חיקוי שיטת הגלגול של דינג על פגיעת שריר הנגרמת על ידי נוטקסין בחולדות

Summary

פרוטוקול זה מתאר מכשיר פשוט המחקה את שיטת הגלגול של דינג, מבסס מודל חולדה של פגיעה בשרירי השלד, ומשתמש בצביעת המטוקסילין-אאוזין כדי לבחון את הפתולוגיה של רקמות פגועות ובדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים כדי לזהות שינויים בסמני נזק בסרום.

Abstract

שיטת הגלגול של דינג היא אחת המניפולציות הנפוצות ביותר במרפאות עיסוי סיני מסורתי (Tuina) ואחת המניפולציות העכשוויות המשפיעות ביותר בסין. היא מבוססת על שיטת הגלגול המסורתית הנפוצה בז'אנר הזן באצבע אחת ונקראת שיטת הגלגול של דינג. בשל השפעותיה האנטי דלקתיות ומעודדות זרימת הדם, לשיטת הגלגול של דינג יש השפעות טיפוליות טובות על מיופתיה. בגלל שטח הכוח הגדול המופעל על עור האדם, שיטת הגלגול של דינג מאתגרת לביצוע על חיות ניסוי עם אזורי עור קטנים, כגון חולדות וארנבות. בנוסף, הכוח של טווינה המיושם על גוף האדם שונה מזה המיושם על חיות ניסוי, ולכן זה יכול לקרות כי הכוח הוא גבוה מדי או נמוך מדי כדי להשיג את ההשפעה הטיפולית של Tuina במהלך הניסוי. ניסוי זה נועד ליצור מכשיר עיסוי פשוט המתאים לחולדות בהתבסס על פרמטרי מניפולציית הגלגול של דינג (חוזק, תדירות, משך טווינה). המכשיר יכול לתקנן מניפולציות בניסויים בבעלי חיים ולהפחית את השונות בכוח טווינא המופעל על בעלי חיים שונים בשל גורמים סובייקטיביים. מודל חולדה של פגיעה בשרירי השלד כתוצאה מ-notexin-inducis הוקם, וסמני פגיעה בפלזמה קריאטין קינאז (CK) וחלבון קושר חומצות שומן 3 (FABP3) שימשו להערכת ההשפעה הטיפולית של Tuina על פגיעה בשרירי השלד. התוצאות הראו כי מעסה Tuina זה יכול להפחית את רמות הביטוי של CK ו- FABP3 ולהאט את מידת הפגיעה בשרירי השלד. לכן, מכשיר העיסוי Tuina המתואר כאן, המחקה את שיטת הגלגול של דינג, תורם לסטנדרטיזציה של מניפולציית Tuina במחקר ניסיוני ומסייע רבות למחקר הבא על המנגנון המולקולרי של Tuina למיופתיה.

Introduction

פגיעות שרירים הן פציעות טראומטיות שכיחות בחיי הקליניקה ובחיי היומיום, הנגרמות כתוצאה ממכות חיצוניות (חבלות) או ממאמץ יתר כרוני של סיבי שריר (מתחים) וכו', וכתוצאה מכך לתפקוד לקוי של השרירים ולכאבים, ואף משפיעים באופן חמור על איכות חייו של המטופל¹. התחלת שיקום מוקדם ככל האפשר לאחר פציעת מאמץ חריפה היא המפתח לקיצור זמן החזרה לספורט² ולהפחתת כאב ^3,4. ברפואה המערבית המודרנית, עזרה ראשונה קלינית לפציעות שרירים עוקבת אחר עקרונות המנוחה, הקרח, הדחיסה וההגבהה (RICE) כדי לעצור דימום מזיק לרקמת השריר⁵ ותרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות להקלה על כאב⁶. גילוי טיפולים חדשניים כגון אקסוזומים⁷ והנדסת רקמות⁸ הפכו לאסטרטגיות טיפול פוטנציאליות במחלות שרירי שלד, המפצות על חסרונותיהם של טיפולים תרופתיים קודמים. עם זאת, זה יכול גם לייקר את עלות הטיפול בחולים, לשים אותם תחת לחץ כלכלי עצום⁹. לכן, טיפולים אלטרנטיביים ומשלימים מומלצים לטיפול בבעיות שרירים ושלד¹⁰. טווינה נמצאת בשימוש קליני נרחב בסין כשיטה רפואית מסורתית והיא פופולרית בקרב חולים בשל יעילותה ופחות תופעות לוואי. טיפול טווינא בהפרעות שרירים ושלד יכול להקל על הכאב ולשפר את התפקוד^11,12,13. מר דינג ג'יפנג, מתרגל טואינה מפורסם משנחאי, ייסד את שיטת הרול¹⁴ של דינג. זוהי טכניקת גלגול וריסוק ייחודית עם שטח כוח גדול, כוח אחיד ועדין, וחדירה אינטנסיבית.

מודלים שונים של בעלי חיים מבוססים על אטיולוגיות שונות. יש להם יתרונות וחסרונות, ולבחירת מודלים נכונים ומתאימים של בעלי חיים יש משמעות רבה לניסויים בסיסיים, המסייעים להבין את מסלולי האיתות התאיים והמולקולריים של התחדשות ותיקון לאחר פגיעה בשרירי השלד כדי לפתח טיפולים חדשים לטיפול במחלות שרירי השלד. מודלים כימיים של פגיעה בשרירים נמצאים בשימוש נרחב, עם זריקות של שרירי השלד הגורמות לנמק מיופייבר ומייצרות אזורים מחודשים שיכולים להתחדש ביעילות תוך שבועיים¹⁵. גם נוטקסין וגם בופיוואקאין עלולים לגרום נזק לשרירים. עם זאת, נוטקסין יכול לגרום נזק מיוטוקסי חמור יותר לשרירי השלד מאשר bupivacaine, וההתאוששות התפקודית הטבעית איטית יחסית¹⁶. הזרקה תוך שרירית של תרופות לא רק לוקחת פחות זמן, אלא גם יש לה השפעות מבוקרות והיקף הנזק לשרירי השלד. בקרה ניתנת לכימות זו הופכת את היציקה המוצלחת לפחות קשה^15,17.

תגובה דלקתית היא תגובה ביולוגית חיונית שנחקרה בהרחבה בהקשר של מיופתיה^18,19. בשלבים המוקדמים של פגיעה בשרירי השלד, נמק מיופייבר משבש את הומאוסטזיס השריר המקומי, ותאי דלקת רבים חודרים לאתר הפציעה ומפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים רבים¹⁹. קריאטין קינאז (CK) הוא סמן ביולוגי מסורתי בסרום להערכת פגיעה בשרירי השלד. עם זאת, הוא חסר ספציפיות רקמות²⁰ ורגישות²¹, מה שמגביל את יכולתו להעריך את היקף הנזק לשרירים הנגרם על ידי תרופות ולדווח בעקיפין על מידת התאוששות השרירים לאחר פציעה. סמנים ביולוגיים חדשניים, כולל חלבון קושר חומצות שומן 3 (FABP3), הראו לאחרונה ספציפיות ורגישות גבוהות יחסית לרקמות במודלים של מכרסמים של פגיעה בשרירי השלד. FABP3 היא משפחה של חלבונים קושרים המתבטאים בעיקר בתאי שריר הלב והשלד ומעורבים בחילוף חומרים, הובלה ואיתות של חומצות שומן²². לכן, בחרנו בשילוב של שני סמנים ביולוגיים, CK ו- FABP3, כדי להעריך את מידת הנזק לשרירי השלד הנגרם על ידי נוטקסין ואת ההתאוששות לאחר הטיפול.

במכרסמים השרירים רדודים, ושטח העור קטן, מה שקובע גם שהפרמטרים השונים של עיסוי במכרסמים לא יהיו זהים לאלה שבבני אדם, כמו בטיפול באמצעות בעלי חיים, המעסה צריך לטפל בהם בפחות כוח בשיטת הגלגול של דינג, וייתכן שלא יתרום להפעלת טכניקה זו בשל גודלו הקטן של האזור הפגוע, מה שיכול בסופו של דבר להוביל לירידה ביעילות העיסוי. לכן, הניסוי השתמש במעסה המתגלגל שנעשה בבית, התואם את המאפיינים של שיטת הגלגול של דינג, כדי להתערב ולהעריך את ההשפעה הטיפולית של מודל הפגיעה בשרירי השלד בחולדות, המסייע לתקנן את הפרמטרים של טווינה במחקרים ניסיוניים בבעלי חיים על מנת לחקור לעומק את מנגנון הפעולה המולקולרי של טווינה, שיטת טיפול ברפואה סינית מסורתית, במחלות שרירים ושלד.

Protocol

הליכים המערבים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש המוסדית באוניברסיטת הונאן לרפואה סינית.

1. הרכבת המעסה המתגלגל

1. בחרו מכשיר עיסוי המורכב מגלגלת גומי, מחזיק מזלגות, קפיץ, מבולבל גבול, סד כוונון, בורג וידית אקרילית (איור 1). ודאו שגלגלת הגומי היא באורך 3 ס"מ ובקוטר 1.6 ס"מ, בקפיץ באורך 3 ס"מ ובקוטר 0.9 ס"מ, בלבל הגבול הוא באורך 3 ס"מ וברוחב 2 ס"מ, ומידותיו של הידית באורך 12 ס"מ ובקוטר 0.9 ס"מ.
2. בקרת כוח: על פי תוצאות הספרות²³, שיטת הגלגול של דינג בלחץ כלפי מטה נמצאה כ-10% ממשקל הגוף, כך שהלחץ המופעל במהלך תכנון הגלגול קדימה הוא כ-10% ממשקל הגוף של החולדה (0.2-0.3 N). בדוק את הלחץ המרבי של המעסה על בקר השקילה להיות בערך 0.3 N על ידי התאמת הזווית של בלבול הגבול. דרישת לחץ זו עונה על צרכי החולדה.
3. ודא שהלחץ המינימלי הוא בערך 0.08 N בעת גלגול לאחור (איור 2). ודא שהלחץ תואם בדיוק את דרישת שיטת הגלגול של דינג שהיחס בין הכוחות קדימה ואחורה הוא 3:1.
4. לפני הטיפול, בקש מהמפעיל לעבוד עם תוכנת המטרונום כדי לשלוט בתדירות הגלגול ל -140 גלילים לדקה ותרגל זאת יותר מ -3 פעמים בניסוי המקדים כדי להבטיח שהפעולה סטנדרטית.

2. הקמת מודל חולדה לפגיעה בשרירי השלד

1. חלקו באופן אקראי 24 חולדות זכרים, Sprague-Dawley (במשקל 200-250 גרם) לשלוש קבוצות של שמונה חולדות כל אחת, כולל ביקורת (C), נוטקסין (NTX) ונוטקסין עם טווינה (NTX + Tuina), וניזונים מתזונה סטנדרטית. יש לשמור על מחזור אור של 12 שעות/12 שעות חושך, להגיע לטמפרטורה של 20-25 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-70%.
2. מרדימים עם 1% נתרן pentobarbital (40 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal ולאחר מכן להסיר שיער מן הגפה התחתונה הימנית עם קרם הסרת שיער. לאחר הסרת הפרווה, נגבו את שאריות הקרם באמצעות מי מלח. יש לוודא הרדמה נאותה על ידי תגובת צביטה בבוהן. החל משחה אופתלמית כדי לחות את העיניים בזמן החיה תחת הרדמה. לספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך.
3. חיטוי עור חלופי לגפה התחתונה הימנית עם תמיסת חיטוי יודופור ו-75% אלכוהול לפני ההזרקה. לגעת בצמר גפן ספוג בתמיסת חיטוי יודופור במרכז העור של הגפיים התחתונות ולמרוח בתנועה סיבובית כלפי חוץ. חזרו על הפעולה עם צמר גפן ספוג אתנול.
4. קביעת מודלים לפגיעה בשרירי השלד על פי שיטת הייחוס²⁴. יש להזריק נוטקסין ברגל אחת בלבד (למניעת הזרקת נוטקסין כפול). יש לשאוב 200 מיקרוליטר של תמיסת נוטקסין (10 מיקרוגרם/מ"ל תמיסת נוטקסין שהוכנה על ידי הוספת 100 מיקרוגרם נוטקסין ל-10 מ"ל מלח רגיל בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל) לתוך מזרק של 1 מ"ל עם מחט 30 גרם ולהזריק את תמיסת הנוטקסין תוך שרירית לשריר הגסטרוקנמיוס כדי לייצר פגיעה בשריר.
5. להזריק את הנוטקסין לאט ולחכות 3 שניות לפני שליפת המחט (להזרקה מלאה).
   זהירות: נוטקסין הוא כימיקל רעיל הדורש שטיפה מיידית עם הרבה מים במגע עם פצע פתוח וטיפול רפואי מיידי במידת הצורך.
6. הזריקו לחולדות בקבוצת הביקורת 200 מיקרוליטר של תמיסת מלח. העבירו חולדות מורדמות לכלובים ריקים עם מצעים נקיים. הקפידו להסיר את הריפוד סביב האף והפה של החולדות כדי לשמור על נשימה צלולה. התבוננו ויזואלית בצבע הרקמה ובקצב הנשימה בסוף ההזרקה עד שהחולדות חוזרות להכרה מספקת.
7. החזירו חולדות לכלוב הביתי ובדרך כלל גידלו אותן למשך 24 שעות.

3. טיפול Tuina

1. הניחו חולדת SD במצב נוטה כשראשה מכוסה בבד שחור על משטח הניסוי שעבר חיטוי ב-75% אלכוהול כדי לחשוף את שריר הגסטרוקנמיוס. אין לכסות חזק מדי.
2. שימוש במעסה Tuina לקבוצת NTX+Tuina: החזיקו את מכשיר העיסוי והניחו את הרולר על שריר הגסטרוקנמיוס של החולדה וגלגלו קדימה עד שהקפיץ יבוא במגע עם הבלבול הגבולי. לאחר מכן משכו את הכוח וחזרו למקומו המקורי, ובכך חזרו לתנועה (איור 3).
3. גלגלו את מכשיר העיסוי במהירות של 140 גלילים לדקה, ובצעו כל פעולה במשך 3 דקות. בצעו את העיסויים פעם אחת בבוקר ופעם אחר הצהריים במשך 3 ימים רצופים.
4. יש להחזיר חולדות לכלוב הביתי לאחר כל טיפול ולצום במשך 8 שעות לאחר הטיפול האחרון.

4. איסוף דם ורקמות מחולדות לאחר הניסוי

1. על פי דרישות ועדת האתיקה הרלוונטית לניסויים בבעלי חיים, יש להרדים חולדות באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 1% נתרן פנטוברביטלי (40 מ"ג/ק"ג, הזרקה תוך צפקית). יש לוודא הרדמה נאותה על ידי תגובת צביטה בבוהן. הרדימו חולדות על ידי הקזת דם באבי העורקים הבטני לאחר איסוף דם.
2. חיטוי עור חלופי בתמיסת חיטוי יודופור ו-75% אלכוהול לפני ההזרקה. יש לגעת במקלון צמר גפן ספוג בפובידון-יוד במרכז עור הבטן ולמרוח בתנועה מעגלית כלפי חוץ. חזרו על הפעולה עם צמר גפן ספוג אתנול. יש לחזור על החיטוי 3x.
3. בקש מהעוזר להשתמש בשני המוסטטים כדי להרים את העור באמצע הבטן. כמפעיל, השתמש באזמל כדי לחתוך את עור הבטן והשרירים מהראפה לסימפיזת הערווה.
4. לאחר פתיחת חלל הבטן, מפרידים את המעי עם כדורי צמר גפן סטריליים כדי לחשוף את אבי העורקים הבטני בדופן הבטן האחורית.
5. אתר את אבי העורקים הבטני, קח 5 מ"ל של דם חולדה לתוך צינורות איסוף דם, ולקבל את הפלזמה לתוך 1.5 microtubes על ידי צנטריפוגה ב 3000 x גרם במשך 10 דקות לאחר דם עומד במשך 1 שעה. יש לאחסן פלזמה בטמפרטורה של -80°C.
6. חותכים את העור עם מספריים כירורגיים לאורך פתח הבטן התחתונה לכיוון האספקט הצידי של הגפה התחתונה הימנית, חושפים את שרירי הגפיים התחתונות, ולאחר הפרדה זהירה של הפאשיה עם מלקחיים, חותכים את האזמל כדי להסיר את שריר הגסטרוקנמיוס השלם.
7. לשטוף את שריר gastrocnemius במי מלח סטריליים כדי להסיר שיער דבק ודם.
8. הכניסו את שריר הגסטרוקנמיוס שהוסר לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל המכיל 4% פרפורמלדהיד.

5. זיהוי פלסמה CK ו- FABP 3 רמות על ידי ELISA

1. חשב וקבע את מספר הלוחות העטופים מראש הדרושים לניסוי אחד. הסר את הצלחות הדרושות, הנח אותן במסגרת 96 בארות, החזיר את שאר המיקרו-צלחות לשקית רדיד אלומיניום לאיטום, ואחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. יש לאזן את הערכות והדגימות בטמפרטורת החדר (25-28 מעלות צלזיוס) למשך 120 דקות, תוך שיווי משקל מלא לטמפרטורת החדר.
   הערה: שיווי משקל של הערכה והדגימה הוא קריטי ויש לאזן אותו לזמן מספיק.
3. הגדר בארות סטנדרטיות, דגימות וריקות. הוסף 50 μL של תקן CK או FABP3 בריכוזים שונים (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 0 ng/mL) לבארות הסטנדרטיות. חזור על כל תקן פעם אחת, ותופס בסך הכל 12 בארות.
4. מלא בארות מדגם עם 40 μL של מדלל מדגם (0.8 גרם NaCl, 0.02 גרם KH 2 PO 4, 0.29 גרם Na 2 HPO 4 12H₂O, 0.02 גרם KCl, 0.01 גרם NaN₃ב 100 מ"ל של מים מזוקקים כפול, pH_7.4), ולאחר מכן 10 μL של הדגימה להיבדק. חזור על כל דגימה פעם אחת, כובש 48 בארות בסך הכל.
5. למעט הבארות הריקות הממוקמות שתי בארות מאחורי באר הדגימה האחרונה, יש להוסיף 100 μL של נוגדן אנטי-אנושי מסוג CK או FABP3 (נוגדן המסומן באנזים) לכל תקן ולדגום היטב.
6. אטמו את הבארות בסרט איטום ודגרו באמבט מים או תרמוסטט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
7. יש להשליך את הנוזל, לייבש בטפיחות קלות על נייר סופג, למלא כל באר בנוזל כביסה, להשאיר למשך 20 שניות, לנער את נוזל הכביסה, לייבש בטפיחות קלות על נייר ניקוי, ולחזור על שטיפת הצלחת 5 פעמים (או להשתמש במכונת כביסה לצלחות).
8. הוסף 50 μL של תמיסת כרומוגן A (20 מ"ג tetramethylbenzidine, 10 מ"ל אתנול ב 100 מ"ל של מים מזוקקים כפול) ו 50 μL של תמיסת כרומוגן B (0.1 M/L חומצת לימון, 0.2 M/L נתרן dihydrogen פוספט חיץ , pH 5.0-5.4) לכל באר. יש להרחיק מאור למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C.
9. עבור בארות סטנדרטיות, בארות מדגם ובארות ריקות, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת סיום לכל באר, ומדוד את ערך הצפיפות האופטית של כל באר ב 450 ננומטר בתוך 15 דקות.

6. ניתוח היסטולוגי של פגיעת שריר גסטרוקנמיוס הנגרמת על ידי נוטקסין בחולדות

1. הכינו קטעי פרפין בעובי 5 מיקרומטר מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין לבדיקה מיקרוסקופית קלה כמתואר^ב-25.

7. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

1. קרא ונתח את התמונות שצולמו על ידי מערכת ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח. הזז את שדה הראייה של התמונה שנבחרה למרכז המסך באמצעות העכבר, לחץ על 40x ולאחר מכן לחץ על צלם תמונה.
2. רשום את ערכי OD מה- ELISA בגיליון אלקטרוני וחשב את רמות ה- CK וה- FABP3 של החולדה בדגימות באמצעות העקומה הסטנדרטית.
3. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי עבור הניתוחים הסטטיסטיים. אקספרס מדידות כממוצע ± סטיית תקן (), ונתח את ההשוואות בין קבוצות על ידי ANOVA חד-כיוונית, עם מבחן LSD כאשר השונות הייתה אחידה, ושיטת Tamhane T2 כאשר השונות לא הייתה אחידה. ההבדל נחשב מובהק סטטיסטית בערך p קטן מ-0.05.

תוצאות

על מנת לבחון את התכונות המורפולוגיות של שריר השלד של חולדה לאחר פציעה, שריר הגסטרוקנמיוס הוכתם בהמטוקסילין ובאאוזין, והתמונות המוכתמות נקראו באמצעות תוכנת ניתוח כמתואר בפרוטוקול עבור 8 חולדות לקבוצה. בחולדות עם פגיעה בשריר הגסטרוקנמיוס שנגרמה על ידי נוטקסין (קבוצת NTX), תאי שריר רבים נקרעו...

Discussion

כאן, תיארנו פרוטוקול לטיפול בטווינה בפגיעה בשרירי השלד בחולדות ולאחר מכן ניתחנו את מידת הפגיעה בשרירי השלד לאחר הטיפול כדי לאמת את יעילות השיטה. יש לציין כי מודלים של פגיעות בשרירי השלד של חולדות, כולל, אך לא רק, השראת תרופות (notexin, bupivacaine)16, קונטוזיה קהה ²⁶, ריסוק 27 ואיסכמיה-רפרפו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 microtubes	Servicebio	EP-150X-J
15 mL centrifuge tube	Servicebio	EP-1501-J
30G needle	CONPUVON	220318
5 mL blood collection tube	Servicebio	QX0023
Acrylic handle	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Adjustment splint	CREROMEM	20220729
Cotton Swab	INOHV	22080215
Enzyme-labeled Instrument	Rayto	RT-6100
Ethanol	INOHV	211106
Fork holder	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Hair removal cream	Veet, France	LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set	Wuhan Google Biotech	G1005
Imaging system	Nikon, Japan	Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution	Hale&Hearty	20221205
Light microscope	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100
Limit baffle	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodium	Merck KGaA	P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Rubber roller	Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd	202207
Screw	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley rats	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Spring	Bingzhang Hardware	TH001
Surgical blade	Covetrus	#23
Weigh controller	Iyoys	HY-XSQ