Dissektion und Isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem Lungengewebe

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von regional dezellularisiertem Lungengewebe vorgestellt. Dieses Protokoll bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Komplexitäten in der extrazellulären Matrix und Zell-Matrix-Interaktionen.

Zusammenfassung

Die Lungentransplantation ist oft die einzige Option für Patienten in den späteren Stadien einer schweren Lungenerkrankung, die jedoch sowohl durch die Versorgung mit geeigneten Spenderlungen als auch durch die akute und chronische Abstoßung nach der Transplantation begrenzt ist. Die Entwicklung neuer biotechnologischer Ansätze für den Ersatz erkrankter Lungen ist unerlässlich, um das Überleben der Patienten zu verbessern und Komplikationen im Zusammenhang mit den derzeitigen Transplantationsmethoden zu vermeiden. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von dezellularisierten ganzen Lungen, denen zelluläre Bestandteile fehlen, die typischerweise die Ursache für akute und chronische Abstoßungsreaktionen sind. Da die Lunge ein so komplexes Organ ist, ist es von Interesse, die extrazellulären Matrixkomponenten bestimmter Regionen zu untersuchen, darunter das Gefäßsystem, die Atemwege und das Alveolargewebe. Ziel dieses Ansatzes ist es, einfache und reproduzierbare Methoden zu etablieren, mit denen Forscher regionsspezifisches Gewebe aus vollständig dezellularisierten Lungen sezieren und isolieren können. Das aktuelle Protokoll wurde für die Lunge von Schweinen und Menschen entwickelt, kann aber auch auf andere Tierarten angewendet werden. Für dieses Protokoll wurden vier Geweberegionen spezifiziert: Atemwege, Gefäße, Alveolen und Lungengewebe. Dieses Verfahren ermöglicht die Gewinnung von Gewebeproben, die den Inhalt des dezellularisierten Lungengewebes im Gegensatz zu herkömmlichen Bulk-Analysemethoden genauer darstellen.

Einleitung

Lungenerkrankungen, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), idiopathischer Lungenfibrose (IPF) und Mukoviszidose (CF), sind derzeit nicht heilbar 1,2,3,4. Die Lungentransplantation ist oft die einzige Option für Patienten in späteren Stadien, jedoch bleibt dies eine begrenzte Option, sowohl aufgrund der Bereitstellung geeigneter Spenderlungen als auch aufgrund der akuten und chronischen Abstoßung nach der Transplantation ^3,5,6. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Behandlungsstrategien. Ein vielversprechender Ansatz in der respiratorischen Biotechnik ist die Anwendung von Gewebegerüsten, die aus dezellularisiertem nativem Lungengewebe hergestellt werden. Da azelluläre Gerüste der gesamten Lunge einen Großteil der Komplexität der Zusammensetzung der nativen extrazellulären Matrix (EZM) und der Bioaktivität beibehalten, wurden sie intensiv für das Whole-Organ-Engineering und als verbesserte Modelle für die Untersuchung von Lungenkrankheitsmechanismen untersucht 7,8,9,10. Parallel dazu besteht ein zunehmendes Interesse an der Verwendung von dezellularisiertem Gewebe aus verschiedenen Organen, einschließlich der Lunge, als Hydrogele und andere Substrate für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen in Organoid- und anderen Gewebekulturmodellen 11,12,13,14,15,16,17 . Diese liefern relevantere Modelle als kommerziell erhältliche Substrate wie Matrigel, die aus Tumorquellen gewonnen werden. Allerdings sind die Informationen über aus der menschlichen Lunge gewonnene Hydrogele derzeit relativ begrenzt. Wir haben bereits Hydrogele beschrieben, die aus dezellularisierten Schweinelungen gewonnen wurden, und sowohl ihre mechanischen als auch materiellen Eigenschaften charakterisiert sowie ihre Nützlichkeit als Zellkulturmodelle nachgewiesen^18,19. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurde die anfängliche mechanische und viskoelastische Charakterisierung von Hydrogelen beschrieben, die aus dezellularisierten, normalen und erkrankten (COPD, IPF) menschlichen Lungen gewonnen wurden²⁰. Wir haben auch erste Daten zur Charakterisierung des Glykosaminoglykangehalts von dezellularisierten normalen und COPD-menschlichen Lungen sowie deren Anwendbarkeit für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-EZM-Interaktionen^{vorgestellt 11}.

Diese Beispiele veranschaulichen die Leistungsfähigkeit der Verwendung von dezellularisierten menschlichen Lungen-ECMs für Untersuchungszwecke. Die Lunge ist jedoch ein komplexes Organ, und sowohl die Struktur als auch die Funktion variieren in verschiedenen Regionen der Lunge, einschließlich der EZM-Zusammensetzung und anderer Eigenschaften wie Steifigkeit^21,22. Daher ist es von Interesse, die EZM in einzelnen Regionen der Lunge zu untersuchen, einschließlich der Luftröhre und der großen Atemwege, der mittleren und kleinen Atemwege und der Lungenbläschen sowie der großen, mittleren und kleinen Blutgefäße. Zu diesem Zweck haben wir eine zuverlässige und reproduzierbare Methode entwickelt, um dezellularisierte Lungen von Menschen und Schweinen zu sezieren und anschließend jede dieser anatomischen Regionen zu isolieren. Dies ermöglichte eine detaillierte Differentialanalyse des regionalen Proteingehalts sowohl in der normalen als auch in der erkrankten Lunge²¹.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der IACUC der University of Vermont (UVM) durchgeführt. Alle menschlichen Lungen wurden von UVM Autopsy Services entnommen und die damit verbundenen Studien wurden gemäß den Richtlinien des IRB von UVM durchgeführt.

HINWEIS: Die Dezellularisierung der Lunge von Schweinen und Menschen wurde bereits von unserer Gruppe 7,8,9,10,21 beschrieben. Kurz gesagt, ganze Lungenlappen werden durch sequentielle Perfusion der Atemwege und Gefäße mit einer Reihe von 2-Liter-Detergenzien- und Enzymlösungen unter Verwendung einer Peristaltikpumpe dezellularisiert: 0,1 % Triton-X 100, 2 % Natriumdesoxycholat, 1 M Natriumchlorid, 30 μg/ml DNase/1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl₂, 0,1 % Peressigsäure/₄ % Ethanol, und eine Reinigung mit deionisiertem Wasser. Zu den Standardmethoden zur Bestätigung einer effizienten Dezellularisierung gehören die Bestimmung von <50 ng/mg doppelsträngiger DNA in dezellularisierten Lungen und die Abwesenheit von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese sowie die Kernfärbung durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) ^9,21.

1. Einrichtung

1. Sammeln Sie alle notwendigen Geräte, die für das Präparieren erforderlich sind, einschließlich einer Glasauflaufform, zwei Paar chirurgischer Pinzetten, einer Pinzette und einer chirurgischen Schere, und eines Autoklaven, bevor Sie es verwenden.
2. Entnehmen Sie einen Abschnitt der Lunge, legen Sie ihn in die Glasauflaufform und richten Sie ihn so aus, dass das obere Ende der Atemwege deutlich zu sehen ist.
3. Identifizieren Sie das proximale Ende des Gefäßsystems und lassen Sie es bis zu späteren Schritten intakt. Das Ende des Gefäßsystems sollte deutlich sichtbar und vollständig undurchsichtig weiß sein.
4. Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer chirurgischen Schere alle Pleura, die möglicherweise die Außenseite der Lunge auskleidet, und entsorgen Sie sie.

2. Freilegung der Atemwege

1. Arbeiten Sie mit einer Spreiztechnik mit der chirurgischen Schere vorsichtig vor, um die zusätzlichen Atemwege freizulegen.
   1. Suchen Sie den größten Atemweg, der in der Regel einen Durchmesser von ca. 2-4 cm hat. Eine weitere Möglichkeit, einen Atemweg zu identifizieren, ist die Betrachtung von Knorpelringen, die visuell oder durch Abtasten des Gewebes erkannt werden können.
   2. Tasten Sie mit einer Pinzette die Länge der Atemwege ab, um die Position des unsichtbaren Atemwegs bis zu einer Tiefe von etwa 1 Zoll zu bestimmen.
      HINWEIS: Da die Atemwege mit Knorpelringen ausgekleidet sind, sind sie charakteristisch härter als die anderen Lungengewebe. Daher sollte das Auffinden und Abtasten der unsichtbaren Atemwege relativ einfach sein.
   3. Halten Sie die chirurgische Schere parallel zu den Atemwegen und führen Sie die geschlossenen Spitzen in das Gewebe ein, das die unsichtbaren Atemwege direkt umgibt.
   4. Öffnen Sie langsam die chirurgische Schere, um die umgebende Membran vorsichtig auseinander zu ziehen. Entfernen Sie anschließend die chirurgische Schere und vermeiden Sie es, Gewebe zu schneiden.
   5. Wiederholen Sie diesen Vorgang während des gesamten Dissektionsverfahrens mit Unterbrechungen, um die Atemwege weiter freizulegen.
2. Schneiden Sie mit der chirurgischen Schere die Atemwege an den Verzweigungspunkten ab und präparieren Sie entlang jeder Äste unabhängig voneinander.
   HINWEIS: Ein Verzweigungspunkt ist eine Stelle, an der sich ein Atemweg in zwei separate Atemwege aufteilt.
3. Trennen Sie Regionen der Atemwege, sobald Sie sicher sind, dass die intakten Enden identifizierbar bleiben und für eine weitere Präparation leicht lokalisiert werden können.
4. Legen Sie durchtrennte Bereiche der Atemwege in den entsprechenden Schlauch. Die Größe der abgetrennten Regionen variiert je nach Probe, liegt aber im Allgemeinen zwischen 1 und 5 cm Länge. Die Breite variiert je nach relativer Lage entlang des Atemwegsbaums, wobei die distalen Regionen eine geringere Breite aufweisen als die proximaleren Regionen.

3. Freilegen und Herausschneiden von Gefäßregionen

1. Üben Sie sanften Druck auf die Gefäße aus und ziehen Sie sich langsam von den Atemwegen weg. Lassen Sie das Gefäßsystem leicht dehnen und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um das Gefäßsystem weiter von den Atemwegen zu trennen.
   Anmerkungen: Zu viel Druck reißt das Gefäßsystem. Wenn das Gefäßsystem reißt, legen Sie einfach diesen Abschnitt des Gefäßsystems in den entsprechend beschrifteten Schlauch und identifizieren Sie sein intaktes Ende.
2. Wenn eine Verzweigungsstelle im Gefäßbaum freigelegt wurde, verwenden Sie eine chirurgische Schere und Pinzette, um tiefere Regionen des Gefäßsystems freizulegen.
   1. Führen Sie zunächst die geschlossenen Spitzen der OP-Schere knapp unterhalb einer Verzweigungsstelle und zwischen den beiden entsprechenden Gefäßregionen ein.
   2. Öffnen Sie die Schere langsam, um das darunter liegende Gewebe auseinander zu spreizen.
   3. Verwenden Sie intermittierend eine Pinzette, um das Gewebe zu entfernen, das mit der chirurgischen Schere auseinandergespreizt wurde, sowie alle anderen Gewebe, die das Gefäßsystem direkt umgeben.
3. Wenn das Gefäßsystem Regionen der Atemwege bedeckt oder für einen Schritt des Dissektionsverfahrens umständlich wird, durchtrennen Sie das Gefäßsystem an einem Verzweigungspunkt und präparieren Sie entlang eines der beiden Zweige unabhängig voneinander weiter.
4. Trennen Sie Regionen des Gefäßsystems, sobald Sie sicher sind, dass die intakten Enden identifizierbar bleiben und für eine weitere Präparation leicht lokalisiert werden können.

4. Identifizierung und Entfernung von Alveolargewebe

1. Kneifen Sie mit einer Pinzette oder Pinzette kleine Regionen des Alveolargewebes zusammen und reißen Sie sie dann vorsichtig ab.
   1. Lokalisieren Sie eine Geweberegion, die sich nicht in unmittelbarer Nähe der Atemwege oder der Gefäße befindet.
   2. Drücken Sie mit der Pinzette einen kleinen Bereich des Gewebes zusammen, der frei von Gefäßen oder Atemwegen zu sein scheint.
   3. Reißen Sie den eingeklemmten Bereich des Gewebes aus der Lunge.
2. Beobachten Sie den Bereich des entnommenen Gewebes und bestätigen Sie, ob es sich um Alveolargewebe handelt oder nicht.
   HINWEIS: Alveolargewebe ist in der gesamten Lunge vorhanden und kann und sollte daher während des gesamten Dissektionsverfahrens entfernt werden. Jegliches Gewebe, das nicht leicht als primär Alveolen, Gefäße oder Atemwege identifiziert werden kann, sollte als Schüttgewebe kategorisiert und in das entsprechend gekennzeichnete Röhrchen gelegt werden.

Ergebnisse

Ein allgemeines Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Einmal gemeistert, ist die regionale Dissektion von dezellularisiertem Lungengewebe leicht reproduzierbar. Die Bestimmung der Kategorisierung jeder abgetrennten Gewebeprobe ist für den Erfolg des Dissektionsverfahrens unerlässlich. Gefäßgewebe ist wesentlich elastischer als die Atemwege, daher ist die Verwendung einer Pinzette zur Dehnung des Gewebes oft ein starker Indikator dafür, ob es sich bei einer bestimmten Pro...

Diskussion

Dezellularisiertes Gewebe von Menschen und anderen Spezies wird häufig als Biomaterial für die Untersuchung der EZM-Zusammensetzung sowie der Zell-EZM-Interaktionen in Ex-vivo-Kulturmodellen, einschließlich 3D-Hydrogelen, verwendet^12,13. Ähnlich wie andere Organe wurden dezellularisierte Lungen in der Vergangenheit verwendet, um Unterschiede in der EZM-Zusammensetzung in gesunden und kranken (d. h. emphysematösen und IPF) Lungen zu bestimmen, und we...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10