Mimetizando o Método do Rolo de Ding na Lesão Muscular Induzida por Notexina em Ratos

Resumo

Este protocolo descreve um dispositivo simples que imita o método de rolo de Ding, estabelece um modelo de lesão muscular esquelética em ratos e usa coloração de hematoxilina-eosina para observar a patologia do tecido danificado e ensaio imunoenzimático para detectar alterações nos marcadores de dano sérico.

Resumo

O método de rolo de Ding é uma das manipulações mais usadas em clínicas de massagem tradicional chinesa (Tuina) e uma das manipulações contemporâneas de Tuina mais influentes na China. Ele é baseado no método de rolamento tradicional comumente usado no gênero Zen de um dedo e chamado de método de rolo de Ding. Devido aos seus efeitos anti-inflamatórios e promotores da circulação sanguínea, o método de rolamento de Ding tem efeitos terapêuticos sólidos na miopatia. Devido à grande área de força aplicada à pele humana, o método de rolagem de Ding é desafiador de executar em animais experimentais com pequenas áreas de pele, como ratos e coelhos. Além disso, a força de Tuina aplicada ao corpo humano difere daquela aplicada aos animais de experimentação, por isso pode acontecer que a força seja muito alta ou muito baixa para alcançar o efeito terapêutico de Tuina durante o experimento. Este experimento visa criar um massageador simples adequado para ratos com base nos parâmetros de manipulação de rolamento de Ding (força, frequência, duração de Tuina). O dispositivo pode padronizar a manipulação em experimentos com animais e reduzir a variação na força de Tuina aplicada a diferentes animais devido a fatores subjetivos. Um modelo de lesão muscular esquelética induzida por anotoxina em ratos foi estabelecido, e os marcadores de lesão plasmática creatina quinase (CK) e proteína ligadora de ácidos graxos 3 (FABP3) foram usados para avaliar o efeito terapêutico de Tuina na lesão muscular esquelética. Os resultados mostraram que este massageador Tuina pode reduzir os níveis de expressão de CK e FABP3 e diminuir o grau de lesão muscular esquelética. Portanto, o massageador Tuina aqui descrito, mimetizando o método do rolo de Ding, contribui para padronizar a manipulação de Tuina em pesquisas experimentais e é de grande ajuda para pesquisas subsequentes sobre o mecanismo molecular de Tuina para miopatia.

Introdução

As lesões musculares são lesões traumáticas comuns na vida clínica e diária, causadas por golpes externos (contusões) ou sobretensão crônica das fibras musculares (estiramentos), etc., resultando em disfunção muscular e dor, afetando até seriamente a qualidade de vida do^paciente1. Iniciar a reabilitação o mais precocemente possível após uma lesão por esforço agudo é a chave para reduzir o tempo de retorno ao esporte² e reduzir a dor ^3,4. Na medicina ocidental moderna, os primeiros socorros clínicos para lesões musculares seguem os princípios de repouso, gelo, compressão e elevação (RICE) para parar o sangramento lesivo no tecido muscular⁵ e anti-inflamatórios não hormonais para aliviar a dor⁶. A descoberta de novas terapias, como os exossomos⁷ e^{a engenharia} tecidual8, tornou-se potencial estratégia de tratamento das doenças musculares esqueléticas, compensando as deficiências dos tratamentos farmacológicos anteriores. No entanto, também pode aumentar o custo do tratamento para os pacientes, colocando-os sob enorme pressão financeira⁹. Portanto, terapias alternativas e complementares são recomendadas para o tratamento de problemas musculoesqueléticos¹⁰. Tuina é amplamente utilizado clinicamente na China como um método médico tradicional e é popular entre os pacientes por sua eficácia e menos efeitos colaterais. A terapia com Tuina para distúrbios musculoesqueléticos pode aliviar a dor e melhorar a função^11,12,13. O Sr. Ding Jifeng, um famoso praticante de Tuina de Xangai, fundou o método de rolo¹⁴ de Ding. É uma técnica única de rolamento e esmagamento com uma grande área de força, força uniforme e suave, e penetração intensa.

Diferentes modelos animais são baseados em diferentes etiologias. Apresentam vantagens e desvantagens, e a seleção de modelos animais corretos e apropriados é de grande importância para experimentos básicos, o que ajuda a entender as vias de sinalização celular e molecular de regeneração e reparo após lesão muscular esquelética para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de doenças musculares esqueléticas. Modelos quimicamente induzidos de lesão muscular são amplamente utilizados, com injeções de músculo esquelético causando necrose de miofibras e produzindo áreas regeneradas que podem efetivamente se regenerar dentro de 2 semanas¹⁵. Tanto a notexina quanto a bupivacaína podem causar danos musculares. No entanto, a notexina pode causar dano miotóxico mais grave ao músculo esquelético do que a bupivacaína, e a recuperação funcional natural é relativamente mais lenta¹⁶. A moldagem por injeção intramuscular de drogas não só leva menos tempo, mas também tem efeitos controlados e extensão do dano muscular esquelético. Esse controle quantificável dificulta menos a moldagem com sucesso^15,17.

A resposta inflamatória é uma resposta biológica essencial que tem sido extensivamente estudada no contexto da^{miopatia18,19}. Nos estágios iniciais da lesão muscular esquelética, a necrose das miofibras interrompe a homeostase muscular local, e muitas células inflamatórias infiltram o local da lesão, secretando muitas citocinas pró-inflamatórias¹⁹. A creatina quinase (CK) é um biomarcador sérico tradicional para avaliação da lesão muscular esquelética. No entanto, carece de especificidade tecidual²⁰ e sensibilidade²¹, o que limita sua capacidade de avaliar a extensão do dano muscular induzido por drogas e relatar indiretamente a extensão da recuperação muscular após a lesão. Novos biomarcadores, incluindo a proteína ligadora de ácidos graxos 3 (FABP3), têm mostrado recentemente especificidade e sensibilidade teciduais relativamente altas em modelos de lesão muscular esquelética em roedores. FABP3 é uma família de proteínas de ligação expressas principalmente em células musculares cardíacas e esqueléticas e implicadas no metabolismo, transporte e sinalização de ácidos graxos²². Portanto, escolhemos uma combinação de dois biomarcadores, CK e FABP3, para avaliar a extensão do dano muscular esquelético induzido pela notoxina e a recuperação após o tratamento.

Em roedores, os músculos são superficiais, e a área da pele é pequena, o que também determina que os vários parâmetros de massagem em roedores não serão os mesmos que em humanos, como na terapia animal, o massagista deve tratá-los com menos força usando o método de rolo de Ding, e pode não ser propício para a operação desta técnica devido ao pequeno tamanho da área lesionada, o que pode, em última análise, levar a uma redução na eficácia da massagem. Portanto, o experimento utilizou o massageador de rolamento fabricado internamente, que está de acordo com as características do método do rolo de Ding, para intervir e avaliar o efeito terapêutico do modelo de lesão muscular esquelética induzida por notoxina em ratos, o que ajuda a padronizar os parâmetros de Tuina em estudos experimentais em animais, a fim de investigar profundamente o mecanismo molecular de ação de Tuina, um método de tratamento da medicina tradicional chinesa, sobre doenças musculoesqueléticas.

Protocolo

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Universidade de Medicina Chinesa de Hunan.

1. Montagem do massageador rolante

1. Selecione um massageador que consista em um rolo de borracha, suporte de garfo, mola, defletor limite, tala de ajuste, parafuso e alça de acrílico (Figura 1). Certifique-se de que o rolo de borracha mede 3 cm de comprimento e 1,6 cm de diâmetro, a mola mede 3 cm de comprimento e 0,9 cm de diâmetro, o defletor limite tem 3 cm de comprimento e 2 cm de largura, e o cabo mede 12 cm de comprimento e 0,9 cm de diâmetro.
2. Controle de força: De acordo com os resultados da^literatura23, a pressão descendente do método do rolo de Ding foi encontrada em cerca de 10% do peso corporal, de modo que a pressão aplicada durante o projeto de rolamento para frente é de cerca de 10% do peso corporal do rato (0,2-0,3 N). Teste a pressão máxima do massageador no controlador de pesagem para cerca de 0,3 N ajustando o ângulo do defletor limite. Este requisito de pressão atende às necessidades do rato.
3. Certifique-se de que a pressão mínima seja de cerca de 0,08 N ao reverter (Figura 2). Certifique-se de que a pressão esteja precisamente em conformidade com o requisito do método de rolagem de Ding, de que a relação das forças para frente e para trás seja de 3:1.
4. Antes do tratamento, peça ao operador que trabalhe com o software do metrônomo para controlar a frequência de rolamento para 140 rolos/min e pratique isso mais de 3x no pré-experimento para garantir que a operação seja padronizada.

2. Estabelecimento de um modelo de lesão muscular esquelética em ratos

1. Divida aleatoriamente 24 ratos machos da raça Sprague-Dawley (pesando 200-250 g) em três grupos de oito ratos cada, incluindo controle (C), notexina (NTX) e notexina com Tuina (NTX + Tuina), e alimente-se com uma dieta padrão. Manter em um ciclo de 12 h claro/12 h escuro, casa a 20-25 °C e 50%-70% de umidade.
2. Anestesiar com pentobarbital sódico a 1% (40 mg/kg) por injeção intraperitoneal e, em seguida, remover os pelos do membro inferior direito com creme depilatório. Depois de remover o pelo, limpe o creme residual usando soro fisiológico. Confirme a anestesia adequada pela resposta de pinça dos dedos. Aplique pomada oftálmica para hidratar os olhos enquanto o animal estiver sob anestesia. Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento.
3. Desinfecção de pele alternada para o membro inferior direito com solução desinfetante de iodóforo e álcool a 75% antes da injeção. Toque um cotonete embebido em solução desinfetante iodóforo no centro da pele da extremidade inferior e aplique em um movimento circular para fora. Repita com um cotonete embebido em etanol.
4. Estabelecer modelos de lesão muscular esquelética de acordo com o método de^{referência24}. Injete notexina em apenas uma perna (para evitar a injeção dupla de notexina). Extrair 200 μL de solução de notexina (10 μg/ml de solução de notexina preparada adicionando 100 μg de notexina a 10 ml de solução salina normal num tubo de centrífuga de 15 ml) numa seringa de 1 ml com uma agulha de 30G e injectar a solução de notexina por via intramuscular no músculo gastrocnêmio para produzir lesão muscular.
5. Injete a notexina lentamente e aguarde 3 s antes de retirar a agulha (a ser totalmente injetada).
   CUIDADO: Notexin é um produto químico tóxico que requer lavagem imediata com muita água em contato com uma ferida aberta e atenção médica imediata, se necessário.
6. Injetar nos ratos do grupo controle 200 μL de solução salina. Mova ratos anestesiados para gaiolas vazias com roupa de cama limpa. Tome cuidado para remover o acolchoamento ao redor do nariz e da boca dos ratos para manter sua respiração clara. Observe visualmente a cor do tecido e a frequência respiratória no final da injeção até que os ratos recuperem a consciência suficiente.
7. Retorne os ratos para a gaiola doméstica e normalmente crie-os por 24 horas.

3. Terapia Tuina

1. Colocar um rato SD em decúbito ventral com a cabeça coberta com um pano preto sobre a plataforma experimental desinfetada com álcool a 75% para expor o músculo gastrocnêmio. Não cubra com muita força.
2. Usando o massageador Tuina para o grupo NTX+Tuina: Segure o massageador e coloque o rolo no músculo gastrocnêmio do rato e role para frente até que a mola entre em contato com o defletor limite. Em seguida, retrair a força e retornar à sua posição original, retribuindo assim o movimento (Figura 3).
3. Enrole o massageador a uma velocidade de 140 rolos por minuto e execute cada operação por 3 min. Realizar as massagens uma vez pela manhã e uma vez à tarde por 3 dias consecutivos.
4. Retornar os ratos à gaiola domiciliar após cada tratamento e permanecer em jejum por 8 h após o último tratamento.

4. Coleta de sangue e tecidos de ratos após o experimento

1. De acordo com os requisitos do comitê de ética em experimentação animal relevante, anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% (40 mg/kg, injeção intraperitoneal). Confirme a anestesia adequada pela resposta de pinça dos dedos. Eutanásia de ratos por sangria da aorta abdominal após coleta de sangue.
2. Desinfeção alternada da pele com solução desinfetante de iodóforo e álcool a 75% antes da injeção. Toque um cotonete embebido em iodopovidona no centro da pele abdominal e aplique em um movimento circular para fora. Repita com um cotonete embebido em etanol. Repita a desinfecção 3x.
3. Peça ao assistente para usar dois hemostáticos para levantar a pele no meio do abdômen. Como operador, use um bisturi para cortar a pele abdominal e os músculos da rafe até a sínfise púbica.
4. Após a abertura da cavidade abdominal, separe o intestino com bolas de algodão estéreis para expor a aorta abdominal na parede abdominal posterior.
5. Localize a aorta abdominal, pegue 5 mL de sangue de rato em tubos de coleta de sangue e obtenha o plasma em 1,5 microtubos centrifugando a 3000 x g por 10 min após o sangue em pé por 1 h. Conservar plasma a -80 °C.
6. Cortar a pele com tesoura cirúrgica ao longo da abertura abdominal inferior em direção à face lateral do membro inferior direito, expondo os músculos do membro inferior, e após separar cuidadosamente a fáscia com pinças, cortar o bisturi para remover o músculo gastrocnêmio intacto.
7. Lave o músculo gastrocnêmio em soro fisiológico estéril para remover pelos e sangue aderentes.
8. Colocar o músculo gastrocnêmio removido em um tubo centrífugo de 15 mL contendo paraformaldeído a 4%.

5. Detecção dos níveis plasmáticos de CK e FABP 3 por ELISA

1. Calcular e determinar o número de placas pré-embaladas necessárias para um experimento. Remova as placas necessárias, coloque-as na estrutura de 96 poços, coloque as microplacas restantes de volta no saco de folha de alumínio para vedação e armazene-as a 4 °C.
2. Equilibrar os kits e as amostras à temperatura ambiente (25-28 °C) durante 120 min, equilibrar-se totalmente à temperatura ambiente.
   NOTA: O equilíbrio do kit e da amostra é crítico e deve ser equilibrado em tempo suficiente.
3. Defina poços padrão, de amostra e em branco. Adicionar 50 μL do padrão CK ou FABP3 em diferentes concentrações (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 0 ng/mL) aos poços padrão. Repita cada padrão uma vez, ocupando um total de 12 poços.
4. Encher os poços de amostra com 40 μL de diluente da amostra (0,8 g NaCl, 0,02 g KH 2 PO 4, 0,29 g Na 2HPO 4 12H₂O, 0,02 g KCl, 0,01 g NaN₃em 100 mL de água bidestilada, pH_7,4), seguido de 10 μL da amostra a ser testada. Repita cada amostra uma vez, ocupando 48 poços no total.
5. Com exceção dos poços em branco localizados dois poços atrás do último poço de amostra, adicione 100 μL de anticorpo anti-humano CK ou FABP3 marcado com HRP (anticorpo marcado com enzima) a cada padrão e poço de amostra.
6. Selar os poços com filme de vedação e incubar em banho-maria ou termostato a 37 °C por 60 min.
7. Descarte o líquido, seque em papel absorvente, encha cada poço com líquido de lavagem, deixe por 20 s, sacuda o líquido de lavagem, seque em papel mata-borrão e repita lavando o prato 5x (ou use uma lavadora de placas).
8. Adicionar 50 μL de solução cromógena A (20 mg de tetrametilbenzidina, 10 mL de etanol em 100 mL de água bidestilada) e 50 μL de solução cromógena B (0,1 M/L de ácido cítrico, 0,2 M/L de tampão dihidrogenofosfato de sódio, pH 5,0-5,4) a cada poço. Manter longe da luz durante 15 minutos a 37 °C.
9. Para poços padrão, poços de amostra e poços em branco, adicione 50 μL de solução de terminação a cada poço e meça o valor de densidade óptica de cada poço a 450 nm dentro de 15 min.

6. Análise histológica da lesão do músculo gastrocnêmio induzida pela anotoxina em ratos

1. Preparar cortes de parafina de 5 μm de espessura corados com hematoxilina e eosina para exame microscópico de luz, conforme descrito em²⁵.

7. Processamento de imagens e análise de dados

1. Leia e analise as imagens capturadas pelo sistema de imagem com um software de análise. Mova o campo de visão da imagem selecionada para o centro da tela com o mouse, clique em 40x e, em seguida, clique em Tirar Instantâneo.
2. Registrar os valores de DO do ELISA em uma planilha eletrônica e calcular os níveis de CK e FABP3 do rato nas amostras usando a curva padrão.
3. Utilizar software de análise estatística para as análises estatísticas. Expresse as medidas como média ± desvio padrão (), e analise as comparações entre os grupos por ANOVA one-way, com o teste LSD quando a variância foi uniforme e o método Tamhane T2 quando a variância não foi uniforme. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando um valor de p menor que 0,05.

Resultados

A fim de observar as propriedades morfológicas do músculo esquelético de ratos após a lesão, o músculo gastrocnêmio foi corado com hematoxilina e eosina, e as imagens coradas foram lidas com um software de análise conforme descrito no protocolo para 8 ratos por grupo. Em ratos com lesão do músculo gastrocnêmio induzida por notexina (grupo NTX), muitas células musculares estavam rompidas, atróficas, necróticas e dispostas irregularmente. Havia também alta infiltração de neutrófilos e linfócitos ao redor...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para Tuina no tratamento da lesão muscular esquelética em ratos e, em seguida, analisamos o grau de lesão muscular esquelética após o tratamento para verificar a eficácia do método. Notadamente, modelos de lesão muscular esquelética de ratos, incluindo, mas não se limitando a, indução de drogas (notaxina, bupivacaína)16, contusão contusa ²⁶, esmagamento 27 e isquemia-reperfusão²⁸, podem ser intervencionados com Tuina.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 microtubes	Servicebio	EP-150X-J
15 mL centrifuge tube	Servicebio	EP-1501-J
30G needle	CONPUVON	220318
5 mL blood collection tube	Servicebio	QX0023
Acrylic handle	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Adjustment splint	CREROMEM	20220729
Cotton Swab	INOHV	22080215
Enzyme-labeled Instrument	Rayto	RT-6100
Ethanol	INOHV	211106
Fork holder	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Hair removal cream	Veet, France	LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set	Wuhan Google Biotech	G1005
Imaging system	Nikon, Japan	Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution	Hale&Hearty	20221205
Light microscope	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100
Limit baffle	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodium	Merck KGaA	P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Rubber roller	Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd	202207
Screw	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley rats	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Spring	Bingzhang Hardware	TH001
Surgical blade	Covetrus	#23
Weigh controller	Iyoys	HY-XSQ