דיסקציה ובידוד של רקמת ריאה דה-צלולרית ספציפית לאזור

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד רקמת ריאה אזורית דה-צלולרית. פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה לחקר מורכבויות באינטראקציות מטריצה חוץ-תאית ומטריצת תאים.

Abstract

השתלת ריאות היא לרוב האפשרות היחידה לחולים בשלבים מאוחרים יותר של מחלת ריאות קשה, אך זו מוגבלת הן בשל אספקת ריאות מתאימות מתורם והן בדחייה חריפה וכרונית לאחר ההשתלה. בירור גישות ביו-הנדסיות חדשניות להחלפת ריאות חולות הוא הכרחי לשיפור הישרדות המטופלים ולמניעת סיבוכים הקשורים למתודולוגיות ההשתלה הנוכחיות. גישה חלופית כוללת שימוש בריאות שלמות דה-תאיות חסרות מרכיבים תאיים שהם בדרך כלל הגורם לדחייה חריפה וכרונית. מכיוון שהריאה היא איבר כה מורכב, מעניין לבחון את מרכיבי המטריקס החוץ תאיים של אזורים ספציפיים, כולל כלי הדם, דרכי הנשימה והרקמה הנאדית. מטרת גישה זו היא לבסס שיטות פשוטות וניתנות לשחזור שבאמצעותן חוקרים יכולים לנתח ולבודד רקמות ספציפיות לאזור מריאות שאינן סלולריות במלואן. הפרוטוקול הנוכחי פותח עבור חזירים וריאות אנושיות, אך עשוי להיות מיושם גם על מינים אחרים. עבור פרוטוקול זה צוינו ארבעה אזורים ברקמה: דרכי הנשימה, כלי הדם, הנאדיות ורקמת הריאה בתפזורת. הליך זה מאפשר רכישת דגימות של רקמה המייצגות בצורה מדויקת יותר את תוכן רקמת הריאה הדה-צלולרית בניגוד לשיטות ניתוח מסורתיות בתפזורת.

Introduction

מחלות ריאה, כולל מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) וסיסטיק פיברוזיס (CF), נותרות כיום ללא תרופה 1,2,3,4. השתלת ריאות היא לעתים קרובות האפשרות היחידה עבור חולים בשלבים מאוחרים יותר, אולם זו נותרה אפשרות מוגבלת הן בשל אספקת ריאות תורם מתאימות והן דחייה חריפה וכרונית לאחר ההשתלה ^3,5,6. ככזה, יש צורך קריטי באסטרטגיות טיפול חדשות. גישה מבטיחה אחת בביו-הנדסה נשימתית היא יישום של פיגומים שמקורם ברקמות, שהוכנו מרקמת ריאה טבעית שעברה דה-צלולריזציה. מכיוון שפיגומי ריאה שלמים אצלולריים שומרים על חלק ניכר מהמורכבות של הרכב המטריצה החוץ-תאית הטבעית (ECM) והפעילות הביולוגית, הם נחקרו באופן אינטנסיבי עבור הנדסת איברים שלמים וכמודלים משופרים לחקר מנגנוני מחלות ריאה 7,8,9,10. במקביל, יש עניין גובר בשימוש ברקמות דה-תאיות מאיברים שונים, כולל ריאות, כהידרוג'לים ומצעים אחרים לחקר אינטראקציות תא-תא ו-ECM של תאים במודלים של תרביות אורגנואידים ורקמות אחרות 11,12,13,14,15,16,17. אלה מספקים מודלים רלוונטיים יותר מאשר מצעים זמינים מסחרית, כגון Matrigel, שמקורם במקורות סרטניים. עם זאת, המידע על הידרוג'לים שמקורם בריאה אנושית מוגבל יחסית כיום. תיארנו בעבר הידרוג'לים שמקורם בריאות חזיר decellularized ואפיינו הן את התכונות המכניות והן את התכונות החומריות שלהם, כמו גם הדגמנו את התועלת שלהם כמודלים של תרביות תאים^18,19. דו"ח שפורסם לאחרונה פירט את האפיון המכאני והויסקו-אלסטי הראשוני של הידרוג'לים שמקורם בריאות אנושיות נורמליות וחולות (COPD, IPF)²⁰. כמו כן, הצגנו נתונים ראשוניים המאפיינים את תכולת הגליקוזאמינוגליקן של ריאות אנושיות תקינות ו- COPD דה-צלולריות, כמו גם את יישומם לחקר אינטראקציות תא-תא ו-ECM^{של תאים 11}.

דוגמאות אלה ממחישות את הכוח של שימוש באק"מ ריאה אנושית דה-צלולרית למטרות חקירה. עם זאת, הריאה היא איבר מורכב, והן המבנה והתפקוד משתנים באזורים שונים של הריאה, כולל הרכב ECM ותכונות אחרות כגון נוקשות^21,22. ככזה, זה מעניין לחקור את ECM באזורים בודדים של הריאה, כולל קנה הנשימה ודרכי נשימה גדולות, דרכי נשימה בינוניות וקטנות, נאדיות, כמו גם כלי דם גדולים, בינוניים, קטנים. לשם כך, פיתחנו שיטה אמינה וניתנת לשחזור לניתוח ריאות אנושיות וחזירות שעברו דה-צלולריזציה, ולאחר מכן בידוד כל אחד מהאזורים האנטומיים הללו. זה איפשר ניתוח דיפרנציאלי מפורט של תכולת חלבון אזורית הן בריאות נורמליות והן בריאות חולות²¹.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם ל- IACUC של אוניברסיטת ורמונט (UVM). כל הריאות האנושיות נרכשו משירותי נתיחת UVM ומחקרים קשורים בוצעו בהתאם להנחיות IRB של UVM.

הערה: דה-צלולריזציה של חזירים וריאות אנושיות תוארה בעבר על ידי הקבוצה שלנו 7,8,9,10,21. בקצרה, אונות ריאה שלמות עוברות דה-צלולריזציה באמצעות זילוח רציף של דרכי הנשימה וכלי הדם עם סדרה של 2 ליטר חומרי ניקוי ותמיסות אנזימים באמצעות משאבה פריסטלטית: 0.1% Triton-X 100, 2% נתרן דאוקסיכולאט, 1 M נתרן כלורי, 30 מיקרוגרם / מ"ל DNase / 1.3 mM MgSO 4/2 mM CaCl₂, 0.1% חומצה פראצטית/₄% אתנול, ושטיפת מים נטולת יונים. שיטות סטנדרטיות לאישור דה-צלולריזציה יעילה כוללות קביעה של <50 ננוגרם/מ"ג DNA דו-גדילי בתוך ריאות דה-צלולריות והיעדר מקטעי DNA על ידי אלקטרופורזה בג'ל, וצביעה גרעינית על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) ^9,21.

1. הגדרה

1. אספו את כל הציוד הדרוש להליך הנתיחה, כולל תבשיל זכוכית, שני זוגות פינצטה כירורגית, זוג מלקחיים אחד וזוג מספריים כירורגיים, ואוטוקלאבה לפני השימוש.
2. השג קטע מהריאה, מקם אותו בצלחת תבשיל הזכוכית, וכוון אותו כך שניתן יהיה לראות בבירור את הקצה העליון של נתיב האוויר.
3. זהה את הקצה הפרוקסימלי של כלי הדם ושמור אותו שלם עד שלבים מאוחרים יותר. קצה כלי הדם צריך להיות גלוי בבירור ובצבע לבן אטום לחלוטין.
4. בעזרת זוג פינצטה ומספריים כירורגיים, הסירו כל צדר שעשוי להיות רירית את החלק החיצוני של הריאה והשליכו.

2. חשיפת דרכי הנשימה

1. באמצעות טכניקת פיזור עם מספריים כירורגיים, לעבוד בעדינות כדי לחשוף את נתיב האוויר הנוסף.
   1. אתר את נתיב האוויר הגדול ביותר, אשר בדרך כלל יהיה בקוטר של כ 2-4 ס"מ. דרך נוספת לזהות נתיב אוויר היא באמצעות תצפית של טבעות סחוס, אשר ניתן לזהות חזותית או באמצעות מישוש של הרקמה.
   2. באמצעות זוג מלקחיים, מישוש לאורך נתיב האוויר על מנת לקבוע את מיקומו של נתיב האוויר הבלתי נראה לעומק של כ -1 אינץ '.
      הערה: בהיותו מרופד בטבעות סחוס, נתיב האוויר קשה יותר באופן אופייני מרקמות הריאה האחרות. ככזה, מציאת ומישוש נתיב האוויר הבלתי נראה צריך להיות פשוט יחסית.
   3. מחזיקים את המספריים הכירורגיים במקביל לנתיב האוויר, מכניסים את הקצוות הסגורים לתוך הרקמה המקיפה ישירות את נתיב האוויר הבלתי נראה.
   4. פתחו באיטיות את המספריים הכירורגיים כדי לפרק בעדינות את הקרום שמסביב. לאחר מכן, הסירו את המספריים הכירורגיים והימנעו מחיתוך רקמה כלשהי.
   5. חזור על תהליך זה לסירוגין לאורך הליך הדיסקציה כדי להמשיך לחשוף את נתיב האוויר.
2. בעזרת המספריים הכירורגיים, חותכים את נתיב האוויר בנקודות ההסתעפות ומנתחים לאורך כל ענף בנפרד.
   הערה: נקודת הסתעפות היא מיקום שבו נתיב אוויר אחד מתפצל לשני נתיבי אוויר נפרדים.
3. אזורים מנותקים של נתיב האוויר ברגע בטוחים כי הקצוות השלמים יישארו ניתנים לזיהוי וממוקמים בקלות לדיסקציה נוספת.
4. מניחים אזורים קטועים של נתיב האוויר לתוך הצינור המתאים. גודל האזורים המנותקים ישתנה בהתאם לדגימה, אך באופן כללי, ינוע בין 1-5 ס"מ אורך. הרוחב משתנה בהתאם למיקום היחסי לאורך עץ דרכי הנשימה, כאשר האזורים הדיסטליים שומרים על רוחב קטן יותר מהאזורים הקרובים יותר.

3. חשיפה וכריתה של אזורים של כלי הדם

1. הפעילו לחץ עדין על כלי הדם והתרחקו לאט מדרכי הנשימה. אפשרו לכלי הדם להימתח מעט והשתמשו במספריים כירורגיים כדי להפריד עוד יותר את כלי הדם מדרכי הנשימה.
   הערה: לחץ רב מדי יקרע את כלי הדם. אם כלי הדם נקרע, פשוט מקם את החלק הזה של כלי הדם בצינור המסומן המתאים וזהה את קצהו השלם.
2. כאשר נחשפה נקודת הסתעפות בעץ כלי הדם, השתמש במספריים כירורגיים ובפינצטה כדי לחשוף אזורים נחותים יותר של כלי הדם.
   1. התחל על ידי החדרת הקצוות הסגורים של המספריים הכירורגיים ממש מתחת לנקודת הסתעפות ובין שני אזורי כלי הדם המתאימים.
   2. פתחו לאט את המספריים כדי לפזר את הרקמות שמתחתיהן.
   3. לסירוגין, השתמש בזוג פינצטה כדי להסיר את הרקמה שהתפשטה באמצעות מספריים כירורגיים, כמו גם כל רקמה אחרת המקיפה ישירות את כלי הדם.
3. כאשר כלי הדם מכסים אזורים בדרכי הנשימה או הופכים מסורבלים לשלב כלשהו בהליך הדיסקציה, חתכו את כלי הדם בנקודת הסתעפות ונתחו הלאה לאורך כל אחד מהענפים בנפרד.
4. אזורים מנותקים של כלי הדם פעם בטוחים כי הקצוות השלמים יישארו ניתנים לזיהוי וממוקמים בקלות לדיסקציה נוספת.

4. זיהוי וכריתה של רקמת מכתשית

1. בעזרת זוג מלקחיים או פינצטה, צבטו ולאחר מכן קרעו בעדינות אזורים קטנים של רקמת הנאדיות.
   1. אתר אזור של רקמה שאינו נמצא בסביבה הישירה של נתיב האוויר או כלי הדם.
   2. בעזרת הפינצטה, צבטו אזור קטן ברקמה שנראה נטול כלי דם או דרכי נשימה.
   3. לקרוע את האזור הצבוט של הרקמה מן הריאה.
2. התבונן באזור הרקמה שהוסרה ואשר אם היא רקמת מכתשית או לא.
   הערה: רקמת מכתשית קיימת בכל רחבי הריאה, ולכן ניתן וצריך להסיר אותה לאורך הליך הדיסקציה. כל רקמה שלא ניתן לזהות בקלות כנאדיות, כלי דם או דרכי נשימה צריכה להיות מסווגת כרקמה בתפזורת וממוקמת בצינור המסומן המתאים.

תוצאות

סכמה כוללת של הפרוטוקול מתוארת באיור 1. לאחר שליטה, דיסקציה אזורית של רקמת ריאה decellularized ניתן לשחזר בקלות. קביעת הסיווג של כל דגימת רקמה קטועה היא הכרחית להצלחת הליך הדיסקציה. רקמת כלי הדם היא אלסטית יותר באופן משמעותי מדרכי הנשימה, ולכן שימוש במלקחיים כדי למתוח את הרקמה הוא ...

Discussion

רקמות דה-תאיות מבני אדם וממינים אחרים משמשות לעתים קרובות כביו-חומרים לחקר הרכב ECM וכן אינטראקציות תא-ECM במודלים של תרביות ex vivo, כולל הידרוג'לים תלת-ממדיים^12,13. בדומה לאיברים אחרים, ריאות דה-תאיות שימשו בעבר לקביעת הבדלים בהרכב ECM בריאות לעומת חולות (כלומר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10