Dissezione e isolamento del tessuto polmonare decellularizzato specifico per regione

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per l'isolamento del tessuto polmonare decellularizzato regionale. Questo protocollo fornisce un potente strumento per studiare le complessità nella matrice extracellulare e nelle interazioni cellula-matrice.

Abstract

Il trapianto di polmone è spesso l'unica opzione per i pazienti nelle fasi successive di una grave malattia polmonare, ma questo è limitato sia a causa della fornitura di polmoni donatori idonei che del rigetto acuto e cronico dopo il trapianto. Accertare nuovi approcci di bioingegneria per la sostituzione dei polmoni malati è fondamentale per migliorare la sopravvivenza dei pazienti ed evitare complicazioni associate alle attuali metodologie di trapianto. Un approccio alternativo prevede l'uso di polmoni interi decellularizzati privi di costituenti cellulari che sono tipicamente la causa del rigetto acuto e cronico. Poiché il polmone è un organo così complesso, è interessante esaminare i componenti della matrice extracellulare di regioni specifiche, tra cui la vascolarizzazione, le vie aeree e il tessuto alveolare. Lo scopo di questo approccio è quello di stabilire metodi semplici e riproducibili con cui i ricercatori possono sezionare e isolare il tessuto specifico della regione da polmoni completamente decellularizzati. L'attuale protocollo è stato concepito per i polmoni suini e umani, ma può essere applicato anche ad altre specie. Per questo protocollo, sono state specificate quattro regioni del tessuto: vie aeree, vascolarizzazione, alveoli e tessuto polmonare bulk. Questa procedura consente l'approvvigionamento di campioni di tessuto che rappresentano in modo più accurato il contenuto del tessuto polmonare decellularizzato rispetto ai tradizionali metodi di analisi di massa.

Introduzione

Le malattie polmonari, tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) e la fibrosi cistica (FC), rimangono attualmente senza cura 1,2,3,4. Il trapianto di polmone è spesso l'unica opzione per i pazienti nelle fasi successive, tuttavia questa rimane un'opzione limitata sia a causa della fornitura di polmoni donatori idonei che del rigetto sia acuto che cronico dopo il trapianto ^3,5,6. Come tale, c'è un bisogno critico di nuove strategie di trattamento. Un approccio promettente nella bioingegneria respiratoria è l'applicazione di scaffold derivati dai tessuti preparati da tessuto polmonare nativo decellularizzato. Poiché gli scaffold polmonari interi acellulari conservano gran parte della complessità della composizione e della bioattività della matrice extracellulare nativa (ECM), sono stati intensamente studiati per l'ingegneria dell'intero organo e come modelli migliorati per lo studio dei meccanismi delle malattie polmonari 7,8,9,10. Parallelamente, vi è un crescente interesse nell'utilizzo di tessuti decellularizzati provenienti da diversi organi, compresi i polmoni, come idrogel e altri substrati per lo studio delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM in modelli organoidi e altri tessuti di coltura 11,12,13,14,15,16,17 . Questi forniscono modelli più rilevanti rispetto ai substrati disponibili in commercio, come Matrigel, derivati da fonti tumorali. Tuttavia, le informazioni sugli idrogel derivati dai polmoni umani sono attualmente relativamente limitate. Abbiamo precedentemente descritto idrogel derivati da polmoni di maiale decellularizzati e abbiamo caratterizzato sia le loro proprietà meccaniche che materiali, oltre a dimostrare la loro utilità come modelli di coltura cellulare^18,19. Un recente rapporto ha dettagliato la caratterizzazione meccanica e viscoelastica iniziale di idrogel derivati da polmoni umani decellularizzati normali e malati (BPCO, IPF)²⁰. Abbiamo anche presentato i primi dati che caratterizzano il contenuto di glicosaminoglicani nei polmoni umani decellularizzati normali e BPCO, nonché la loro applicabilità per lo studio delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM¹¹.

Questi esempi illustrano il potere dell'utilizzo di ECM polmonari umani decellularizzati per scopi investigativi. Tuttavia, il polmone è un organo complesso e sia la struttura che la funzione variano in diverse regioni del polmone, compresa la composizione della ECM e altre proprietà come la rigidità^21,22. Come tale, è di interesse studiare la ECM in singole regioni del polmone, tra cui la trachea e le grandi vie aeree, le vie aeree di medie e piccole dimensioni e gli alveoli, nonché i vasi sanguigni grandi, di medie e piccole dimensioni. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo affidabile e riproducibile per sezionare polmoni umani e suini decellularizzati e successivamente isolare ciascuna di queste regioni anatomiche. Ciò ha permesso un'analisi differenziale dettagliata del contenuto proteico regionale sia nei polmoni normali che in quelli malati²¹.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la IACUC dell'Università del Vermont (UVM). Tutti i polmoni umani sono stati acquisiti dai servizi di autopsia UVM e gli studi correlati sono stati eseguiti secondo le linee guida dell'IRB dell'UVM.

NOTA: La decellularizzazione dei polmoni suini e umani è stata precedentemente descritta dal nostro gruppo 7,8,9,10,21. In breve, i lobi polmonari interi vengono decellularizzati attraverso la perfusione sequenziale delle vie aeree e vascolarizzanti con una serie di 2 L di detergente e soluzioni enzimatiche utilizzando una pompa peristaltica: 0,1% Triton-X 100, 2% desossicolato di sodio, 1 M cloruro di sodio, 30 μg/mL DNasi/1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl₂, 0,1% acido peracetico/₄% etanolo, e un lavaggio con acqua deionizzata. I metodi standard per confermare la decellularizzazione efficiente includono la determinazione del DNA residuo a doppio filamento di <50 ng/mg all'interno dei polmoni decellularizzati e l'assenza di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel e la colorazione nucleare con ematossilina ed eosina (H & E) ^9,21.

1. Configurazione

1. Raccogliere tutte le attrezzature necessarie necessarie per la procedura di dissezione, tra cui una casseruola di vetro, due paia di pinzette chirurgiche, un paio di pinze e un paio di forbici chirurgiche e autoclave prima dell'uso.
2. Ottenere una sezione del polmone, posizionarlo nella casseruola di vetro e orientarlo in modo che l'estremità superiore delle vie aeree possa essere vista chiaramente.
3. Identificare l'estremità prossimale della vascolarizzazione e mantenerla intatta fino ai passaggi successivi. La fine della vascolarizzazione dovrebbe essere chiaramente visibile e di colore bianco completamente opaco.
4. Utilizzando un paio di pinzette e forbici chirurgiche, rimuovere qualsiasi pleura che potrebbe rivestire l'esterno del polmone e scartare.

2. Esposizione delle vie aeree

1. Utilizzando una tecnica di diffusione con le forbici chirurgiche, lavorare delicatamente per esporre le vie aeree aggiuntive.
   1. Individuare le vie aeree più grandi, che in genere avranno un diametro di circa 2-4 cm. Un altro modo per identificare una via aerea è attraverso l'osservazione degli anelli della cartilagine, che possono essere rilevati visivamente o tramite palpazione del tessuto.
   2. Utilizzando un paio di pinze, palpare lungo la lunghezza delle vie aeree per determinare la posizione delle vie aeree invisibili a una profondità di circa 1 pollice.
      NOTA: Essendo rivestite con anelli di cartilagine, le vie aeree sono tipicamente più dure rispetto agli altri tessuti polmonari. Pertanto, trovare e palpare le vie aeree invisibili dovrebbe essere relativamente semplice.
   3. Tenendo le forbici chirurgiche parallele alle vie aeree, inserire le punte chiuse nel tessuto che circonda direttamente le vie aeree invisibili.
   4. Aprire lentamente le forbici chirurgiche per separare delicatamente la membrana circostante. Successivamente, rimuovere le forbici chirurgiche ed evitare di tagliare qualsiasi tessuto.
   5. Ripetere questo processo a intermittenza durante la procedura di dissezione per continuare a esporre le vie aeree.
2. Usando le forbici chirurgiche, tagliare le vie aeree nei punti di ramificazione e sezionare lungo entrambi i rami in modo indipendente.
   NOTA: Un punto di ramificazione è una posizione in cui una via aerea si divide in due vie aeree separate.
3. Recidere le regioni delle vie aeree una volta sicuri che le estremità intatte rimarranno identificabili e facilmente individuabili per un'ulteriore dissezione.
4. Posizionare le regioni recise delle vie aeree nel tubo corrispondente. La dimensione delle regioni recise varierà a seconda del campione ma, in generale, varierà tra 1-5 cm di lunghezza. La larghezza varia in base alla posizione relativa lungo l'albero delle vie aeree, con le regioni distali che mantengono larghezze inferiori rispetto alle regioni più prossimali.

3. Esposizione ed asporto delle regioni del sistema vascolare

1. Applicare una leggera pressione sulla vascolarizzazione e allontanarsi lentamente dalle vie aeree. Lasciare che la vascolarizzazione si allunghi leggermente e utilizzare le forbici chirurgiche per separare ulteriormente la vascolarizzazione dalle vie aeree.
   NOTA: Troppa pressione strapperà la vascolarizzazione. Se la vascolarizzazione si strappa, è sufficiente posizionare quella sezione di vascolarizzazione nel tubo etichettato corrispondente e identificare la sua estremità intatta.
2. Quando un punto di ramificazione nell'albero vascolare è stato esposto, utilizzare forbici chirurgiche e pinzette per esporre più regioni inferiori del sistema vascolare.
   1. Inizia inserendo le punte chiuse delle forbici chirurgiche appena sotto un punto di ramificazione e tra le due regioni vascolari corrispondenti.
   2. Apri lentamente le forbici per diffondere i tessuti sottostanti.
   3. A intermittenza, utilizzare un paio di pinzette per rimuovere il tessuto che è stato distanziato usando le forbici chirurgiche, così come qualsiasi altro tessuto che circonda direttamente la vascolarizzazione.
3. Quando la vascolarizzazione copre le regioni delle vie aeree o diventa ingombrante per qualsiasi fase della procedura di dissezione, tagliare la vascolarizzazione in un punto di ramificazione e sezionare ulteriormente lungo entrambi i rami in modo indipendente.
4. Recidere le regioni del sistema vascolare una volta sicure che le estremità intatte rimarranno identificabili e facilmente individuabili per un'ulteriore dissezione.

4. Identificazione e asporto del tessuto alveolare

1. Utilizzando un paio di pinze o pinzette, pizzicare e poi strappare delicatamente piccole regioni di tessuto alveolare.
   1. Individuare una regione di tessuto che non si trova nelle immediate vicinanze delle vie aeree o del sistema vascolare.
   2. Utilizzando le pinzette, pizzicare una piccola regione del tessuto che sembra essere priva di qualsiasi vascolarizzazione o via aerea.
   3. Strappare la regione pizzicata del tessuto dal polmone.
2. Osservare la regione del tessuto rimosso e confermare se si tratta o meno di tessuto alveolare.
   NOTA: Il tessuto alveolare è presente in tutto il polmone, quindi può e deve essere rimosso durante la procedura di dissezione. Qualsiasi tessuto che non può essere facilmente identificato come principalmente alveoli, vascolarizzazione o vie aeree deve essere classificato come tessuto sfuso e collocato nel tubo etichettato corrispondente.

Risultati

Uno schema generale del protocollo è illustrato nella Figura 1. Una volta padroneggiata, la dissezione regionale del tessuto polmonare decellularizzato è facilmente riproducibile. Determinare la categorizzazione di ciascun campione di tessuto reciso è indispensabile per il successo della procedura di dissezione. Il tessuto vascolare è sostanzialmente più elastico delle vie aeree, quindi l'uso di una pinza per allungare il tessuto è spesso un forte indicatore del fatto che un particolar...

Discussione

I tessuti decellularizzati provenienti dall'uomo e da altre specie sono frequentemente utilizzati come biomateriali per lo studio della composizione della ECM e delle interazioni cellula-ECM in modelli di coltura ex vivo, inclusi gli idrogel 3D^12,13. Analogamente ad altri organi, i polmoni decellularizzati sono stati precedentemente utilizzati per determinare le differenze di composizione della ECM nei polmoni sani rispetto a quelli malati (cioè enfisem...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10