Диссекция и выделение регионоспецифической децеллюляризированной ткани легких

Резюме

Здесь представлен протокол выделения регионарной децеллюляризированной легочной ткани. Этот протокол предоставляет мощный инструмент для изучения сложностей во внеклеточном матриксе и взаимодействиях между клетками и матриксом.

Аннотация

Трансплантация легких часто является единственным вариантом для пациентов на поздних стадиях тяжелого заболевания легких, но это ограничено как из-за наличия подходящих донорских легких, так и из-за острого и хронического отторжения после трансплантации. Определение новых биоинженерных подходов для замены больных легких является обязательным условием для повышения выживаемости пациентов и предотвращения осложнений, связанных с текущими методологиями трансплантации. Альтернативный подход включает использование децеллюляризированных целых легких, в которых отсутствуют клеточные компоненты, которые, как правило, являются причиной острого и хронического отторжения. Поскольку легкое является таким сложным органом, представляет интерес изучение компонентов внеклеточного матрикса конкретных областей, включая сосудистую сеть, дыхательные пути и альвеолярную ткань. Целью этого подхода является создание простых и воспроизводимых методов, с помощью которых исследователи могут препарировать и изолировать регионоспецифическую ткань от полностью децеллюляризированных легких. Текущий протокол был разработан для легких свиней и человека, но может быть применен и к другим видам. Для этого протокола были определены четыре области ткани: дыхательные пути, сосудистая сеть, альвеолы и объемная легочная ткань. Эта процедура позволяет получить образцы ткани, которые более точно представляют содержимое децеллюляризированной легочной ткани, в отличие от традиционных методов объемного анализа.

Введение

Заболевания легких, включая хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) и муковисцидоз (МВ), в настоящее время остаются неизлечимыми 1,2,3,4. Трансплантация легких часто является единственным вариантом для пациентов на более поздних стадиях, однако она остается ограниченным вариантом как из-за наличия подходящих донорских легких, так и из-за острого и хронического отторжения после трансплантации ^3,5,6. Таким образом, существует острая потребность в новых стратегиях лечения. Одним из перспективных подходов в респираторной биоинженерии является применение тканевых каркасов, приготовленных из децеллюляризованной нативной ткани легких. Поскольку бесклеточные цельные каркасы легких сохраняют большую часть сложности состава и биологической активности нативного внеклеточного матрикса (ECM), они интенсивно изучались для цельноорганной инженерии и в качестве улучшенных моделей для изучения механизмов заболеваний легких 7,8,9,10. Параллельно растет интерес к использованию децеллюляризированных тканей из различных органов, включая легкие, в качестве гидрогелей и других субстратов для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий в органоидных и других моделях тканевых культур 11,12,13,14,15,16,17 . Они предоставляют более релевантные модели, чем коммерчески доступные субстраты, такие как Matrigel, полученные из опухолевых источников. Однако информация о гидрогелях человеческого происхождения в настоящее время относительно ограничена. Ранее мы описали гидрогели, полученные из децеллюляризированных легких свиней, и охарактеризовали как их механические, так и материальные свойства, а также продемонстрировали их полезность в качестве моделей клеточных культур^18,19. В недавнем отчете подробно описаны первоначальные механические и вязкоупругие характеристики гидрогелей, полученных из децеллюляризованных нормальных и больных (ХОБЛ, ИЛФ) легких человека²⁰. Представлены исходные данные, характеризующие содержание гликозаминогликанов в децеллюляризированных нормальных легких и легких человека с ХОБЛ, а также их применимость для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий¹¹.

Эти примеры иллюстрируют возможности использования децеллюляризованных РЭБ легких человека в исследовательских целях. Однако легкое является сложным органом, и его структура и функция различаются в разных областях легкого, включая состав ECM и другие свойства, такие как жесткость^21,22. Таким образом, представляет интерес изучение ECM в отдельных областях легкого, включая трахею и крупные дыхательные пути, средние и мелкие дыхательные пути и альвеолы, а также крупные, средние и мелкие кровеносные сосуды. С этой целью мы разработали надежный и воспроизводимый метод вскрытия децеллюляризированных легких человека и свиньи и последующей изоляции каждой из этих анатомических областей. Это позволило провести детальный дифференциальный анализ регионального содержания белка как в нормальных, так и в больных легких²¹.

протокол

Все исследования на животных были проведены в соответствии с IACUC Университета Вермонта (UVM). Все легкие человека были получены в Службе аутопсии UVM, и соответствующие исследования были проведены в соответствии с рекомендациями IRB UVM.

ПРИМЕЧАНИЕ: Децеллюляризация легких свиньи и человека была ранее описана нашей группой 7,8,9,10,21. Короче говоря, целые доли легких децеллюляризируются путем последовательной перфузии дыхательных путей и сосудистой сети серией из 2 л моющих и ферментных растворов с использованием перистальтического насоса: 0,1% Triton-X 100, 2% дезоксихолата натрия, 1 М хлорида натрия, 30 мкг/мл ДНКазы/1,3 мМ MgSO 4/2 мМ CaCl₂, 0,1% надуксусной кислоты/₄% этанола, и промывка деионизированной водой. Стандартные методы подтверждения эффективности децеллюляризации включают определение остаточной двухцепочечной ДНК <50 нг/мг в децеллюляризированных легких и отсутствие фрагментов ДНК с помощью гель-электрофореза, а также ядерное окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)^{окрашиванием 9,21}.

1. Настройка

1. Перед использованием соберите все необходимое оборудование, необходимое для процедуры вскрытия, включая стеклянную форму для запекания, две пары хирургических пинцетов, одну пару щипцов и одну пару хирургических ножниц, а также автоклав.
2. Возьмите участок легкого, поместите его в стеклянную форму для запекания и сориентируйте его так, чтобы был четко виден верхний конец дыхательных путей.
3. Определите проксимальный конец сосудистой сети и сохраните его нетронутым до более поздних шагов. Конец сосудистой сети должен быть хорошо виден и полностью непрозрачен белого цвета.
4. Используя пинцет и хирургические ножницы, удалите плевру, которая может выстилать внешнюю часть легкого, и выбросьте.

2. Обнажение дыхательных путей

1. Используя технику размазывания хирургическими ножницами, осторожно работайте, чтобы обнажить дополнительные дыхательные пути.
   1. Найдите самые большие дыхательные пути, которые обычно имеют диаметр примерно 2-4 см. Другим способом идентификации дыхательных путей является наблюдение за хрящевыми кольцами, которые можно обнаружить визуально или путем пальпации ткани.
   2. Используя пару щипцов, пальпируйте по всей длине дыхательных путей, чтобы определить местоположение невидимых дыхательных путей на глубине примерно 1 дюйм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будучи выстланными хрящевыми кольцами, дыхательные пути характерно более твердые, чем другие ткани легких. Таким образом, поиск и пальпация невидимых дыхательных путей должны быть относительно простыми.
   3. Держа хирургические ножницы параллельно дыхательным путям, вставьте закрытые кончики в ткани, непосредственно окружающие невидимые дыхательные пути.
   4. Медленно откройте хирургические ножницы, чтобы аккуратно раздвинуть окружающую мембрану. Затем удалите хирургические ножницы и не режьте какие-либо ткани.
   5. Повторяйте этот процесс периодически на протяжении всей процедуры рассечения, чтобы продолжать обнажать дыхательные пути.
2. С помощью хирургических ножниц разрежьте дыхательные пути в точках разветвления и рассеките вдоль каждой ветви независимо друг от друга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точка разветвления - это место, в котором один дыхательный путь разделяется на два отдельных дыхательных пути.
3. Разорвите области дыхательных путей, убедившись, что неповрежденные концы останутся идентифицируемыми и легко найдутся для дальнейшего рассечения.
4. Поместите разорванные участки дыхательных путей в соответствующую трубку. Размер отрезанных областей будет варьироваться в зависимости от образца, но, как правило, будет варьироваться от 1 до 5 см в длину. Ширина варьируется в зависимости от относительного расположения вдоль дерева дыхательных путей, при этом дистальные области сохраняют меньшую ширину, чем более проксимальные области.

3. Обнажение и иссечение областей сосудистой сети

1. Слегка надавите на сосудистую сеть и медленно отойдите от дыхательных путей. Дайте сосудистой сети немного растянуться и используйте хирургические ножницы, чтобы еще больше отделить сосудистую сеть от дыхательных путей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком большое давление разорвет сосудистую сеть. Если сосудистая сеть разрывается, просто поместите этот участок сосудистой сети в соответствующую маркированную трубку и определите ее неповрежденный конец.
2. Когда точка ветвления в сосудистом дереве была обнажена, используйте хирургические ножницы и пинцет, чтобы обнажить более нижние области сосудистой сети.
   1. Начните с введения закрытых кончиков хирургических ножниц чуть ниже точки разветвления и между двумя соответствующими областями сосудистой сети.
   2. Медленно откройте ножницы, чтобы раздвинуть подлежащие ткани.
   3. Периодически используйте пинцет, чтобы удалить ткань, которая была раздвинута с помощью хирургических ножниц, а также любую другую ткань, непосредственно окружающую сосудистую сеть.
3. Когда сосудистая сеть покрывает области дыхательных путей или становится громоздкой для любого этапа процедуры рассечения, разрезайте сосудистую сеть в точке разветвления и далее рассекайте вдоль любой ветви независимо друг от друга.
4. Разорвите участки сосудистой сети после того, как убедитесь, что неповрежденные концы останутся идентифицируемыми и легко найдутся для дальнейшего рассечения.

4. Идентификация и иссечение альвеолярной ткани

1. С помощью щипцов или пинцета зажмите, а затем аккуратно оторвите небольшие участки альвеолярной ткани.
   1. Найдите область ткани, которая не находится в непосредственной близости от дыхательных путей или сосудистой сети.
   2. Используя пинцет, ущипните небольшую область ткани, которая, по-видимому, лишена какой-либо сосудистой сети или дыхательных путей.
   3. Оторвите защемленный участок ткани от легкого.
2. Понаблюдайте за областью удаленной ткани и подтвердите, является ли она альвеолярной тканью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альвеолярная ткань присутствует по всему легкому, поэтому ее можно и нужно удалять во время процедуры рассечения. Любая ткань, которая не может быть легко идентифицирована в первую очередь как альвеолы, сосудистая сеть или дыхательные пути, должна быть классифицирована как объемная ткань и помещена в соответствующую маркированную трубку.

Результаты

Общая схема протокола показана на рисунке 1. После освоения регионарная диссекция децеллюляризованной легочной ткани легко воспроизводима. Определение категоризации каждого разорванного образца ткани является обязательным условием успеха процедуры вскрытия. Сосуди...

Обсуждение

Децеллюляризированные ткани человека и других видов часто используются в качестве биоматериалов для изучения состава ECM, а также взаимодействий между клетками и ECM в моделях культур ex vivo, включая 3D-гидрогели^12,13. Подобно другим органам, децеллюляризи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10