשימה ספונטנית.
9. יש למרוח 2 מ"ג/מ"ל לידוקאין במי מלח על החתך. מתן 1 מ"ל של מלוחים באמצעות הזרקה תת עורית. יש למרוח משחה וטרינרית באופן מקומי כדי למנוע זיהומים.
10. הסר את החולדה מצינור האינטובציה, וחזור לכלוב בעלי החיים; לאחר מכן, לגדל את החולדות בכלובים בודדים במשך שבוע אחד.
11. לנתח את השינויים בתפקוד משאבת הלב הסיסטולית באמצעות אקוקרדיוגרפיה.
    הערה: תפקוד הלב יופחת עקב אוטם שריר הלב הצידי.

4. השתלת תאים מלעוריים מונחי אקו בשיטת ההזרקה האיטית

1. יש לחמם מראש מלאי ג'לטין 10% ב-37°C צלזיוס עד שהוא הופך לנוזלי.
2. יש לדלל 10% מלאי ג'לטין עם מאגר מודעות שחומם מראש כדי לקבל את תמיסת הג'לטין הסופית הניתנת להזרקה של 5% w/v (100 μL נדרש לכל חיה).
3. יש להשהות 96 כדורי קרדיומיוציטים (סה"כ: 28,800 קרדיומיוציטים לבעל חיים) ב-100 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה מחוממת מראש.
4. לטעון את המתלה מוכן בשלב 4.3 לתוך מזרק הזרקת התא, הימנעות שאיפה של אוויר עודף.
5. כדי למנוע בועות במזרק, החזק אותו אנכית עם המחט כלפי מעלה, הקש על המזרק ואסוף את כל הבועות ברכס העליון של המזרק.
   הערה: במהלך שלב זה, שימו לב שכדורי קרדיומיוציטים מתיישבים בהדרגה על חותם הגומי של הבוכנה.
6. שמור על המיקום האנכי של המזרק, לדחוף את הבוכנה לאט, ולהשליך את הבועות ואת תמיסת תמיסת תרחיף התא העודף עד 20 μL של תרחיף התא נשאר מזרק. לדחוף את הבוכנה בזהירות במהירות קבועה, כך כדור cardiomyocyte נשאר לנוח על חותם הגומי של הבוכנה.
7. טבלו את המזרק הסגור ישירות באמבט קרח למשך 5 דקות.
8. מניחים מזרק מקורר במנגנון ההזרקה. תקן בחוזקה את מנגנון מזרק ההזרקה התיישב על מכשיר תנועה עדין על במת בעלי החיים באמצעות מהדק מתכוונן מיקום X-Y-Z בעבודת יד. מכשיר התנועה העדינה יכול להזיז את מיקום המחט באמצעות החלקה בכיוון x של 20 מ"מ, נדנדה בכיוון y ותנועות קידה בכיוון z.
9. מרדימים את החולדות בקופסה אטומה מלאה באוויר המכיל 3% איזופלורן. יש לאשר את ההרדמה ללא תגובה לגירויי כאב. החל משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש.
10. תקן את הגפיים עם סרטי ניתוח חתוכים על צלחת הד מחוממת של 40 מעלות צלזיוס. כדי לשמור על הרדמה מספקת, ודא שהאוויר הנשאף מכיל ריכוז של כ -3% של איזופלורן.
11. הסר את השיער בשדה ההזרקה (בקוטר 2 ס"מ) והחזה עם קרם depilatory ונגב את העור עם יוד פובידון.
12. החל אקו-ג'ל על החזה ובדיקת הד. הניחו את בדיקת האקו קרוב לחזה לאורך צירי הגולגולת והקאודלי והתחילו לקבל אקוקרדיוגרפיה במצב B בהתאם למדריך היצרן.
13. מקדמים את קצה מחט ההזרקה לתוך שריר הלב במבט חזיתי (איור 2 וסרטון משלים 1).
14. כדי להפעיל את משאבת המזרק הראשית, לחץ על לחצן התחל וסובב את החוגה כדי להתאים למספר שנקבע מראש למהירות הזרקה של כ- 0.02 μL/s. יש למרוח משחה וטרינרית באופן מקומי סביב תנוחת המחט כדי למנוע זיהומים.
    הערה: יש לקבוע את מספר החיוג המתאים למהירות ההזרקה המיועדת באמצעות תמיסת הזרקה. לאחר ההזרקה, הסר את מחט ההזרקה באמצעות מערכת תנועה למופת.
15. הפחיתו את ריכוז האיזופלורן ל-0% והמתינו כ-5 דקות עד שבעל החיים חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.

5. הערכת תפקוד הלב

1. מרדימים את החולדות בקופסה אטומה מלאה באוויר המכיל 3% איזופלורן. יש לאשר את ההרדמה ללא תגובה לגירויי כאב. החל משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש.
2. יש למרוח קרם מחשמל לרכישת אק"ג על קצות הגפיים. תקן את הגפיים עם סרטי ניתוח חתוכים על צלחת הד מחוממת של 40 מעלות צלזיוס. השתמש במערכת ניטור פיזיולוגי כדי לזהות אק"ג וקצב לב בזמן אמת.
3. על פי הוראות היצרן, קבע תחילה את זווית הציר הארוך באמצעות תמונת הד במצב B המציגה את קודקוד החדר השמאלי לדרכי היציאה, ולאחר מכן סובב את בדיקת ההד ב- 90° כדי לשנות לתצוגת הציר הקצר.
4. באמצעות מערכת התנועה העדינה של הציר הקאודלי עד הרוסטרלי בלבד של שלב החיה, התאימו את תצוגת הציר הקצר לרמת השריר הפפילרי. לאחר מכן, שנה את מצב התמונה למצב M על ידי לחיצה על כפתור M-mode , והקליט סרטון במשך 5 שניות על ידי לחיצה על כפתור Cine-loop .
5. כדי לנתח ולחשב את קיצור השברים באמצעות התוכנה, לחצו על כפתור המדידה ועל כלי קו אנכי להגדרת הממדים הפנימיים של החדר השמאלי הסיסטולי והדיאסטולי הקצה. התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את קיצור השברים באחוזים (FS).
6. הפחיתו את ריכוז האיזופלורן ל-0% והמתינו כ-5 דקות עד שבעל החיים חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.

6. אימונוהיסטוכימיה

1. תקן את הגוף שעבר המתת חסד (בצע המתת חסד כמו בשלב 1.1.3) על השולחן באמצעות סרטי הניתוח החתוכים, הבלו את הלבבות, שטוף עם PBS, וטבול את הלב ב 4% paraformaldehyde / PBS.
2. נתחו את הלבבות לשלושה חלקים, טבלו אותם ב-40% סוכרוז להגנה מפני הקפאה, הטמיעו בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) והקפיאו אותם בטמפרטורה של -80°C.
3. חבר את רקמות ההקפאה (עובי 8 מיקרומטר) לשקופיות זכוכית מצופות אמינוסילן. לאחר ייבוש מספק באמצעות רוח לא מחוממת הנוצרת על ידי מייבש שיער כללי, יש לטבול את מגלשות הזכוכית במי מלח חוצצים בתריס המכילים 0.2% Tween-20 (TBS-T).
4. לטבול אותם בתמיסת חסימה במשך 30 דקות ב 25 ° C. יש לשפוך 100 μL של תמיסת החסימה הראשונית המכילה נוגדנים על המגלשה, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם איטום פרפין כדי לשמור על תמיסת הנוגדנים מפוזרת על הרקמה.
   הערה: ריכוז הנוגדנים מוצג בטבלת החומרים.
5. הניחו את המגלשות אופקית בקופסה בעבודת יד עם לחות גבוהה תוך ניצול האדים הטבעיים מנייר רטוב למניעת אידוי. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם TBS-T.
6. יש לטפל עם החומר החוסם המשני המכיל נוגדנים במשך שעה אחת ב-25°C באותו אופן כמו הנוגדן הראשי. לאחר שלוש שטיפות, צפו באותות הפלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.
   הערה: ריכוז הנוגדנים מוצג בטבלת החומרים.
7. ניתוח סטטיסטי: לצורך השוואת נפח התא, כפי שמוצג באיור 3A, בצעו בדיקת t לא זוגית; כדי להעריך את ההתאוששות התפקודית של הלב לאחר מתן קרדיומיוציטים באמצעות שיטת ההזרקה האיטית, כפי שמוצג באיור 4A, השתמש במבחן T זוגי. בעבודה זו, הבדלים נחשבו מובהקים סטטיסטית ב - P < 0.01. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן.

תוצאות

השפעות ההזרקה האיטית על הישרדות התאים ושקיעת הקולגן
כדורי קרדיומיוציטים של חולדות יילודים המסומנים ב-PKH26 הוזרקו לשריר הלב של חולדה עירומה רגילה בשיטת הזרקה רגילה או איטית. התוצאות הראו ששיטת ההזרקה האיטית הגדילה באופן משמעותי את נפח התא המושתל (איור 3A) והפחיתה באופן משמעותי את שקיעת הקולגן מסוג I באתר (איור 3B).

השפעות הזרקה איטית על יעילות הטיפול במודל אוטם חולדות
שיטת ההזרקה האיטית מונחית אקו לב שימשה להזרקת כדורי קרדיומיוציטים של חולדות יילודים או PBS (−) ללבבות האוטמים של חולדות מודל. הקבוצה שקיבלה הזרקת תאים בלבד הראתה שיפור משמעותי בתפקוד התכווצות הלב לאחר חודשיים (איור 4A). ניתוחים אימונוהיסטוכימיים חשפו קשר חלק בין התאים המושתלים לבין מיוציטים מארחים באמצעות דיסקים משולבים המכילים צמתי רווח (איור 4B).

איור 1: סכמה של כל מערכת ההזרקה . (A) מנגנון הזרקה ראשי. (B) מערכת קירור מזרק הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הזרקה איטית מלעורית מונחית אקוקרדיוגרפיה . (A) הגדרת החיה, בדיקת הד ומנגנון ההזרקה. (B) מבט אקוקרדיוגרפי של המזרק המזריק והלב. שים לב שהתמונה השמאלית והימנית זהות, אך נוסף קו צהוב כדי לציין את מיקום המחט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השפעת שיטת ההזרקה האיטית על נפח התא המושתל ועל שקיעת הקולגן . (A) נפחי התאים המושתלים (N=3) חושבו מקטעים טוריים. קווי השגיאה מציינים סטיות תקן. *P < 0.01 במבחן t לא מזווג. (B) צביעה אימונוהיסטוכימית לקולגן מסוג I. סרגל קנה המידה מציין 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שיפורים בתפקוד הלב ואינטגרציה היסטולוגית עם כדורי קרדיומיוציטים שהושתלו בשיטת ההזרקה האיטית . (A) תצוגות אקו לב מייצגות במצב M. הגרף מראה את המעבר של קצרות שברים בקבוצה המושתלת כדורי קרדיומיוציטים (קו אדום מוצק; N = 4) וקבוצת הרכב (פתרון מתלה תאים לשיטת ההזרקה האיטית) (קו כחול מקווקו; N = 3). קיצורים: MI = אוטם שריר הלב; Cx43 = קונקסין 43; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; PKH26 = תווית קרום תא פלואורסצנטי אדום. קווי השגיאה מציינים את סטיות התקן. *P < 0.01 במבחן t זוגי. (B) ניתוחים אימונוהיסטוכימיים של הקשר בין כדורי קרדיומיוציטים מושתלים לבין קרדיומיוציטים מארחים. התצפיות המיקרוסקופיות הרגילות בלייזר באמצעות עדשה אובייקטיבית 2x מוצגות בטור השמאלי. גרסאות מוגדלות (באמצעות עדשה אובייקטיבית של 20x) של שני אזורים המוצגים בתיבה, המסומנים ב- * ו- #, מוצגות להלן. פסי קנה מידה: תמונה עליונה = 300 מיקרומטר; * ו- # = 30 מיקרומטר. תמונות מיקרוסקופיות לייזר קונפוקליות המשתמשות בעדשה אובייקטיבית של 20x מוצגות יחד עבור comaparison. מוצגות שלוש עמדות. בתמונות הממוזגות, ראשי החצים מצביעים על קיומם של צמתי מרווחים (Cx43) המחברים ישירות בין השתל לבין קרדיומיוציטים מארחים. סרגל קנה המידה מציין 30 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון משלים 1: שיטת הזרקה איטית מונחית הד. אקו לב במצב B בתצוגה הקדמית מראה את קצה מחט ההזרקה מתקדם לתוך שריר הלב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

אחת הנקודות הקריטיות בביצועים מוצלחים של שיטת ההזרקה האיטית היא הכנת מערכת הזרקה יעילה באמצעות משאבת מזרק חזקה וצינור העברת לחץ חזק. מערכת לחץ גבוה נדרשת כדי לדחוף ג'ל החוצה מקצה מחט דקה. הנקודה הקריטית השנייה היא ייצוב הלב. פעימות הלב כנגד מחט הזרקה המתקדמת לתוך שריר הלב עלולות לפגוע ברקמה. במחקר זה בוצעה זריקה מונחית אקו כדי למנוע מהחיות לעבור פגיעה שנייה בחזה הפתוח וכדי לתת את הזרקת התאים בלב מיוצב כשהריאות מנופחות. יתר על כן, בחלק מהיישומים עבור בעלי חיים גדולים יותר או בני אדם, יש לשקול כמה מכשירי הזרקה המחוברים ללב כחלק מהתכנון האסטרטגי של היישום. עבור הזרקות חזה פתוח לליבם של בעלי חיים קטנים, מומלץ להשתמש במחט ארוכה וגמישה בהתחשב בקצב הלב הגבוה שלהם.

בעבודה זו, שיטת ההזרקה האיטית הגדילה באופן משמעותי את נפח הקרדיומיוציטים ששרדו בהשוואה לשיטת ההזרקה הרגילה. ההזרקה הרגילה גורמת נזק לתאים באמצעות לחץ גזירה¹⁵. לעומת זאת, שיטת ההזרקה האיטית אינה גורמת ללחץ כזה באופן תיאורטי מכיוון שהיא משתמשת בתמיסה לא ניוטונית בנוסף להזרקה האיטית.

במונחים של פיברוזיס מקומי, החלל הבין-תאי סביב הקרדיומיוציטים ששרדו בדרך כלל המוזרקים הראה שקיעת קולגן מסוג I חזקה ונפוצה. לעומת זאת, אותות הקולגן מסוג I סביב הקרדיומיוציטים המושתלים שהושתלו בשיטת ההזרקה האיטית היו חלשים ומוגבלים בהרבה. הדבר מצביע על כך ששיטת ההזרקה האיטית גרמה לנזק קטן משמעותית. הזרקה איטית של קרדיומיוציטים בילוד לתוך שריר הלב הבוגר שיפרה באופן משמעותי את תפקוד ההתכווצות של הלב האוטם. הניתוחים ההיסטולוגיים הציעו כי השתלת הקרדיומיוציטים בשיטת ההזרקה האיטית הביאה לקשרים ישירים וצימוד פונקציונלי עם הקרדיומיוציטים המאכסן. תופעה זו מסבירה את מנגנון ההתאוששות התפקודית של שריר הלב המארח. למיטב ידיעתנו, זהו הדיווח הראשון של קרדיומיוציטים מושתלים בילוד עם חיבורים חלקים בקנה מידה גדול לקרדיומיוציטים הבוגרים המארחים. הקשרים התפקודיים עם שריר הלב המארח באמצעות צימוד חשמלי ומכני עשויים להבשיל את הקרדיומיוציטים המושתלים ולאפשר להם לפעול כמיוציטים פונקציונליים התורמים לתפקוד הלב המארח. אינטראקציות כוח פיזי ארוכות טווח בין המארח לבין קרדיומיוציטים של השתל הן חיוניות להבשלה מלאה. לכן, 2 חודשים עשויים להידרש לאחר ההזרקה להחלמה תפקודית של הלב אוטם. ההתאוששות תלוית הזמן של תפקוד הלב של המטופל עשויה להיות תופעה צפויה ביישומים טיפוליים, וזה יכול להיות סימן ההיכר של ביסוס מוצלח של צימוד תפקודי דה נובו ואינטגרציה בין המארח לבין קרדיומיוציטים מושתלים.

ניתן לבצע את שיטת ההזרקה האיטית במהלך ניתוח חזה פתוח. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על עכברים. עבור יישומים עתידיים בטיפול אנושי, אנחנו עדיין צריכים לפתור כמה בעיות. מהירות ההזרקה צריכה להיות אופטימלית על ידי התחשבות בקיבולת החיץ של זרימת הנוזל הבין-תאי, בכל איבר מטרה אנושי. יש ליישם חומרים נטולי קסנו, כגון ג'לטין אנושי או חומרים סינתטיים מתכלים. יש לפתח מנגנון הזרקה איטית קליני בדרגת GMP, כגון כלים חד-פעמיים קומפקטיים ספציפיים לאיברים או מכשיר לשימוש חוזר באיברים רחבים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needle & tuberculin, 1 mL	Terumo	NN1838R, SS-01T
29-gauge 50 mm-long needle	Ito Corporation, Tokyo, Japan	14903 Type-A
A copper tube	General Suppliers		outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm
Ads Buffer	Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan		Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35
alpha-MEM	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	051-07615
Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L)	Proteintech	14695-1-AP	using dilution 1:100
Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L)	Sigma Aldrich	C6219	using dilution 1:100
Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206	using dilution 1:300
blocking solution (Blocking One)	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	03953-95
collagenase	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	034-22363
confocal laser microscope	Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany	LSM510 META
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
FACS Aria III	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA
fetal bovine serum	BioWest, FL, USA	S1820-500
fine movement device (Micromanipulator)	Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan	M-44
fluorescence microscope	Nikon Instruments, Tokyo, Japan	Eclipse Ti2
gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	G9382	dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it
Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats	Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan		0–2 d after birth
non-adhesive 96-well plates (spheloid plate)	Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan	MS-0096S
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA	Tissue-Tek OCT compound
peristaltic pump (for cooling system)	As One Co., Osaka, Japan	SMP-23AS
PKH26	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2	Chemglass life sciences LLC, NJ, USA	CG-2003-120
syringe	Ito Corporation, Tokyo, Japan	MS-N25
syringe pump with remote controller	As One Co., Osaka, Japan	MR-1, CT-10
tetramethylrhodamine methyl ester	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	T668
trypsin	DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA	215240
Tween-20	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	167-11515
veterinarian ointment	Fujita Pharmaceutical Co., Ltd.	Hibikusu ointment  #WAK-95832
Vevo 2100 Imaging System	Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada	Vevo 2100
Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0	Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada	Vevo 2100
Weakly curved needle with ophthalmic thread	Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan	C7-70