Un nuovo metodo di iniezione cellulare con un'invasione minima

Riepilogo

Questo metodo elimina qualsiasi invasione importante durante le iniezioni cellulari causata dalla soluzione di sospensione cellulare.

Abstract

L'iniezione diretta di cellule nei tessuti è un processo necessario nella somministrazione cellulare e/o nella terapia sostitutiva. L'iniezione cellulare richiede una quantità sufficiente di soluzione in sospensione per consentire alle cellule di entrare nel tessuto. Il volume della soluzione in sospensione influisce sul tessuto e questo può causare gravi lesioni invasive a seguito dell'iniezione cellulare. Questo documento riporta un nuovo metodo di iniezione cellulare, chiamato iniezione lenta, che mira a evitare questa lesione. Tuttavia, l'espulsione delle cellule dalla punta dell'ago richiede una velocità di iniezione sufficientemente elevata secondo la legge di Newton della forza di taglio. Per risolvere la contraddizione di cui sopra, in questo lavoro è stato utilizzato un fluido non newtoniano, come la soluzione di gelatina, come soluzione di sospensione cellulare. Le gelatine hanno sensibilità alla temperatura, poiché la loro forma cambia da gel a sol a circa 20 °C. Pertanto, per mantenere la soluzione di sospensione cellulare sotto forma di gel, la siringa è stata mantenuta raffreddata in questo protocollo; Tuttavia, una volta che la soluzione è stata iniettata nel corpo, la temperatura corporea l'ha convertita in un sol. Il flusso di fluido tissutale interstiziale può assorbire la soluzione in eccesso. In questo lavoro, la tecnica dell'iniezione lenta ha permesso alle sfere di cardiomiociti di entrare nel miocardio ospite e di attecchire senza fibrosi circostante. Questo studio ha impiegato un metodo di iniezione lenta per iniettare cardiomiociti di ratto neonatale purificati e formati a sfera in un'area remota di infarto miocardico nel cuore di ratto adulto. A 2 mesi dall'iniezione, i cuori dei gruppi trapiantati hanno mostrato un miglioramento significativo della funzione contrattile. Inoltre, le analisi istologiche dei cuori a iniezione lenta hanno rivelato connessioni senza soluzione di continuità tra l'ospite e i cardiomiociti dell'innesto tramite dischi intercalati contenenti connessioni di giunzione gap. Questo metodo potrebbe contribuire alle terapie cellulari di prossima generazione, in particolare nella medicina rigenerativa cardiaca.

Introduzione

La somministrazione e la sostituzione delle cellule sono nuove strategie terapeutiche promettenti per gli organi gravemente danneggiati. Tra queste nuove strategie terapeutiche, la medicina rigenerativa cardiaca ha attirato una notevole attenzione. Tuttavia, l'infiammazione causata dalle lesioni media la formazione di cicatrici in diversi organi 1,2,3,4. Il cuore umano è costituito da circa 10,¹⁰ cardiomiociti; Pertanto, teoricamente^5,6, deve essere trattato con più di 10⁹ cardiomiociti. La somministrazione di un gran numero di cardiomiociti tramite metodi di iniezione tradizionali può portare a lesioni tissutali significative⁷. Questo metodo fornisce un nuovo metodo di iniezione cellulare con un'invasione di tessuto minima.

La somministrazione di cellule nel parenchima dell'organo richiede iniezioni. Tuttavia, esiste una discrepanza in quanto l'iniezione stessa può portare a lesioni tissutali. La lesione tissutale provoca infiammazione locale e cicatrici incurabili negli organi e nei tessuti, nonché una compromissione della capacità rigenerativa ^8,9,10. Il cuore dei mammiferi ha una propensione estremamente elevata a sviluppare cicatrici invece di rigenerarsi perché richiede una riparazione immediata delle lesioni per sopportare l'ipertensione causata dalla sua funzione di pompaggio continuo¹¹. La terapia di ablazione utilizza questa elevata propensione alla formazione di cicatrici e blocca il circuito che potrebbe subire la formazione di cicatrici utilizzando l'aritmia¹². In uno studio precedente, è stato osservato che il tessuto cicatriziale isolava i cardiomiociti iniettati nel miocardio dell'ospite. Pertanto, questo rappresenta il prossimo problema target che deve essere superato per ottenere una migliore efficacia terapeutica nella medicina rigenerativa cardiaca.

Il flusso del fluido interstiziale tissutale svolge un ruolo fondamentale nel trasporto di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule e nella rimozione dei rifiuti escreti dalle cellule. La velocità fisiologica del flusso di liquido interstiziale in ciascun tessuto/organo è diversa (l'intervallo è 0,01-10 μm/s)¹³. Per quanto a conoscenza dell'autore, non ci sono dati riguardanti la capacità dei singoli tessuti/organi di supportare quantità extra di liquidi senza edema patologico; Tuttavia, questo esperimento tenta di utilizzare una bassa velocità di iniezione per ridurre possibilmente il danno tissutale e i risultati possono essere utilizzati per determinare la praticità di questo concetto.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida etiche della Kansai-Medical University per gli esperimenti sugli animali e sono stati approvati dai comitati etici (numero di approvazione: 23-104). Tutti gli animali sono stati allevati in un ciclo costante luce-buio in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni. Tutti gli strumenti chirurgici sterilizzati, come forbici, pinze e divaricatori, sono stati sterilizzati in autoclave e asciugati accuratamente.

1. Preparazione delle palline di cardiomiociti neonatali di ratto

1. Collezione di cuori di ratto neonatale
   1. Per il prelievo del cuore, seguire una procedura simile a quella descritta in un precedente rapporto⁷.
   2. Immergere i ratti neonatali (0-2 giorni dopo la nascita) Sprague-Dawley (SD) in soluzioni di iodio povidone ed etanolo al 70% in sequenza, quindi trasferirli in una custodia ermetica riempita con isoflurano vaporizzato (la concentrazione deve essere superiore al 10% v/v) per un'anestesia profonda.
   3. Dopo la conferma dell'incoscienza da parte di una perdita di attività locomotoria, decapitare il ratto mentre tiene il corpo dalla schiena con la mano, quindi tagliare 2-4 mm di tessuto dal centro frontale della gabbia toracica alla caudale e poi in direzione rostrale usando forbici affilate.
   4. Afferra la pelle posteriore per aprire il taglio e spingere fuori il cuore dalla gabbia toracica. Tagliare i ventricoli con le forbici e immergerli in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio o magnesio (PBS(−)).
2. Dispersione dei cardiomiociti neonatali di ratto
   1. Tritare i ventricoli raccolti dispersi in una quantità minima di tampone Ads (tampone ADS: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH₂PO 4, 5,6 mM glucosio, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO₄, pH 7,35) in una vetreria concava autoclavata in piccoli pezzi (1 mm x 1 mm) utilizzando forbici curve.
   2. Trasferire i tessuti tritati e un agitatore micromagnetico in una provetta di centrifugazione da 50 mL e disperdere i tessuti in singole cellule con collagenasi allo 0,1%, tripsina allo 0,1%, DNasi I da 20 μg/mL e estere metilico di tetrametilrodamina da 50 nM in tampone Ads a 37 °C agitando per 30 minuti.
   3. Separare gli aggregati e le cellule disperse attraverso la sedimentazione naturale, raccogliere solo le cellule disperse in una provetta e digerire nuovamente gli aggregati cellulari residui con lo stesso mezzo di digestione.
   4. Continuare questa procedura fino a quando tutte le cellule non sono completamente dissociate. Per confermare la completa dispersione delle cellule, osservare i tubi al microscopio (lente dell'obiettivo 4x).
   5. Raccogliere le cellule disperse mediante centrifugazione a 150 x g per 5 minuti e dissociarle in 1-2 mL di tampone Ads.
3. Selezione cellulare dei cardiomiociti attivata dalla fluorescenza
   1. Analizza le cellule utilizzando il cell sorting attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando filtri passa-banda 556-601 nm per rilevare i segnali di fluorescenza rossa.
   2. Eseguire con attenzione il pre-gating per eliminare le frazioni di doppietto¹⁴. Le impostazioni del cancello per l'eliminazione del doppietto devono essere conformi alle istruzioni del produttore.
   3. Impostare la dispersione diretta sull'asse x e il segnale di fluorescenza rossa sull'asse y. Sono state osservate tre popolazioni: una popolazione più bassa contenente eritrociti e cellule morte, una popolazione intermedia contenente non cardiomiociti, inclusi fibroblasti e cellule endoteliali, e una popolazione superiore contenente cardiomiociti ventricolari puri⁷.
4. Preparazione di sfere cardiomiocitarie marcate con fluorescenza rossa
   1. Ordinare selettivamente i cardiomiociti e centrifugare per 5 minuti a 150 x g. Sciogliere completamente i pellet cellulari in 1 mL di terreno minimo essenziale alfa-modificato (alfa-MEM) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) inattivato dal calore.
   2. Misurare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e diluire la soluzione di sospensione cellulare a 3.000 cellule/mL con FBS alfa-MEM al 10%.
   3. Distribuirli in piastre cellulari non adesive a 96 pozzetti (100 μL per pozzetto), centrifugare per 5 minuti a 100 x g e coltura per 2-3 giorni in un incubatore per colture cellulari con il 5% di CO₂ a 37 °C.
   4. Prima degli esperimenti di iniezione, prelevare una sfera di cardiomiociti da ciascun pozzetto tramite aspirazione con il terreno di coltura utilizzando una pipetta da 1.000 μL e raccoglierli in una provetta da 15 mL.
   5. Colorare con PKH26 seguendo le istruzioni del produttore per l'inseguimento dopo l'attecchimento.

2. Preparativi per il metodo dell'iniezione lenta

1. Preparazione della soluzione madre di gelatina
   1. Pesare la gelatina, scioglierla nel tampone Ads per produrre una soluzione al 10% p/v e sterilizzarla in autoclave.
2. Produzione di un dispositivo per l'iniezione di cellule
   1. Progettazione generale del dispositivo: Preparare l'apparecchio mostrato nella Figura 1. Questo sistema è combinato con un apparato di raffreddamento a siringa e un apparato di iniezione principale.
   2. Preparare l'apparecchiatura di iniezione principale descritta di seguito:
      1. Per un'iniezione di palline cardiomiocitarie neonatali, utilizzare un ago da 29 G, lungo 50 mm, dotato di siringa.
      2. Collegare una siringa a trasferimento di potenza (18G, 1 mL) schiena contro schiena utilizzando una siringa per iniezione cellulare (Figura 1). Collegare l'ago della siringa di trasferimento di potenza a un sottile tubo di polipropilene con bassa espandibilità del lume.
      3. Quindi, collegare l'altro lato del tubo di trasferimento dell'alimentazione all'ago della stessa siringa (18G, 1 mL) e inserirlo in una pompa a siringa. Riempire le due siringhe e i tubi di trasferimento di potenza con acqua senza bolle d'aria.
         NOTA: Quando uno stantuffo della siringa di trasferimento di potenza viene inserito, la pressione viene trasferita direttamente all'altra siringa e lo stantuffo sporge.
   3. Configurare il sistema di raffreddamento della siringa di iniezione come descritto di seguito.
      1. Avvolgere saldamente un tubo di rame (diametro esterno = 1 mm; diametro interno = 0,3 mm; spessore = 0,35 mm) attorno alla parte contenente la cellula della siringa per iniezione cellulare, lasciando 10 mm di tubo in eccesso ad entrambe le estremità.
      2. Collegare il tubo di rame al tubo di plastica flessibile. Inoltre, collegare le altre estremità del tubo di plastica a una pompa esterna, riempire la linea con acqua di raffreddamento e raffreddare l'acqua immergendo il tubo di rame in eccesso nel ghiaccio tritato (Figura 1).
         NOTA: Questo sistema di raffreddamento mantiene la soluzione di sospensione delle celle nel cilindro a circa 2 °C.

3. Sviluppo di un modello di infarto miocardico di ratto mediante occlusione coronaria ottusa

1. Anestetizzare ratti nudi maschi immunodeficienti (F344/Njcl-rnu/rnu) con aria contenente il 3% di isoflurano. Inserire una cannula nella trachea e collegarla al respiratore.
2. Collegare una cannula a un vaporizzatore di isoflurano con un controller per mantenere una concentrazione di isoflurano del 3% e, quindi, sostenere un'anestesia sufficiente. Confermare l'assenza di risposta agli stimoli dolorosi. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza.
3. Fissare gli arti con nastri chirurgici tagliati su una placca chirurgica riscaldata a 40 °C. Ruota il corpo del ratto a destra dell'asse del corpo e usa l'ascella sinistra come campo chirurgico.
4. Rimuovere i peli nel campo chirurgico utilizzando una crema depilatoria e pulire la pelle con iodio povidone. Usando delle forbici affilate, taglia un'incisione di 1,5 cm nella pelle e nel muscolo grande pettorale.
5. Confermare il terzo spazio intercostale e strappare i muscoli intercostali e la pleura costale utilizzando micro pinze con punte smussate. Tenere il torace aperto utilizzando un divaricatore. Rimuovere delicatamente il pericardio sottile con una pinza.
6. Per costruire un modello di infarto della parete laterale del cuore, trovare la posizione caudale di 1 mm rispetto alla punta dell'atrio sinistro per identificare l'arteria coronaria ottusa, passare una sutura di seta 7-0, raccogliere il tessuto largo 2,5 mm e profondo 2,5 mm dalla dorsale alla ventrale e legare saldamente il tessuto.
7. Confermare l'avvenuta legatura dalla debole contrazione distale dalla legatura. Dopo aver rimosso delicatamente il divaricatore, posizionare una sutura di seta 5-0 tra il secondo e il quarto spazio intercostale e chiudere la toracotomia.
8. Diminuire la concentrazione di isoflurano all'1%. Suturare delicatamente il muscolo e la pelle con seta 5-0. Ridurre la concentrazione di isoflurano allo 0% e attendere circa 5 minuti fino all'inizio della respirazione spontanea.
9. Applicare localmente 2 mg/mL di lidocaina in soluzione fisiologica sull'incisione. Somministrare 1 mL di soluzione fisiologica tramite iniezione sottocutanea. Applicare l'unguento veterinario per via topica per prevenire le infezioni.
10. Rimuovere il ratto dal tubo di intubazione e tornare nella gabbia dell'animale; Quindi, alleva i ratti in gabbie individuali per 1 settimana.
11. Analizzare i cambiamenti nella funzione della pompa sistolica cardiaca utilizzando l'ecocardiografia.
    NOTA: La funzione cardiaca sarà ridotta a causa dell'infarto miocardico laterale.

4. Trapianto di cellule percutanee ecoguidate con il metodo dell'iniezione lenta

1. Preriscaldare il brodo di gelatina al 10% a 37 °C fino a quando non diventa liquido.
2. Diluire il brodo di gelatina al 10% con un tampone Ads preriscaldato per ottenere la soluzione finale iniettabile di gelatina al 5% p/v (sono necessari 100 μL per animale).
3. Sospendere 96 sfere di cardiomiociti (totale: 28.800 cardiomiociti/animale) in 100 μL di soluzione iniettabile preriscaldata.
4. Caricare la sospensione preparata al punto 4.3 nella siringa per iniezione cellulare, evitando l'aspirazione dell'aria in eccesso.
5. Per eliminare le bolle nella siringa, tenerla verticalmente con l'ago rivolto verso l'alto, picchiettare la siringa e raccogliere eventuali bolle sulla cresta superiore della siringa.
   NOTA: Durante questa fase, osservare le sfere di cardiomiociti che si depositano gradualmente sulla guarnizione in gomma dello stantuffo.
6. Mantenere la posizione verticale della siringa, spingere lentamente verso l'alto lo stantuffo ed eliminare le bolle e la soluzione di sospensione cellulare in eccesso fino a quando 20 μL della sospensione cellulare rimangono nella siringa. Spingere con cautela lo stantuffo a velocità costante in modo che la sfera cardiomiocitaria rimanga appoggiata sulla guarnizione in gomma dello stantuffo.
7. Immergere la siringa con tappo direttamente in un bagno di ghiaccio per 5 minuti.
8. Inserire una siringa raffreddata nell'apparecchio per l'iniezione. Fissare saldamente l'apparato della siringa per iniezione depositato su un dispositivo di movimento fine sullo stadio animale utilizzando un morsetto fatto a mano regolabile in posizione X-Y-Z. Il dispositivo di movimento fine può spostare la posizione dell'ago utilizzando il cursore da 20 mm in direzione x, l'oscillazione in direzione y e i movimenti di inchino in direzione z.
9. Anestetizzare i ratti in una scatola sigillata riempita con aria contenente il 3% di isoflurano. Confermare l'anestesia senza rispondere agli stimoli dolorosi. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza.
10. Fissare gli arti con nastri chirurgici tagliati su una piastra ecografica riscaldata a 40 °C. Per sostenere un'anestesia sufficiente, assicurarsi che l'aria inalata contenga una concentrazione di circa il 3% di isoflurano.
11. Rimuovere i peli sul campo di iniezione (2 cm di diametro) e sul petto con una crema depilatoria e pulire la pelle con iodio povidone.
12. Applicare l'eco-gel sul petto e sulla sonda eco. Posizionare la sonda ecografica vicino al torace lungo gli assi craniale e caudale e iniziare a ottenere l'ecocardiografia B-mode seguendo il manuale del produttore.
13. Far avanzare la punta dell'ago per iniezione nel miocardio nella vista frontale (Figura 2 e video supplementare 1).
14. Per attivare la pompa a siringa principale, premere il pulsante Start e ruotare la manopola per regolare un numero predeterminato per una velocità di iniezione di circa 0,02 μL/s. Applicare l'unguento veterinario localmente intorno alla posizione di agugliatura per prevenire le infezioni.
    NOTA: È necessario determinare il numero di selezione appropriato per la velocità di iniezione prevista utilizzando una soluzione di iniezione. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago per iniezione utilizzando un sistema di movimento esemplare.
15. Ridurre la concentrazione di isoflurano allo 0% e attendere circa 5 minuti fino a quando l'animale riacquista una coscienza sufficiente per mantenere il decubito sternale.

5. Valutazione della funzione cardiaca

1. Anestetizzare i ratti in una scatola sigillata riempita con aria contenente il 3% di isoflurano. Confermare l'anestesia senza rispondere agli stimoli dolorosi. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza.
2. Applicare una crema elettrizzante per l'acquisizione dell'ECG sulle punte degli arti. Fissare gli arti con nastri chirurgici tagliati su una piastra ecografica riscaldata a 40 °C. Utilizza un sistema di monitoraggio fisiologico per rilevare l'ECG e la frequenza cardiaca in tempo reale.
3. Secondo le istruzioni del produttore, determinare prima l'angolo dell'asse lungo utilizzando l'immagine dell'eco in modalità B che mostra l'apice ventricolare sinistro al tratto di deflusso, quindi ruotare l'ecosonda di 90° per passare alla vista dell'asse corto.
4. Utilizzando solo il sistema di movimento fine dell'asse caudale e rostrale dello stadio animale, regolare la vista dell'asse corto a livello del muscolo papillare. Quindi, modificare la modalità immagine in modalità M premendo il pulsante della modalità M e registrare un video per 5 secondi premendo il pulsante Cine-loop .
5. Per analizzare e calcolare l'accorciamento della frazione utilizzando il software, premere il pulsante Misura e uno strumento di linea verticale per definire le dimensioni interne del ventricolo sinistro end-sistolico e telediastolico. Il software calcola automaticamente l'accorciamento della frazione percentuale (FS).
6. Ridurre la concentrazione di isoflurano allo 0% e attendere circa 5 minuti fino a quando l'animale riacquista una coscienza sufficiente per mantenere il decubito sternale.

6. Immunoistochimica

1. Fissare il corpo sottoposto a eutanasia (eseguire l'eutanasia come al punto 1.1.3) sul tavolo utilizzando i nastri chirurgici tagliati, asportare i cuori, lavare con PBS e immergere il cuore in paraformaldeide/PBS al 4%.
2. Sezionare i cuori in tre sezioni, immergerli in saccarosio al 40% per la crioprotezione, incorporarli in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelarli a -80 °C.
3. Fissare i tessuti criosezionati (8 μm di spessore) a vetrini rivestiti di aminosilano. Dopo un'asciugatura sufficiente utilizzando il vento non riscaldato generato da un asciugacapelli generico, immergere i vetrini in soluzione salina tamponata tris contenente lo 0,2% di Tween-20 (TBS-T).
4. Immergerli in una soluzione bloccante per 30 minuti a 25 °C. Versare 100 μL della soluzione bloccante contenente anticorpi primari sul vetrino e incubare per una notte a 4 °C con sigillante di paraffina per mantenere la soluzione anticorpale distribuita sul tessuto.
   NOTA: La concentrazione di anticorpi è indicata nella tabella dei materiali.
5. Appoggia i vetrini orizzontalmente in una scatola ad alta umidità fatta a mano utilizzando il vapore naturale della carta bagnata per evitare l'evaporazione. Lavare i vetrini tre volte con TBS-T.
6. Trattare con l'agente bloccante contenente anticorpi secondari per 1 ora a 25 °C allo stesso modo dell'anticorpo primario. Dopo tre lavaggi, osservare i segnali di fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza e un microscopio laser confocale.
   NOTA: La concentrazione di anticorpi è indicata nella tabella dei materiali.
7. Analisi statistica: per il confronto del volume cellulare, come mostrato nella Figura 3A, eseguire un test t non accoppiato; per valutare il recupero funzionale cardiaco dopo la somministrazione di cardiomiociti con il metodo dell'iniezione lenta, come mostrato nella Figura 4A, utilizzare un test t accoppiato. In questo lavoro, le differenze sono state considerate statisticamente significative a P < 0,01. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard.

Discussione

Uno dei punti critici per il successo del metodo di iniezione lenta è la preparazione di un sistema di iniezione efficace che utilizza una potente pompa a siringa e un robusto tubo di trasferimento della pressione. È necessario un sistema ad alta pressione per spingere il gel fuori dalla punta di un ago sottile. Il secondo punto critico è la stabilizzazione del cuore. Il battito del cuore contro un ago per iniezione avanzato nel miocardio può danneggiare il tessuto. In questo studio, è stata condotta un'iniezione ecoguidata per evitare che gli animali subissero una seconda lesione toracica aperta e per somministrare l'iniezione di cellule in un cuore stabilizzato con i polmoni gonfiati. Inoltre, in alcune applicazioni per animali di grandi dimensioni o per l'uomo, alcuni dispositivi di iniezione attaccati al cuore dovrebbero essere considerati come parte della progettazione strategica dell'applicazione. Per le iniezioni a torace aperto nel cuore di piccoli animali, si raccomanda l'uso di un ago lungo e flessibile data la loro frequenza cardiaca più elevata.

In questo lavoro, il metodo di iniezione lenta ha aumentato significativamente il volume dei cardiomiociti sopravvissuti rispetto al normale metodo di iniezione. L'iniezione normale provoca danni cellulari attraverso lo sforzo di taglio¹⁵. Al contrario, il metodo dell'iniezione lenta non causa teoricamente tale stress perché utilizza una soluzione non newtoniana in aggiunta all'iniezione lenta.

In termini di fibrosi locale, lo spazio interstiziale intorno ai cardiomiociti sopravvissuti normalmente iniettati ha mostrato una forte e diffusa deposizione di collagene di tipo I. Al contrario, i segnali di collagene di tipo I intorno ai cardiomiociti innestati con il metodo dell'iniezione lenta erano molto più deboli e più limitati. Ciò suggerisce che il metodo di iniezione lenta ha causato danni significativamente inferiori. L'iniezione lenta di cardiomiociti neonatali nel miocardio adulto ha migliorato significativamente la funzione contrattile del cuore infartuato. Le analisi istologiche hanno suggerito che l'innesto dei cardiomiociti con il metodo dell'iniezione lenta ha portato a connessioni dirette e accoppiamento funzionale con i cardiomiociti ospiti. Questo fenomeno spiega il meccanismo di recupero funzionale del miocardio ospite. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima segnalazione di cardiomiociti neonatali trapiantati con connessioni senza soluzione di continuità su larga scala ai cardiomiociti adulti ospiti. Le connessioni funzionali con il miocardio ospite tramite accoppiamento elettrico e meccanico possono far maturare i cardiomiociti innestati e consentire loro di agire come miociti funzionali che contribuiscono alla funzione cardiaca dell'ospite. Le interazioni di forza fisica a lungo termine tra l'ospite e i cardiomiociti del trapianto sono cruciali per la piena maturazione. Pertanto, potrebbero essere necessari 2 mesi dopo l'iniezione per il recupero funzionale del cuore infartuato. Il recupero dipendente dal tempo della funzione cardiaca del paziente può essere un fenomeno atteso nelle applicazioni terapeutiche, e questo può essere un segno distintivo del successo dell'accoppiamento funzionale de novo e dell'integrazione tra l'ospite e i cardiomiociti trapiantati.

Il metodo di iniezione lenta può essere eseguito durante la chirurgia a torace aperto. Inoltre, questo metodo può essere applicato ai topi. Per le future applicazioni nella terapia umana, dobbiamo ancora risolvere diversi problemi. La velocità di iniezione deve essere ottimizzata considerando la capacità tampone del flusso di fluido interstiziale in ciascun organo bersaglio umano. Dovrebbero essere applicati materiali privi di xeno, come la gelatina umana o materiali sintetici biodegradabili. Dovrebbero essere sviluppati apparecchi clinici per iniezione lenta di grado GMP, come strumenti monouso compatti specifici per organo o apparecchi riutilizzabili applicabili a grandi organi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needle & tuberculin, 1 mL	Terumo	NN1838R, SS-01T
29-gauge 50 mm-long needle	Ito Corporation, Tokyo, Japan	14903 Type-A
A copper tube	General Suppliers		outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm
Ads Buffer	Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan		Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35
alpha-MEM	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	051-07615
Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L)	Proteintech	14695-1-AP	using dilution 1:100
Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L)	Sigma Aldrich	C6219	using dilution 1:100
Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206	using dilution 1:300
blocking solution (Blocking One)	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	03953-95
collagenase	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	034-22363
confocal laser microscope	Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany	LSM510 META
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
FACS Aria III	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA
fetal bovine serum	BioWest, FL, USA	S1820-500
fine movement device (Micromanipulator)	Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan	M-44
fluorescence microscope	Nikon Instruments, Tokyo, Japan	Eclipse Ti2
gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	G9382	dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it
Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats	Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan		0–2 d after birth
non-adhesive 96-well plates (spheloid plate)	Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan	MS-0096S
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA	Tissue-Tek OCT compound
peristaltic pump (for cooling system)	As One Co., Osaka, Japan	SMP-23AS
PKH26	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2	Chemglass life sciences LLC, NJ, USA	CG-2003-120
syringe	Ito Corporation, Tokyo, Japan	MS-N25
syringe pump with remote controller	As One Co., Osaka, Japan	MR-1, CT-10
tetramethylrhodamine methyl ester	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	T668
trypsin	DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA	215240
Tween-20	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	167-11515
veterinarian ointment	Fujita Pharmaceutical Co., Ltd.	Hibikusu ointment  #WAK-95832
Vevo 2100 Imaging System	Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada	Vevo 2100
Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0	Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada	Vevo 2100
Weakly curved needle with ophthalmic thread	Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan	C7-70