卵巣癌におけるプラチナ耐性および免疫浸潤のマーカーとしてのトロポモジュリン3過剰発現

要約

トロポモジュリン3(TMOD3)は、近年、腫瘍での研究が進んでいます。この研究は、TMOD3が卵巣がんで高発現し、プラチナ製剤耐性および免疫浸潤と密接に関連していることを報告した最初の研究です。これらの結果は、卵巣がんの治療結果の改善に役立つ可能性があります。

要約

細胞骨格は、卵巣がんにおけるプラチナ製剤耐性に重要な役割を果たしています。トロポモジュリン3(TMOD3)は、多くの腫瘍の発生に重要ですが、卵巣がんの薬剤耐性におけるその役割は未解明のままです。本研究では、Gene Expression Omnibus(GEO)、The Cancer Genome Atlas(TCGA)、Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium(CPTAC)のデータベースからのデータを解析することにより、卵巣がんと正常組織におけるTMOD3の発現を比較し、プラチナ製剤感受性卵巣がんとプラチナ製剤抵抗性卵巣がんにおけるプラチナ製剤治療後のTMOD3の発現を調べました。Kaplan-Meier法を使用して、卵巣がん患者の全生存期間(OS)および無増悪生存期間(PFS)に対するTMOD3の効果を評価しました。TargetScanを用いてTMOD3を標的とするmicroRNA(miRNA)を予測し、TCGAデータベースを用いて解析しました。Tumor Immune Estimation Resource(TIMER)および腫瘍免疫系相互作用の統合リポジトリポータル(TISIDB)を使用して、TMOD3発現と免疫浸潤との関係を決定しました。卵巣がんにおけるTMOD3共発現ネットワークは、LinkedOmics、Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins(STRING)、およびThe Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery(DAVID)バイオインフォマティクスを使用して調査されました。その結果、TMOD3は卵巣がんで高発現し、卵巣がんの等級付け、病期分類、転移と関連していることが示されました。TMOD3の発現は、プラチナ製剤で治療された卵巣がん細胞および患者で有意に減少しました。しかし、TMOD3の発現は、プラチナ製剤耐性卵巣がん細胞および組織において、プラチナ製剤感受性のものと比較して高かった。プラチナ製剤をベースとした化学療法で治療された卵巣がん患者では、TMOD3の発現が高いほどOSとPFSが低いと有意に関連していました。miRNAを介した転写後調節は、卵巣がんおよびプラチナ製剤耐性卵巣組織における高いTMOD3発現に関与している可能性があります。TMOD3 mRNAの発現は、卵巣がんにおける免疫浸潤と関連していました。これらの知見は、TMOD3が卵巣がんで高発現し、プラチナ製剤耐性および免疫浸潤と密接に関連していることを示しています。

概要

卵巣がんは、婦人科腫瘍の死亡率で世界で2番目に高いがんです¹。病理組織学に基づいて、生殖細胞、性腺間葉系、上皮性腫瘍の3つのタイプに分類でき、そのうち患者の90%が上皮性卵巣癌です。卵巣がんに関連する危険因子には、持続的な排卵、ゴナドトロピン曝露の増加、および炎症性サイトカインが含まれます²。卵巣がんの症例の75%以上は進行した病期まで発見されず、効果的な治療法がありません。進行卵巣がんの患者さんは予後が不良で、腹腔内投与や標的療法などの新たな化学療法レジメンにもかかわらず、5年生存率は20%未満です。卵巣がんの標準治療は、主に腫瘍切除手術とそれに続くプラチナ製剤やパクリタキセルなどの薬剤による化学療法です。しかし、腫瘍の再発は症例の約70%で発生します¹。シスプラチンは、DNAの複製と転写を妨害することにより治療効果を発揮し、現在、卵巣がん化学療法の第一選択薬です。しかし、卵巣がん患者のかなりの割合がプラチナ製剤耐性です³。薬物排出、細胞の解毒、DNA修復、アポトーシス、オートファジーなどの複数の細胞プロセスは、卵巣がん細胞のプラチナ耐性に重要です^4,5,6。

細胞骨格の変化は、卵巣がんにおけるプラチナ製剤耐性に影響を与える重要なメカニズムです。最近、細胞骨格関連遺伝子は通常異常に発現し、シスプラチン誘発性アポトーシスの存在下でアクチン細胞骨格が有意に修飾されることが報告されています⁷。多くの研究は、シスプラチンが卵巣癌細胞のナノ力学を調節することを示しています。感受性細胞の細胞剛性は、主にアクチン重合の破壊によって寄与される用量依存的に白金とともに増加します。対照的に、シスプラチン耐性細胞は、シスプラチン処理後に細胞硬さに大きな変化を示さなかった⁸。さらに、シスプラチン感受性卵巣癌細胞のヤング率は、原子間力顕微鏡によって明らかにされたように、より低かった。対照的に、シスプラチン耐性卵巣癌細胞は、長いアクチンストレス繊維を特徴とする細胞骨格を示します。Rho GTPaseを阻害すると、これらの耐性細胞の硬直が減少し、シスプラチン感受性が向上します。逆に、シスプラチン感受性細胞でRho GTPaseを活性化すると、細胞の硬直が増加し、シスプラチン⁹に対する感受性が低下します。腫瘍抑制遺伝子である多重スプライシング(RBPMS)によるRNA結合タンパク質は、細胞骨格ネットワークのタンパク質発現を調節し、細胞の完全性を維持することにより、卵巣癌細胞のシスプラチン耐性を低下させる¹⁰。アクチンストレスファイバーは、A2780細胞と比較してA2780/CP細胞でより顕著です。卵巣癌細胞における薬剤耐性の発現は、アクチン細胞骨格の広範な再編成を誘導し、それによって細胞の機械的特性、運動性、および細胞内薬物輸送に影響を与える¹¹。

TMOD3は、アクチンフィラメント¹²の増殖が遅い(尖った)末端をキャッピングすることにより、アクチンの解重合を防止する細胞骨格調節タンパク質である。TMOD3は、アクチンダイナミクスを調節することにより、細胞タイプごとに異なる役割を果たし、細胞形状の促進、細胞遊走、筋肉収縮などのさまざまなプロセスに関与しています。マウスのTMOD3欠失はE14.5-E18.5で胚死につながることが示され、TMOD3が胚発生における重要な因子である可能性が示唆された¹³。幹細胞および前駆細胞におけるその生物学的機能に基づいて、TMOD3は腫瘍の進行に不可欠な役割を果たす可能性があります。肝細胞癌では、TMOD3は、MAPK/ERKシグナル伝達経路¹⁴ を活性化することにより肝細胞癌細胞の増殖、浸潤、および遊走を促進し、上皮成長因子受容体¹⁵との相互作用を通じてPI3K-AKT経路を活性化することにより遠隔転移を促進する。MiRNA-490-3pは、TMOD3を標的とすることにより、肝細胞がん細胞の増殖と浸潤を阻害します¹⁶。MiR-145 は、TMOD3¹⁷ を阻害することにより、放射線抵抗性の非小細胞肺がんの放射線感受性を改善します。 インビトロ 実験により、TMOD3はリシルオキシダーゼホモログ2(LOXL2)との相互作用を通じて細胞骨格を調節することにより、食道がん細胞の浸潤を媒介することが明らかになった¹⁸。さらに、プロテオミクス解析により、TMOD3の高発現がアポトーシス経路¹⁹を介して肺がんのエトポシド化学抵抗性を媒介する可能性があることが明らかになりました。近年、腫瘍におけるTMOD3の研究はますます進んでいますが、卵巣がんや化学療法におけるTMOD3の役割についてはまだ報告されていません。

この研究では、卵巣がんにおいてTMOD3がアップレギュレーションされることがわかりました。特に、TMOD3のアップレギュレーションはプラチナ耐性と関連していました。この研究では、卵巣がんにおけるTMOD3の予後的価値と腫瘍免疫浸潤との相関も評価しました。この研究は、卵巣がんにおけるTMOD3の過剰発現がプラチナ製剤耐性と関連していることを示唆しています。

プロトコル

1. 遺伝子発現オムニバス (GEO)

注:卵巣がん、プラチナ製剤で治療された卵巣がん、および薬剤耐性卵巣がんにおけるTMOD3発現は、GEOデータセットから導き出されました。すべてのデータセットの研究タイプは配列による発現プロファイリングであり、生物はホモサピエンスでした。

1. GEOデータベース(Table of Materialsを参照)に移動し、検索ボックスにTMOD3、卵巣がん、薬剤耐性またはデータアクセッションなどのキーワードを入力します(補足図1Aを参照)。
2. [定義] グループ ボックスでデータを異なるグループに分割します。オプションメニューの「Apply adjustment to the P-values」ボックスで「Benjamini and Hochberg (False discovery rate)」を選択し、「GEO2R」メニューの「analyzed」をクリックします。結果を取得するには、完全なテーブルをダウンロードをクリックしてください。
3. ダウンロードしたデータをグラフ作成および統計ソフトウェアで調査し、プロットします( 補足図1Bを参照)。
4. 2つのグループ間の比較には、対応のない t検定 を使用します。

2.TNMプロット

注:TNMplotは、The Cancer Genome Atlas(TCGA)、Therapeutic Research to Generate Effective Treatments(TARGET)、およびGenotype-Tissue Expression(GTEx)リポジトリ²⁰からのRNA-seqデータを利用しています。正常な卵巣組織および卵巣がんにおけるTMOD3の発現をTNMplotを用いて解析しました。

1. TNMplotウェブツール(材料の表を参照)に移動し、腫瘍と正常の比較をクリックします。
2. 「Choose a gene」ボックスにTMOD3を挿入し、「Choose tissue」ボックスで「Ovarian Serous Cystadenocanoma」を選択します。
3. 「解析の開始」をクリックして結果を取得します(補足図1Cを参照)。

3.アルカン

注:アラバマ大学バーミンガム校CANcerデータ分析ポータル(UALCAN)は、公開されているがんデータ²¹を分析するためのユーザーフレンドリーなオンラインリソースです。CPTACデータにおける正常組織および卵巣がんにおけるTMOD3のタンパク質レベル発現をUALCANを用いて解析しました。

1. UALCAN(材料表を参照)に移動し、プロテオミクスメニューをクリックします。
2. 「Enter gene names」ボックスに「TMOD3」と入力し、「CPTAC dataset」ボックスで「ovarian cancer」を選択します。
3. [Explore]をクリックして結果を取得します(補足図1Dを参照)。

4. KMプロッター予後分析

注:卵巣癌におけるTMOD3の予後値は、全生存期間(OS)および無増悪生存期間(PFS)²²を含む、Kaplan Meierプロッター(KMプロッター)を使用して分析されました。

1. KM-plotter(資料の表を参照)に移動し、卵巣がんのKM-plotterの開始をクリックします。
2. TMOD3を Affy id / Geneシンボル ボックスに挿入します。
3. [患者をボックスで分割する]で[最適なカットオフを自動的に選択]を選択します。
4. プラチナ製剤ベースの化学療法患者の予後解析を行う際には、化学療法の選択肢としてプラチンを含むことを選択します。
5. [解析] ボックスで [次のデータセットを使用] で [TCGA] を選択します。
6. Draw Kaplan-Meier plotをクリックして結果を取得します(補足図2を参照)。

5. ROCプロッター

注:Receiver Operating Characteristic Curve(ROC)プロッターは、プラチナベースの化学療法に耐性または感受性の患者におけるTMOD3の発現を分析するために使用され、ROC曲線による予測マーカーとして関心のある遺伝子の検証を可能にしました。トランスクリプトームレベルでのROCプロッターのデータセットは、主にTCGAおよびGEOデータベースからのものであり、1816人の卵巣がん患者の治療および反応データが含まれています²³。

1. ROCプロッター(資料の表を参照)に移動し、卵巣がんのROCプロッターをクリックします。
2. TMOD3を Geneシンボル ボックスに挿入します。
3. [応答] ボックスで [6 か月での無再発生存期間] を選択し、[治療] ボックスで [プラチン] を選択します。
4. [ 計算 ]をクリックして結果を取得します( 補足図3を参照)。

6. mRNA-miRNA解析

注:TMOD3を標的とするmiRNAはTargetScan²⁴によって予測され、次にTCGA卵巣がんデータセットにおけるTMOD3とこれらのmiRNAとの相関関係をcBioportal²⁵によって分析した。その後、上記の結果をCytoscape²⁶で可視化しました。シスプラチン感受性および薬剤耐性卵巣がん患者におけるMiRNA発現をLinkedOmics²⁷で解析しました。

1. TargetScan(資料の表を参照)に移動し、[ヒト遺伝子シンボルの入力]ボックスにTMOD3を挿入します(補足図4Aを参照)。
2. cBioportalに移動します(資料の表を参照)。
3. Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) データセットを選択し、TMOD3 と miRNA の記号を [Enter Genes] ボックスに挿入します。
4. 「Submit Query」をクリックすると、TCGA卵巣がんデータセットのtmod3とmiRNAとの相関データを取得し(補足図4Bを参照)、その結果をCytoscapeで可視化します(資料表を参照)(補足図4C参照)。
5. LinkedOmics(資料表参照)に移動しTCGA_OVサンプルコホートを選択します。
6. [検索データセットの選択] ボックスで [臨床] を選択し、[検索データセット属性の選択] ボックスで [プラチナ ステータス] を選択します。
7. [Select Target Dataset] ボックスで [miRNASeq] を選択し、[Select Statistical Method] で [t-test] を選択します。
8. Submit Queryをクリックして結果を取得します(補足図4D参照)。

7. 免疫浸潤解析

注:Human Protein Atlas(HPA)データベースを使用して、さまざまな免疫細胞におけるTMOD3の分布を分析しました。TIMERは、複数のがんタイプに関連する免疫浸潤を分析する便利なオンラインデータベース^です28。この研究では、TIMERを使用して、TMOD3 mRNA発現と卵巣がんの純度、および免疫細胞の浸潤との関係を分析しました。TISIDBは、腫瘍と免疫系の相互作用のためのオンラインポータルである²⁹。この研究では、TISIDBを使用して、卵巣がんにおけるTMOD3と免疫調節剤との相関関係を決定しました。

1. HPA(材料表を参照)に移動し、検索ボックスにTMOD3を挿入すると、結果が表示されます。
2. さまざまな免疫細胞におけるTMOD3の分布を示すには、 Immunic を選択します( 補足図5Aを参照)。
3. TIMERに進み(材料の表を参照)、Gene SymbolボックスにTMOD3を挿入します。
4. がんの種類ボックスでOVを選択し、[送信]をクリックして結果を取得します(補足図5Bを参照)。
5. TISIDB(材料の表を参照)に移動し、TMOD3をGene Symbolボックスに挿入します。
6. [ Submit ]をクリックして結果を取得します( 補足図5Cを参照)。

8. 卵巣癌におけるTMOD3共発現ネットワーク

注:TMOD3と共発現した遺伝子はLinkedOmicsで解析し、TOP50遺伝子はヒートマップで表示しました。TMOD3相互作用遺伝子はSTRING³⁰によって予測されました。次に、重なり合う遺伝子をベン図で表示しました。重複する遺伝子は、Gene Ontology Biological Process(GO-BP)、Gene Ontology Cellular Component(GO-CC)、Gene Ontology Molecular Function(GO-MF)、および京都遺伝子およびゲノム百科事典(KEGG)の経路について、DAVID³¹によって機能的にアノテーションされました。

1. LinkedOmics に移動し、TCGA_OV Sample コホートを選択します。
2. 「Select Search Dataset」ボックスと「Select Target Dataset」ボックスで「RNAseq」を選択します。
3. Submit Queryをクリックすると、TMOD3と共発現した遺伝子の結果が表示されます。
4. STRING(材料の表を参照)に移動し、TMOD3をProtein Nameボックスに挿入します。
5. 「Organisms」ボックスで「homo sapiens」を選択し、「search」をクリックして結果を取得します(補足図6を参照)。
6. DAVIDに移動します(資料の表を参照)。
7. 重複する遺伝子を [Enter Gene List] ボックスに挿入し、[Select Identifier] ボックスで [ENSEMBL _GENE_SYMBOL] を選択します。
8. [ Submit List ] をクリックして結果を取得します ( 補足図 7 を参照)。

9. CTDデータベース

注:CTDデータベースは、化学、遺伝子、表現型、疾患、および環境³²の間の関係を分析するための新しいツールである。CTDデータベースは、TMOD3を標的とする薬剤を予測します。その後、PubChemデータベースを使用して、薬物の最終的な分子構造を決定します。

1. CTDデータベース(Table of Materialsを参照)に移動し、SearchメニューでChemical - Gene Interaction Queryを選択します。
2. GENEボックスにTMOD3を挿入し、searchをクリックして結果を取得します(補足図8を参照)。
3. PubChemデータベース(資料表を参照)に移動し、検索ボックスに薬剤を入力して結果を取得します(補足図9を参照)。

結果

卵巣がんにおけるTMOD3の発現
まず、GEOデータベースは、マイクロアレイデータセットGSE51088およびGSE66957でTMOD3のmRNA発現レベルが上昇していることを示しました(図1A、B)。また、TNMplotウェブツール(図1C)により、TNMplotウェブツールにより、正常な卵巣組織と比較して、卵巣がんにおいてTMOD3が高発...

ディスカッション

細胞骨格は、さまざまな腫瘍の発生と進行、治療、および予後に不可欠であると考えられてきた⁵²。赤血球と心血管系⁵³に限定されるTMOD1、および神経系⁵⁴に限定されるTMOD2と比較して、TMOD3は遍在する分布を有しており、全身性腫瘍におけるTMOD3の研究をより一般的にしている14,15,16,17,18,19...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
cBioportal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center		Correlation analysis of  TMOD3 with targeted miRNAs (https://www.cbioportal.org)
CTD database	North Carolina State University		To analyze the relationships between chemistry, genes, phenotype, disease, and environment (https://ctdbase.org/)
Cytoscape	National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health		Network Data Integration, Analysis, and Visualization (www.cytoscape.org/)
DAVID	Frederick National Laboratory for Cancer Research		A comprehensive set of functional annotation tools for investigators to understand the biological meaning behind large lists of genes(https://david.ncifcrf.gov/)
GEO	NCBI		Gene expression analysis (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )
HPA	Knut & Alice Wallenberg foundation		The Human Protein Atlas (HPA) database helped analyze the distribution of TMOD3 in various immune cells (https://www.proteinatlas.org/)
KM-plotter	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Prognostic Analysis (https://kmplot.com/analysis/)
LinkedOmics	Baylor College of Medicine		A platform for biologists and clinicians to access, analyze and compare cancer multi-omics data within and across tumor types (http://www.linkedomics.org/)
PubChem database	U.S. National Library of Medicine		To determine the definitive molecular structure of the drug
ROC Plotter	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Validation of the interest gene as a predictive marker (http://www.rocplot.org/)
STRING	Swiss Institute of Bioinformatics		Coexpression networks analysis(https://string-db.org)
TargetScan	Whitehead Institute for Biomedical Research		Prediction of miRNA targets (www.targetscan.org/)
TIMER	Harvard University		Systematical analysis of immune infiltrates across diverse cancer types (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)
TISIDB	The University of Hong Kong		A web portal for tumor and immune system interaction(http://cis.hku.hk/TISIDB/)
TNMplot	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Gene expression analysis (https://www.tnmplot.com/ )
UALCAN	The University of ALabama at Birmingham		Gene expression analysis (http://ualcan.path.uab.edu)