난소암에서 백금 저항성 및 면역 침윤에 대한 마커로서의 트로포모듈린 3 과발현

요약

트로포모듈린 3(TMOD3)는 최근 몇 년 동안 종양에서 점점 더 많이 연구되고 있습니다. 이번 연구는 TMOD3가 난소암에서 많이 발현되며 백금 저항성 및 면역 침윤과 밀접한 관련이 있음을 보고한 최초의 연구입니다. 이러한 결과는 난소암의 치료 결과를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.

초록

세포골격은 난소암의 백금 저항성에 중요한 역할을 합니다. 트로포모듈린 3(TMOD3)는 많은 종양의 발병에 중요하지만, 난소암의 약물 내성에 미치는 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다. 본 연구는 GEO(Gene Expression Omnibus), TCGA(The Cancer Genome Atlas), CPTAC(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium) 데이터베이스의 데이터를 분석하여 난소암과 정상조직에서 TMOD3 발현을 비교하고, 백금 민감성 및 백금 저항성 난소암에서 백금 치료 후 TMOD3의 발현을 조사하였다. Kaplan-Meier 방법은 난소암 환자의 전체 생존(OS) 및 무진행 생존(PFS)에 대한 TMOD3의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. TMOD3를 표적으로 하는 microRNA(miRNA)는 TargetScan을 사용하여 예측하고 TCGA 데이터베이스를 사용하여 분석했습니다. TMOD3 발현과 면역 침윤 간의 관계를 결정하기 위해 TIMER(Tumor Immune Estimation Resource) 및 TISIDB(Integrated repository portal for tumor-immune system interactions)를 사용했습니다. 난소암의 TMOD3 공발현 네트워크는 LinkedOmics, STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) 및 The Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery(DAVID) Bioinformatics를 사용하여 탐색되었습니다. 그 결과, TMOD3는 난소암에서 많이 발현되며 난소암의 등급, 병기 및 전이와 관련이 있는 것으로 나타났다. TMOD3 발현은 백금 처리된 난소암 세포 및 환자에서 유의하게 감소하였다. 그러나 TMOD3 발현은 백금 내성 난소암 세포 및 조직에서 백금 민감성 세포에 비해 더 높았습니다. TMOD3 발현이 높을수록 백금 기반 화학요법으로 치료받은 난소암 환자에서 OS 및 PFS가 낮아지는 것으로 나타났습니다. miRNA 매개 전사 후 조절은 난소암 및 백금 내성 난소 조직에서 높은 TMOD3 발현의 원인이 될 수 있습니다. TMOD3 mRNA의 발현은 난소암의 면역 침윤과 관련이 있었습니다. 이러한 결과는 TMOD3가 난소암에서 많이 발현되며 백금 저항성 및 면역 침윤과 밀접한 관련이 있음을 나타냅니다.

서문

난소암은 전 세계 부인과 종양의 사망률에서 두 번째로 높습니다¹. 조직병리에 따라 생식세포, 생식선 중간엽, 상피종양의 3가지 유형으로 분류할 수 있으며, 이 중 환자의 90%가 상피난소암입니다. 난소암과 관련된 위험 요인으로는 지속적인 배란, 성선 자극 호르몬 노출 증가, 염증성 사이토카인^{등이 있다 2}. 난소암 사례의 75% 이상은 말기까지 발견되지 않아 효과적인 치료법이 부족합니다. 진행성 난소암 환자는 복강 내 투여 및 표적 치료와 같은 새로운 화학요법 요법에도 불구하고 5년 생존율이 20% 미만으로 예후가 좋지 않습니다. 난소암의 표준 치료는 주로 종양 절제 수술과 백금 및 파클리탁셀과 같은 약물을 사용한 화학 요법으로 구성됩니다. 그러나 약 70%의 증례에서 종양 재발이 발생한다¹. 시스플라틴은 DNA 복제와 전사를 방해하여 치료 효과를 발휘하며, 현재 난소암 화학요법의 1차 제제입니다. 그러나 난소암 환자의 상당수는 백금 내성을 가지고 있다³. 약물 유출, 세포 해독, DNA 복구, 세포 사멸 및 자가포식과 같은 여러 세포 과정은 난소암 세포의 백금 저항성에 중요합니다 ^4,5,6.

세포골격의 변화는 난소암에서 백금 저항성에 영향을 미치는 중요한 메커니즘입니다. 최근에는 세포골격 관련 유전자가 일반적으로 비정상적으로 발현되며, 시스플라틴에 의한 세포사멸(cisplatin-triggered apoptosis)이 있을 때 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)이 유의하게 변형된다는 것이 보고되었다⁷. 많은 연구에 따르면 시스플라틴은 난소암 세포의 나노 역학을 조절합니다. 민감한 세포의 세포 강성은 백금 용량에 따라 증가하며, 주로 액틴 중합 중단에 의해 발생합니다. 대조적으로, 시스플라틴 저항성 세포는 시스플라틴 처리 후 세포 경직도에 유의한 변화가 나타나지 않았다⁸. 더욱이, 시스플라틴 민감성 난소암 세포의 영률(Young's moduli)은 원자력 현미경에 의해 밝혀진 바와 같이 더 낮았다. 이와는 대조적으로, 시스플라틴 저항성 난소암 세포는 긴 액틴 스트레스 섬유를 특징으로 하는 세포골격을 나타냅니다. Rho GTPase를 억제하면 이러한 내성 세포에서 경직도가 감소하고 시스플라틴 민감도가 향상됩니다. 반대로, 시스플라틴 민감성 세포에서 Rho GTPase를 활성화하면 세포 경직도가 증가하고 시스플라틴⁹에 대한 민감도가 감소합니다. 종양 억제 유전자인 RBPMS(RNA-binding protein with multiple splicing)는 세포골격 네트워크의 단백질 발현을 조절하고 세포 무결성을 유지함으로써 난소암 세포의 시스플라틴 내성을 감소시킵니다¹⁰. 액틴 스트레스 섬유는 A2780 세포에 비해 A2780/CP 세포에서 더 두드러집니다. 난소암 세포에서 약물 내성의 발달은 액틴 세포골격의 광범위한 재편성을 유도하여 세포의 기계적 특성, 운동성 및 세포 내 약물 수송에 영향을 미친다¹¹.

TMOD3는 액틴 필라멘트의 느리게 성장하는(뾰족한) 말단을 캡핑하여 액틴의 해중합을 방지하는 세포골격 조절 단백질입니다¹². TMOD3는 액틴 역학을 조절하여 세포 유형에 따라 다양한 역할을 수행하며 세포 모양, 세포 이동 및 근육 수축 촉진과 같은 다양한 과정에 참여합니다. 마우스에서 TMOD3 결실은 E14.5-E18.5에서 배아 사망으로 이어지는 것으로 나타났으며, 이는 TMOD3가 배아 발달에 중요한 요인이 될 수 있음을 시사한다¹³. 줄기 세포와 전구 세포에서의 생물학적 기능을 기반으로 TMOD3는 종양 진행에 필수적인 역할을 할 수 있습니다. 간세포 암종에서 TMOD3는 MAPK/ERK 신호 경로(¹⁴ )를 활성화하여 간세포 암종 세포의 성장, 침습 및 이동을 촉진하고 표피 성장 인자 수용체⁽¹⁵)와의 상호 작용을 통해 PI3K-AKT 경로를 활성화하여 원격 전이를 촉진합니다. MiRNA-490-3p는 TMOD3를 표적으로 하여 간세포 암종 세포의 증식 및 침입을 억제합니다¹⁶. MiR-145는 TMOD3를 억제하여 방사선 내성 비소세포폐암의 방사선 민감도를 개선한다¹⁷. 시험관 내 실험에서 TMOD3가 lysyl oxidase homolog 2 (LOXL2) ¹⁸와의 상호 작용을 통해 세포 골격을 조절하여 식도암 세포의 침입을 매개하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한, 단백질체 분석을 통해 TMOD3의 높은 발현이 세포사멸 경로(apoptotic pathway¹⁹)를 통해 폐암에서 에토포시드 화학저항성을 잠재적으로 매개할 수 있음을 밝혔다. 최근 몇 년 동안 종양에서 TMOD3에 대한 연구가 증가하고 있지만, 난소암 및 화학요법에서 TMOD3의 역할에 대한 보고는 아직 없습니다.

이 연구는 TMOD3가 난소암에서 상향 조절된다는 것을 발견했다. 특히, TMOD3의 상향 조절은 백금 저항과 관련이 있었습니다. 이 연구는 또한 난소암에서 TMOD3의 예후 가치와 종양 면역 침윤과의 상관관계를 평가했습니다. 이 연구는 난소암에서 TMOD3의 과발현이 백금 저항성과 관련이 있음을 시사합니다.

프로토콜

1. 유전자 발현 옴니버스(GEO)

참고: 난소암, 백금 약물로 치료받은 난소암 및 약물 내성 난소암에서 TMOD3 발현은 GEO 데이터 세트에서 파생되었습니다. 모든 데이터셋의 연구 유형은 배열에 의한 발현 프로파일링이었고, 유기체는 호모 사피엔스(Homo sapiens)였다.

1. GEO 데이터베이스(재료 표 참조)로 이동하여 검색 상자에 TMOD3, 난소암, 약물 내성 또는 데이터 액세스와 같은 키워드를 입력합니다(보충 그림 1A 참조).
2. 그룹 정의 상자에서 데이터를 여러 그룹으로 나눕니다. 옵션 메뉴의 P-값에 조정 적용 상자에서 Benjamini 및 Hochberg(거짓 발견 비율)를 선택한 다음 GEO2R 메뉴에서 분석됨을 클릭합니다. download full table(전체 테이블 다운로드)을 클릭하여 결과를 얻으십시오.
3. 다운로드한 데이터를 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 조사하고 플롯합니다( 보충 그림 1B 참조).
4. 두 그룹 간의 비교를 위해 쌍을 이루지 않은 t-검정 을 사용합니다.

2. 티엔엠플롯

참고: TNMplot은 TCGA(The Cancer Genome Atlas), TARGET(Therapeutic Research to Generate Effective Treatments) 및 GTEx(Genotype-Tissue Expression) 저장소의 RNA-seq 데이터를 활용합니다²⁰. 정상 난소 조직과 난소암에서 TMOD3의 발현은 TNMplot을 이용하여 분석하였다.

1. TNMplot 웹 도구(재료 표 참조)로 이동하여 Compare Tumor and Normal(종양과 정상 비교)을 클릭합니다.
2. Choose a gene(유전자 선택) 상자에 TMOD3를 삽입하고 Choose tissue(조직 선택) 상자에서 Ovarian Serous Cystadenocarcinoma(난소 장액성 낭포선암종)를 선택합니다.
3. 분석 시작을 클릭하면 결과를 얻을 수 있습니다(보충 그림 1C 참조).

3. 우알칸

참고: 앨라배마 대학교 버밍엄 CANcer 데이터 분석 포털(UALCAN)은 공개적으로 사용 가능한 암 데이터를 분석하기 위한 사용자 친화적인 온라인 리소스입니다²¹. CPTAC 데이터에서 정상 조직 및 난소암에서 TMOD3의 단백질 수준 발현은 UALCAN을 사용하여 분석하였다.

1. UALCAN(재료 표 참조)으로 이동하여 Proteomics 메뉴를 클릭합니다.
2. 유전자 이름 입력 상자에 TMOD3를 삽입하고 CPTAC 데이터 세트 상자에서 난소암을 선택합니다.
3. Explore( 탐색 )를 클릭하여 결과를 확인합니다( 보충 그림 1D 참조).

4. KM-플로터 예후 분석

참고: 난소암에서 TMOD3의 예후 값은 전체 생존(OS) 및 무진행 생존(PFS)을 포함하여 Kaplan Meier 플로터(KM-플로터)를 사용하여 분석되었습니다²².

1. KM-플로터(재료 표 참조)로 이동하여 난소암에 대한 KM-플로터 시작을 클릭합니다.
2. Affy id/ Gene symbol 상자에 TMOD3를 삽입합니다.
3. 환자 분할 기준 상자에서 최상의 컷오프 자동 선택을 선택합니다.
4. 백금 기반 화학요법 환자에 대한 예후 분석을 수행할 때 화학요법 옵션에서 함유 플라틴을 선택하십시오.
5. 분석 상자의 다음 데이터셋 사용에서 TCGA를 선택합니다.
6. Draw Kaplan-Meier plot을 클릭하면 결과를 얻을 수 있습니다(보충 그림 2 참조).

5. ROC 플로터

참고: ROC(Receiver Operating Characteristic Curve) 플로터는 백금 기반 화학요법에 내성이 있거나 민감한 환자의 TMOD3 발현을 분석하는 데 사용되었으며 ROC 곡선에 의한 예측 마커로 관심 유전자를 검증할 수 있습니다. 트랜스크립톰 레벨에서 ROC 플로터의 데이터셋은 주로 TCGA 및 GEO 데이터베이스에서 가져온 것으로, 1816명의 난소암 환자의 치료 및 반응 데이터를 포함하고^{있다 23}.

1. ROC 플로터(재료 표 참조)로 이동하여 난소암에 대한 ROC 플로터를 클릭합니다.
2. 유전자 기호 상자에 TMOD3를 삽입합니다.
3. Responds(응답) 상자에서 Relapse-free survival at 6 months(6개월 내 재발 없는 생존)를 선택하고 Treatment(치료) 상자에서 Platin을 선택합니다.
4. Calculate(계산)를 클릭하여 결과를 확인합니다(보충 그림 3 참조).

6. mRNA-miRNA 분석

참고: TMOD3를 표적으로 하는 miRNA는 TargetScan²⁴에 의해 예측되었으며, 그런 다음 TCGA 난소암 데이터 세트에서 TMOD3와 이러한 miRNA의 상관관계를 cBioportal²⁵에 의해 분석했습니다. 그런 다음 위의 결과를 Cytoscape²⁶에 의해 시각화했습니다. 시스플라틴 민감성 및 약물 내성 난소암 환자에서 MiRNA 발현은 LinkedOmics²⁷에 의해 분석되었습니다.

1. TargetScan(재료 표 참조)으로 이동하여 인간 유전자 기호 입력 상자에 TMOD3를 삽입합니다(보충 그림 4A 참조).
2. cBioportal로 이동합니다(재료 표 참조).
3. Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) 데이터 세트를 선택하고 유전자 입력 상자에 TMOD3 및 miRNA 기호를 삽입합니다.
4. Submit Query를 클릭하여 TCGA 난소암 데이터 세트(보충 그림 4B 참조)에서 TMOD3와 miRNA의 상관 관계 데이터를 얻은 다음 Cytoscape(재료 표 참조)로 결과를 시각화합니다(보충 그림 4C 참조).
5. LinkedOmics(재료 목차 참조)로 이동하여 TCGA_OV Sample cohort를 선택합니다.
6. [Select Search Dataset] 상자에서 [clinical]을 선택하고 [Select Search Dataset Attribute] 상자에서 [platinum status]를 선택합니다.
7. Select Target Dataset(대상 데이터 세트 선택) 상자에서 miRNASeq를 선택하고 Select Statistical Method(통계 방법 선택)에서 t-test를 선택합니다.
8. Submit Query(쿼리 제출)를 클릭하여 결과를 얻습니다(보충 그림 4D 참조).

7. 면역 침투 분석

참고: HPA(Human Protein Atlas) 데이터베이스는 다양한 면역 세포에서 TMOD3의 분포를 분석하는 데 사용되었습니다. TIMER는 여러 암 유형과 관련된 면역 침윤을 분석하는 편리한 온라인 데이터베이스입니다²⁸. 이 연구는 TIMER를 사용하여 TMOD3 mRNA 발현과 난소암 순도 및 면역 세포 침윤 간의 관계를 분석했습니다. TISIDB는 종양-면역 체계 상호작용을 위한 온라인 포털이다²⁹. 이 연구는 난소암에서 TMOD3와 면역조절제의 상관관계를 확인하기 위해 TISIDB를 사용했습니다.

1. HPA(재료 표 참조)로 이동하여 검색 상자에 TMOD3를 삽입한 다음 결과를 가져옵니다.
2. 다양한 면역 세포에서 TMOD3의 분포를 보여주기 위해 Immune 을 선택합니다( 보충 그림 5A 참조).
3. TIMER로 이동하여(재료 표 참조) 유전자 기호 상자에 TMOD3를 삽입합니다.
4. 암 유형 상자에서 OV를 선택하고 제출을 클릭하여 결과를 얻습니다(보충 그림 5B 참조).
5. TISIDB(재료 표 참조)로 이동하여 유전자 기호 상자에 TMOD3를 삽입합니다.
6. Submit( 제출 )을 클릭하여 결과를 얻습니다( 보충 그림 5C 참조).

8. 난소암의 TMOD3 공발현 네트워크

참고: TMOD3와 동시 발현된 유전자는 LinkedOmics에 의해 분석되었으며, TOP50 유전자는 히트맵에 의해 표시되었습니다. TMOD3 상호작용 유전자는 STRING³⁰에 의해 예측하였다. 그런 다음 겹치는 유전자를 벤 다이어그램으로 표시했습니다. 겹치는 유전자는 DAVID³¹에 의해 유전자 온톨로지 생물학적 과정(GO-BP), 유전자 온톨로지 세포 구성 요소(GO-CC), 유전자 온톨로지 분자 기능(GO-MF) 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로에 대해 기능적으로 주석을 달았습니다.

1. LinkedOmics로 이동하여 TCGA_OV Sample cohort를 선택합니다.
2. 검색 데이터셋 선택 상자에서 RNAseq를 선택하고 대상 데이터셋 선택 상자에서 RNAseq를 선택합니다.
3. Submit Query를 클릭하면 TMOD3와 함께 발현된 유전자의 결과를 얻을 수 있습니다.
4. STRING(재료 표 참조)으로 이동하여 단백질 이름 상자에 TMOD3를 삽입합니다.
5. Organisms 상자에서 homo sapiens를 선택하고 검색을 클릭하여 결과를 얻습니다(보충 그림 6 참조).
6. DAVID로 이동합니다(재료 표 참조).
7. [유전자 목록 입력] 상자에 겹치는 유전자를 삽입하고 [식별자 선택] 상자에서 ENSEMBL _GENE_SYMBOL 선택합니다.
8. Submit List(목록 제출)를 클릭하여 결과를 확인합니다(보충 그림 7 참조).

9. CTD 데이터베이스

참고: CTD 데이터베이스는 화학, 유전자, 표현형, 질병 및 환경 간의 관계를 분석하는 새로운 도구입니다³². CTD 데이터베이스는 TMOD3를 표적으로 하는 약물을 예측합니다. 그런 다음 PubChem 데이터베이스를 사용하여 약물의 최종 분자 구조를 결정합니다.

1. CTD 데이터베이스(재료 표 참조)로 이동하여 검색 메뉴에서 Chemical - Gene Interaction Query를 선택합니다.
2. GENE 상자에 TMOD3를 삽입하고 검색을 클릭하여 결과를 얻습니다(보충 그림 8 참조).
3. PubChem 데이터베이스(재료 표 참조)로 이동하여 검색 상자에 약물을 삽입하여 결과를 얻습니다(보충 그림 9 참조).

결과

난소암에서의 TMOD3 발현
첫째, GEO 데이터베이스는 TMOD3의 mRNA 발현 수준이 마이크로어레이 데이터 세트 GSE51088 및 GSE66957에서 상승했음을 보여주었습니다(그림 1A, B). TMOD3는 또한 TNMplot 웹 도구에 의해 정상 난소 조직에 비해 난소암에서 높게 발현되었습니다(그림 1C). UALCAN 웹 도구로 CPTAC 데이터를 분?...

토론

세포골격은 다양한 종양의 발달과 진행, 치료 및 예후에 필수적인 것으로 간주되어 왔다⁵². 적혈구 및 심혈관계⁽⁵³)에 국한되는 TMOD1 및 신경계(⁵⁴)에 국한되는 TMOD2와 비교하여, TMOD3는 유비쿼터스 분포를 가지고 있어 전신 종양에서 TMOD3에 대한 연구가 더 인기가 있습니다 14,15,16,17,18,19

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
cBioportal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center		Correlation analysis of  TMOD3 with targeted miRNAs (https://www.cbioportal.org)
CTD database	North Carolina State University		To analyze the relationships between chemistry, genes, phenotype, disease, and environment (https://ctdbase.org/)
Cytoscape	National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health		Network Data Integration, Analysis, and Visualization (www.cytoscape.org/)
DAVID	Frederick National Laboratory for Cancer Research		A comprehensive set of functional annotation tools for investigators to understand the biological meaning behind large lists of genes(https://david.ncifcrf.gov/)
GEO	NCBI		Gene expression analysis (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )
HPA	Knut & Alice Wallenberg foundation		The Human Protein Atlas (HPA) database helped analyze the distribution of TMOD3 in various immune cells (https://www.proteinatlas.org/)
KM-plotter	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Prognostic Analysis (https://kmplot.com/analysis/)
LinkedOmics	Baylor College of Medicine		A platform for biologists and clinicians to access, analyze and compare cancer multi-omics data within and across tumor types (http://www.linkedomics.org/)
PubChem database	U.S. National Library of Medicine		To determine the definitive molecular structure of the drug
ROC Plotter	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Validation of the interest gene as a predictive marker (http://www.rocplot.org/)
STRING	Swiss Institute of Bioinformatics		Coexpression networks analysis(https://string-db.org)
TargetScan	Whitehead Institute for Biomedical Research		Prediction of miRNA targets (www.targetscan.org/)
TIMER	Harvard University		Systematical analysis of immune infiltrates across diverse cancer types (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)
TISIDB	The University of Hong Kong		A web portal for tumor and immune system interaction(http://cis.hku.hk/TISIDB/)
TNMplot	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Gene expression analysis (https://www.tnmplot.com/ )
UALCAN	The University of ALabama at Birmingham		Gene expression analysis (http://ualcan.path.uab.edu)