טרופומודולין 3 ביטוי יתר כסמן לעמידות פלטינום וחדירה חיסונית בסרטן השחלות

Summary

טרופומודולין 3 (TMOD3) נחקר יותר ויותר בגידולים בשנים האחרונות. מחקר זה הוא הראשון לדווח כי TMOD3 מתבטא מאוד בסרטן השחלות והוא קשור קשר הדוק עם עמידות לפלטינה וחדירה חיסונית. תוצאות אלה עשויות לסייע בשיפור התוצאות הטיפוליות לסרטן השחלות.

Abstract

השלד ממלא תפקיד חשוב בעמידות לפלטינה בסרטן השחלות. טרופומודולין 3 (TMOD3) הוא קריטי בהתפתחות גידולים רבים, אך תפקידו בעמידות לתרופות של סרטן השחלות עדיין לא נחקר. על ידי ניתוח נתונים ממאגרי המידע Gene Expression Omnibus (GEO), The Cancer Genome Atlas (TCGA) ו-Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC), מחקר זה השווה את ביטוי TMOD3 בסרטן השחלות וברקמות נורמליות, ובחן את הביטוי של TMOD3 לאחר טיפול בפלטינה בסרטן שחלות רגיש לפלטינום ועמיד לפלטינה. שיטת קפלן-מאייר שימשה להערכת ההשפעה של TMOD3 על הישרדות כוללת (OS) והישרדות ללא התקדמות (PFS) בחולות סרטן השחלות. מיקרו-רנ"א (miRNAs) המכוונים ל-TMOD3 נחזו באמצעות TargetScan ונותחו באמצעות מסד הנתונים TCGA. Tumor Immune Estimation Resource (TIMER) ופורטל מאגר משולב לאינטראקציות בין גידולים למערכת החיסון (TISIDB) שימשו כדי לקבוע את הקשר בין ביטוי TMOD3 לבין חדירה חיסונית. רשתות ביטוי משותף TMOD3 בסרטן השחלות נחקרו באמצעות LinkedOmics, כלי החיפוש לאחזור גנים/חלבונים באינטראקציה (STRING), ומסד הנתונים לביאור, ויזואליזציה וגילוי משולב (DAVID) ביואינפורמטיקה. התוצאות הראו כי TMOD3 התבטא מאוד בסרטן השחלות והיה קשור לדירוג, היערכות וגרורות של סרטן השחלות. ביטוי TMOD3 הופחת באופן משמעותי בתאי סרטן שחלות שטופלו בפלטינה ובמטופלות. עם זאת, ביטוי TMOD3 היה גבוה יותר בתאי סרטן שחלות עמידים לפלטינום וברקמות בהשוואה לתאים רגישים לפלטינה. ביטוי TMOD3 גבוה יותר היה קשור באופן מובהק עם מערכת הפעלה נמוכה יותר ו- PFS בחולות סרטן השחלות שטופלו בכימותרפיה מבוססת פלטינה. ויסות לאחר שעתוק בתיווך miRNA אחראי ככל הנראה לביטוי TMOD3 גבוה בסרטן השחלות וברקמות שחלה עמידות לפלטינה. הביטוי של TMOD3 mRNA היה קשור לחדירה חיסונית בסרטן השחלות. ממצאים אלה מצביעים על כך ש- TMOD3 מתבטא מאוד בסרטן השחלות וקשור קשר הדוק עם עמידות לפלטינה וחדירה חיסונית.

Introduction

סרטן השחלות הוא השני בגובהו בשיעור התמותה מגידולים גינקולוגיים בעולם¹. ניתן לסווג אותו לשלושה סוגים המבוססים על היסטופתולוגיה: תאי נבט, גידולים מזנכימליים גונדליים וגידולי אפיתל, מתוכם 90% מהחולים הם סרטן שחלות אפיתליאלי. גורמי סיכון הקשורים לסרטן השחלות כוללים ביוץ מתמשך, חשיפה מוגברת לגונדוטרופין וציטוקינים דלקתיים². יותר מ -75% ממקרי סרטן השחלות אינם מתגלים עד לשלבים מתקדמים, וכתוצאה מכך אין להם טיפול יעיל. לחולות עם סרטן שחלות מתקדם יש פרוגנוזה גרועה, עם פחות מ -20% משיעור ההישרדות של 5 שנים למרות משטרי כימותרפיה חדשים, כגון מתן תוך צפקי וטיפול ממוקד. הטיפול המקובל בסרטן השחלות מורכב בעיקר מניתוח כריתת הגידול ואחריו כימותרפיה עם תרופות כגון פלטינה ופקליטקסל. עם זאת, הישנות הגידול מתרחשת בכ -70% מהמקרים¹. Cisplatin מפעילה את ההשפעות הטיפוליות שלה על ידי הפרעה לשכפול DNA ושעתוק והוא כיום סוכן הקו הראשון בכימותרפיה סרטן השחלות. עם זאת, חלק ניכר מחולות סרטן השחלות עמידות לפלטינום³. תהליכים תאיים מרובים, כגון אפלוקס תרופתי, ניקוי רעלים תאי, תיקון DNA, אפופטוזיס ואוטופגיה, הם קריטיים בעמידות לפלטינה בתאי סרטן השחלות ^4,5,6.

השינוי בשלד הציטו-שלד הוא מנגנון חשוב המשפיע על עמידות הפלטינה בסרטן השחלות. לאחרונה דווח כי גנים הקשורים לשלד מתבטאים בדרך כלל באופן חריג, ושלד האקטין משתנה באופן משמעותי בנוכחות אפופטוזיס⁷ המופעל על ידי ציספלטין. מחקרים רבים הראו כי ציספלטין מווסת את הננומכניקה של תאי סרטן השחלות. קשיחות התאים של תאים רגישים עולה עם מינון פלטינה, בעיקר תרם על ידי שיבוש פילמור אקטין . לעומת זאת, תאים עמידים לציספלטין לא הראו שינוי משמעותי בנוקשות התאים לאחר טיפול בציספלטין⁸. יתר על כן, המודולים של יאנג של תאי סרטן השחלות הרגישים לציספלטין היו נמוכים יותר, כפי שנחשף במיקרוסקופ כוח אטומי. לעומת זאת, תאי סרטן שחלות עמידים לציספלטין מציגים שלד ציטוספלטון המאופיין בסיבי עקה ארוכים של אקטין (actin). עיכוב Rho GTPase מפחית נוקשות ומגביר את הרגישות לציספלטין בתאים עמידים אלה. לעומת זאת, הפעלת Rho GTPase בתאים רגישים לציספלטין, מגבירה את קשיחות התאים ומפחיתה את רגישותם לציספלטין⁹. החלבון קושר RNA עם שחבור מרובה (RBPMS), גן מדכא גידולים, מפחית עמידות לציספלטין בתאי סרטן השחלות על ידי ויסות ביטוי החלבון של רשת השלד הציטו-שלד ושמירה על שלמות התא¹⁰. סיבי עקה של אקטין בולטים יותר בתאי A2780/CP בהשוואה לתאי A2780. התפתחות עמידות לתרופות בתאי סרטן השחלות גורמת לארגון מחדש נרחב של שלד האקטין ובכך משפיעה על התכונות המכניות של התא, על תנועתיות ועל הובלת תרופות תוך תאיות¹¹.

TMOD3 הוא חלבון ציטושלד-רגולטורי המונע דה-פולימריזציה של אקטין על ידי סגירת הקצוות הגדלים לאט (מחודדים) של חוטי אקטין¹². TMOD3 ממלא תפקידים שונים בסוגי תאים שונים על ידי ויסות דינמיקת אקטין ומשתתף בתהליכים שונים, כגון קידום צורת התא, נדידת תאים והתכווצות שרירים. הוכח כי מחיקת TMOD3 בעכברים מובילה למוות עוברי ב-E14.5-E18.5, דבר המצביע על כך ש-TMOD3 עשוי להיות גורם קריטי בהתפתחות עוברית¹³. בהתבסס על תפקידיו הביולוגיים בתאי גזע ותאי אב, TMOD3 עשוי למלא תפקיד חיוני בהתקדמות הגידול. בקרצינומה הפטוצלולרית, TMOD3 מקדם את הצמיחה, הפלישה והנדידה של תאי קרצינומה הפטוצלולרית על ידי הפעלת מסלול האיתות MAPK/ERK¹⁴ ומקדם גרורות מרוחקות על ידי הפעלת מסלול PI3K-AKT באמצעות אינטראקציה עם קולטן גורם גדילה אפידרמיס¹⁵. MiRNA-490-3p מעכב התפשטות ופלישה של תאי קרצינומה הפטוצלולרית על ידי התמקדות ב- TMOD3¹⁶. MiR-145 משפר את הרגישות לקרינה של סרטן ריאות תאים לא קטנים עמיד לקרינה על ידי עיכוב TMOD3¹⁷. ניסויים במבחנה גילו כי TMOD3 תיווך את הפלישה של תאי סרטן הוושט על ידי ויסות השלד הציטו-שלד באמצעות אינטראקציה עם ליזיל אוקסידאז הומולוג 2 (LOXL2)¹⁸. בנוסף, ניתוח פרוטאומי גילה כי ביטוי גבוה של TMOD3 עשוי לתווך עמידות לכימותרפיה אטופוזידית בסרטן ריאות דרך מסלול אפופטוטי¹⁹. למרות ש- TMOD3 נחקר יותר ויותר בגידולים בשנים האחרונות, עדיין אין דיווחים על תפקידו של TMOD3 בסרטן השחלות ובכימותרפיה.

מחקר זה מצא כי TMOD3 הוא upregulated בסרטן השחלות. יש לציין כי הרגולציה של TMOD3 הייתה קשורה להתנגדות פלטינה. מחקר זה העריך גם את הערך הפרוגנוסטי של TMOD3 בסרטן השחלות ואת הקשר שלו עם חדירת מערכת החיסון של הגידול. מחקר זה מצביע על כך שביטוי יתר של TMOD3 בסרטן השחלות קשור לעמידות לפלטינה.

Protocol

1. אומניבוס ביטוי גנים (GEO)

הערה: ביטוי TMOD3 בסרטן השחלות, בסרטן השחלות שטופל בתרופות פלטינה, ובסרטן שחלות עמיד לתרופות נגזר ממאגרי הנתונים של GEO. סוג המחקר של כל מערכי הנתונים היה פרופיל ביטוי לפי מערך, והאורגניזמים היו הומו ספיינס.

1. עבור אל מסד הנתונים של GEO (ראה טבלת חומרים), והזן מילות מפתח כגון TMOD3, סרטן השחלות, עמידות לתרופות או גישה לנתונים בתיבת החיפוש (ראה איור משלים 1A).
2. חלק נתונים לקבוצות שונות בתיבה הגדר קבוצה . בתפריט האפשרויות , בחרו Benjamini and Hochberg (שיעור גילוי שגוי) בתיבה Apply adjustment to the P-values , ולאחר מכן לחצו על Analyzed בתפריט GEO2R . לחץ על הורד את הטבלה המלאה כדי לקבל את התוצאות.
3. חקור והתווה את הנתונים שהורדו באמצעות תוכנת גרפים וסטטיסטיקה (ראה איור משלים 1B).
4. השתמש במבחן t לא משויך להשוואה בין שתי קבוצות.

2. TNMplot

הערה: TNMplot משתמשת בנתוני RNA-seq מאטלס גנום הסרטן (TCGA), מחקר טיפולי ליצירת טיפולים יעילים (TARGET) ומאגרי ביטוי רקמות גנוטיפ (GTEx)²⁰. הביטוי של TMOD3 ברקמות שחלות תקינות ובסרטן השחלות נותח באמצעות TNMplot.

1. עבור אל כלי האינטרנט TNMplot (ראה טבלת חומרים), ולחץ על השוואת גידול ונורמלי.
2. הכנס את TMOD3 בתיבה בחר גן , ובחר ציסטאדנוקרצינומה של השחלות בתיבה בחר רקמות .
3. לחץ על התחל ניתוח כדי לקבל את התוצאות (ראה איור משלים 1C).

3. UALCAN

הערה: פורטל ניתוח הנתונים של אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם CANcer (UALCAN) הוא משאב מקוון ידידותי למשתמש לניתוח נתוני סרטן הזמינים לציבור²¹. ביטוי רמת החלבון של TMOD3 ברקמה נורמלית ובסרטן השחלות בנתוני CPTAC נותח באמצעות UALCAN.

1. עבור אל UALCAN (ראה טבלת חומרים) ולחץ על תפריט פרוטאומיקה .
2. הכנס TMOD3 בתיבה הזן שמות גנים ובחר סרטן השחלות בתיבה ערכת הנתונים CPTAC .
3. לחצו על 'חקור ' כדי לקבל את התוצאות (ראו איור משלים 1D).

4. ניתוח פרוגנוסטי של KM-plotter

הערה: הערך הפרוגנוסטי של TMOD3 בסרטן השחלות נותח באמצעות פלוטר קפלן מאייר (KM-plotter), כולל הישרדות כוללת (OS) והישרדות ללא התקדמות (PFS)²².

1. עבור אל KM-plotter (ראה טבלת חומרים), ולחץ על התחל KM-plotter עבור סרטן השחלות.
2. הוסף TMOD3 בתיבה מזהה אפי / סמל גן .
3. בחר אוטומטי בחר את החיתוך הטוב ביותר בתיבה פצל חולים לפי תיבה.
4. בחר מכיל פלטין באפשרות כימותרפיה בעת ביצוע ניתוח פרוגנוזה לחולי כימותרפיה מבוססת פלטינה.
5. בחר TCGA תחת השתמש בערכות הנתונים הבאות עבור תיבת הניתוח .
6. לחצו על שרטוט תרשים קפלן-מאייר כדי לקבל את התוצאות (ראו תרשים משלים 2).

5. פלוטר ROC

הערה: Receiver Operating Typical Curve (ROC) Plotter שימש לניתוח הביטוי של TMOD3 בחולים עמידים או רגישים לכימותרפיה מבוססת פלטינום ומאפשר אימות של הגן המעוניין כסמן מנבא על ידי עקומות ROC. מערכי הנתונים של פלוטר ROC ברמת התמלול הם בעיקר ממאגרי המידע TCGA ו- GEO ומכילים נתוני טיפול ותגובה מ- 1816 חולות סרטן שחלות²³.

1. עבור אל ROC Plotter (ראה טבלת חומרים), ולחץ על ROC plotter עבור סרטן השחלות.
2. הוסף TMOD3 בתיבה סמל גן .
3. בחר הישרדות ללא הישנות לאחר 6 חודשים בתיבה מגיב, ובחר פלטין בתיבה טיפול .
4. לחץ על חשב כדי לקבל את התוצאות (ראה איור משלים 3).

6. ניתוח mRNA-miRNA

הערה: ה-miRNA המכוון ל-TMOD3 נחזה על-ידי TargetScan²⁴, ולאחר מכן המתאם של TMOD3 עם miRNA אלה במערך הנתונים של סרטן השחלות TCGA נותח על-ידי cBioportal²⁵. לאחר מכן, התוצאה לעיל הודגמה על ידי Cytoscape²⁶. ביטוי MiRNA בחולות סרטן שחלות רגישות לציספלטין ועמידות לתרופות נותח על ידי LinkedOmics²⁷.

1. עבור אל TargetScan (ראה טבלת חומרים), והכנס TMOD3 בתיבה הזן סמל גן אנושי (ראה איור משלים 4A).
2. עבור אל cBioportal (ראה טבלת חומרים).
3. בחר ערכת נתונים של Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) והוסף סמלי TMOD3 ו - miRNA בתיבה הזן גנים .
4. לחץ על שלח שאילתה כדי לקבל את נתוני המתאם של TMOD3 עם miRNA בערכת הנתונים של סרטן השחלות TCGA (ראה איור משלים 4B), ולאחר מכן הצג את התוצאה באופן חזותי על-ידי Cytoscape (ראה טבלת חומרים) (ראה איור משלים 4C).
5. עבור אל LinkedOmics (ראה טבלת חומרים) ובחר TCGA_OV קבוצה לדוגמה .
6. בחר קליני בתיבה בחר ערכת נתונים של חיפוש , ובחר מצב פלטינה בתיבה בחר ערכת נתונים של חיפוש .
7. בחר miRNASeq בתיבה Select Target Dataset ובחר t-test בשיטה סטטיסטית נבחרת.
8. לחץ על שלח שאילתה כדי לקבל את התוצאות (ראה איור משלים 4D).

7. ניתוח חדירה חיסונית

הערה: מסד הנתונים של אטלס החלבונים האנושי (HPA) שימש לניתוח התפלגות TMOD3 בתאי חיסון שונים. TIMER הוא מסד נתונים מקוון נוח המנתח חדירה חיסונית הקשורה למספר סוגי סרטן²⁸. מחקר זה השתמש ב-TIMER כדי לנתח את הקשר בין ביטוי TMOD3 mRNA לבין טוהר סרטן השחלות, וחדירת תאי מערכת החיסון. TISIDB הוא פורטל מקוון לאינטראקציות גידול-מערכת החיסון²⁹. מחקר זה השתמש ב- TISIDB כדי לקבוע את הקשר בין TMOD3 ואימונומודולטורים בסרטן השחלות.

1. עבור אל HPA (ראה טבלת חומרים), והכנס TMOD3 בתיבת החיפוש ולאחר מכן קבל את התוצאה.
2. בחר חיסון כדי להראות את ההתפלגות של TMOD3 בתאי חיסון שונים (ראה איור משלים 5A).
3. עבור אל TIMER (ראה טבלת חומרים) והוסף TMOD3 בתיבה סמל גן .
4. בחר OV בתיבה סוגי סרטן ולחץ על שלח כדי לקבל את התוצאה (ראה איור משלים 5B).
5. עבור אל TISIDB (ראה טבלת חומרים) והכנס TMOD3 בתיבה סמל גן .
6. לחץ על שלח כדי לקבל את התוצאה (ראה איור משלים 5C).

8. רשתות ביטוי TMOD3 בסרטן השחלות

הערה: גנים המבוטאים יחד עם TMOD3 נותחו על ידי LinkedOmics, וגנים TOP50 הוצגו על ידי מפות חום. גנים המקיימים אינטראקציה עם TMOD3 נחזו על ידי STRING³⁰. לאחר מכן, הגנים החופפים הוצגו על ידי דיאגרמת Venn. הגנים החופפים הוסברו באופן פונקציונלי על ידי DAVID³¹עבור תהליכים ביולוגיים של אונטולוגיה גנטית (GO-BP), רכיב תאי של אונטולוגיה גנטית (GO-CC), תפקוד מולקולרי של אונטולוגיה גנטית (GO-MF) ואנציקלופדיה של גנים וגנומים של קיוטו (KEGG).

1. עבור אל LinkedOmics, ובחר TCGA_OV קבוצה לדוגמה.
2. בחר RNAseq בתיבה בחר ערכת נתונים לחיפוש ובתיבה בחר ערכת נתוני יעד.
3. לחץ על שלח שאילתה כדי לקבל את התוצאות של גנים המבוטאים יחד עם TMOD3.
4. עבור אל STRING (ראה טבלת חומרים), והכנס TMOD3 בתיבה שם חלבון .
5. בחרו הומו ספיינס בתיבה אורגניזמים ולחצו על חיפוש כדי לקבל את התוצאה (ראו איור משלים 6).
6. עבור אל דוד (ראה טבלת חומרים).
7. הוסף את הגנים החופפים בתיבה הזן רשימת גנים ובחר ENSEMBL _GENE_SYMBOL בתיבה Select Identifier .
8. לחץ על שלח רשימה כדי לקבל את התוצאות (ראה תרשים משלים 7).

9. מסד נתונים CTD

הערה: מסד הנתונים של CTD הוא כלי חדשני לניתוח היחסים בין כימיה, גנים, פנוטיפים, מחלות והסביבה³². מסד הנתונים של CTD חוזה תרופות המכוונות ל- TMOD3. מסד הנתונים PubChem משמש לאחר מכן כדי לקבוע את המבנה המולקולרי הסופי של התרופה.

1. עבור אל מסד הנתונים של CTD (ראה רשימת חומרים) ובחר שאילתת אינטראקציה כימית - גנים בתפריט החיפוש .
2. הכנס TMOD3 בתיבה GENE , ולחץ על חיפוש כדי לקבל את התוצאות (ראה איור משלים 8).
3. עבור אל מסד הנתונים של PubChem (ראה טבלת חומרים) והכנס תרופות בתיבת החיפוש כדי לקבל את התוצאות (ראה תרשים משלים 9).

תוצאות

ביטוי TMOD3 בסרטן השחלות
ראשית, מסד הנתונים GEO הראה שרמות ביטוי ה-mRNA של TMOD3 היו גבוהות יותר במערכי נתונים של מיקרו-מערכים GSE51088 ו-GSE66957 (איור 1A,B). TMOD3 גם בא לידי ביטוי גבוה בסרטן השחלות בהשוואה לרקמות שחלות רגילות על ידי כלי האינטרנט TNMplot (

Discussion

השלד הציטו-שלד נחשב חיוני להתפתחות והתקדמות, טיפול ופרוגנוזה של גידולים שונים⁵². בהשוואה ל- TMOD1, המוגבל לאריתרוציטים ולמערכת הלב וכלי הדם⁵³, ול- TMOD2, המוגבל למערכת העצבים⁵⁴, ל- TMOD3 יש התפלגות בכל מקום, מה שהופך את המחקר של TMOD3 בגידולים מער?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
cBioportal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center		Correlation analysis of  TMOD3 with targeted miRNAs (https://www.cbioportal.org)
CTD database	North Carolina State University		To analyze the relationships between chemistry, genes, phenotype, disease, and environment (https://ctdbase.org/)
Cytoscape	National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health		Network Data Integration, Analysis, and Visualization (www.cytoscape.org/)
DAVID	Frederick National Laboratory for Cancer Research		A comprehensive set of functional annotation tools for investigators to understand the biological meaning behind large lists of genes(https://david.ncifcrf.gov/)
GEO	NCBI		Gene expression analysis (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )
HPA	Knut & Alice Wallenberg foundation		The Human Protein Atlas (HPA) database helped analyze the distribution of TMOD3 in various immune cells (https://www.proteinatlas.org/)
KM-plotter	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Prognostic Analysis (https://kmplot.com/analysis/)
LinkedOmics	Baylor College of Medicine		A platform for biologists and clinicians to access, analyze and compare cancer multi-omics data within and across tumor types (http://www.linkedomics.org/)
PubChem database	U.S. National Library of Medicine		To determine the definitive molecular structure of the drug
ROC Plotter	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Validation of the interest gene as a predictive marker (http://www.rocplot.org/)
STRING	Swiss Institute of Bioinformatics		Coexpression networks analysis(https://string-db.org)
TargetScan	Whitehead Institute for Biomedical Research		Prediction of miRNA targets (www.targetscan.org/)
TIMER	Harvard University		Systematical analysis of immune infiltrates across diverse cancer types (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)
TISIDB	The University of Hong Kong		A web portal for tumor and immune system interaction(http://cis.hku.hk/TISIDB/)
TNMplot	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Gene expression analysis (https://www.tnmplot.com/ )
UALCAN	The University of ALabama at Birmingham		Gene expression analysis (http://ualcan.path.uab.edu)