原调节蛋白 3 过表达作为卵巢癌铂耐药和免疫浸润的标志物

摘要

近年来，原调节蛋白 3 （TMOD3） 在肿瘤中的研究越来越多。这项研究首次报道了 TMOD3 在卵巢癌中高表达，并且与铂类耐药和免疫浸润密切相关。这些结果可能有助于改善卵巢癌的治疗结果。

摘要

细胞骨架在卵巢癌的铂耐药中起重要作用。原调节蛋白 3 （TMOD3） 在许多肿瘤的发展中起关键作用，但其在卵巢癌耐药性中的作用仍未得到探索。通过分析来自基因表达综合 （GEO）、癌症基因组图谱 （TCGA） 和临床蛋白质组学肿瘤分析联盟 （CPTAC） 数据库的数据，本研究比较了 TMOD3 在卵巢癌和正常组织中的表达，并检查了铂类治疗后 TMOD3 的表达铂敏感和铂耐药卵巢癌。采用 Kaplan-Meier 方法评估 TMOD3 对卵巢癌患者总生存期 （OS） 和无进展生存期 （PFS） 的影响。使用 TargetScan 预测靶向 TMOD3 的 microRNAs （miRNA），并使用 TCGA 数据库进行分析。使用肿瘤免疫估计资源 （TIMER） 和肿瘤-免疫系统相互作用的集成存储库门户 （TISIDB） 来确定 TMOD3 表达与免疫浸润之间的关系。使用 LinkedOmics、交互基因/蛋白质检索检索工具 （STRING） 和注释、可视化和集成发现数据库 （DAVID） 生物信息学探索卵巢癌中的 TMOD3 共表达网络。结果显示，TMOD3 在卵巢癌中高表达，并与卵巢癌的分级、分期和转移相关。TMOD3 表达在铂治疗卵巢癌细胞和患者中显著降低。然而，与铂敏感的卵巢癌细胞和组织相比，TMOD3 在铂耐药卵巢癌细胞和组织中的表达更高。在接受铂类化疗的卵巢癌患者中，较高的 TMOD3 表达与较低的 OS 和 PFS 显著相关。miRNA 介导的转录后调控可能是卵巢癌和铂类耐药卵巢组织中 TMOD3 高表达的原因。TMOD3 mRNA 的表达与卵巢癌的免疫浸润有关。这些发现表明 TMOD3 在卵巢癌中高度表达，并且与铂耐药和免疫浸润密切相关。

引言

卵巢癌是全球妇科肿瘤死亡率第二高的癌症¹。根据组织病理学可分为三种类型：生殖细胞、性腺间充质和上皮肿瘤，其中 90% 的患者是上皮性卵巢癌。与卵巢癌相关的危险因素包括持续排卵、促性腺激素暴露增加和炎性细胞因子²。超过 75% 的卵巢癌病例直到晚期才被发现，导致缺乏有效的治疗。晚期卵巢癌患者的预后较差，尽管接受了新的化疗方案，例如腹膜内给药和靶向治疗，但 5 年生存率不到 20%。卵巢癌的标准治疗主要包括肿瘤切除手术，然后用铂类和紫杉醇等药物进行化疗。然而，约 70% 的病例会发生肿瘤复发¹。顺铂通过干扰 DNA 复制和转录发挥其治疗作用，目前是卵巢癌化疗的一线药物。然而，很大一部分卵巢癌患者对铂类耐药³。多种细胞过程，如药物外排、细胞解毒、DNA 修复、细胞凋亡和自噬，在卵巢癌细胞的铂耐药性中至关重要 ^4,5,6。

细胞骨架的改变是影响卵巢癌铂耐药的重要机制。最近有报道，细胞骨架相关基因通常异常表达，并且在顺铂触发的细胞凋亡存在下，肌动蛋白细胞骨架会显著改变⁷。许多研究表明，顺铂可调节卵巢癌细胞的纳米力学。敏感细胞的细胞刚度随铂剂量依赖性增加，主要由肌动蛋白聚合的破坏所贡献。相比之下，顺铂治疗后，顺铂耐药细胞的细胞刚度没有显着变化⁸。此外，正如原子力显微镜所揭示的那样，顺铂敏感卵巢癌细胞的 Young 模量较低。相比之下，顺铂耐药卵巢癌细胞表现出以长肌动蛋白应力纤维为特征的细胞骨架。抑制 Rho GTP 酶可降低这些耐药细胞的硬度并增强顺铂敏感性。相反，在顺铂敏感细胞中激活 Rho GTP 酶会增加细胞刚度并降低它们对顺铂的敏感性⁹。多剪接 RNA 结合蛋白 （RBPMS） 是一种抑癌基因，通过调节细胞骨架网络的蛋白表达和维持细胞完整性来降低卵巢癌细胞中的顺铂耐药性¹⁰。与 A2780 细胞相比，肌动蛋白应激纤维在 A2780/CP 细胞中更为明显。卵巢癌细胞耐药性的发展会诱导肌动蛋白细胞骨架的广泛重组，从而影响细胞机械特性、运动性和细胞内药物转运¹¹。

TMOD3 是一种细胞骨架调节蛋白，通过覆盖肌动蛋白丝的缓慢生长（尖头）末端来阻止肌动蛋白的解聚¹²。TMOD3 通过调节肌动蛋白动力学在不同细胞类型中发挥不同的作用，并参与促进细胞形状、细胞迁移和肌肉收缩等各种过程。结果表明，小鼠中的 TMOD3 缺失导致胚胎在 E14.5-E18.5 处死亡，表明 TMOD3 可能是胚胎发育的关键因素¹³。基于其在干细胞和祖细胞中的生物学功能，TMOD3 可能在肿瘤进展中起重要作用。在肝细胞癌中，TMOD3 通过激活 MAPK/ERK 信号通路¹⁴ 促进肝细胞癌细胞的生长、侵袭和迁移，并通过与表皮生长因子受体相互作用激活 PI3K-AKT 通路促进远处转移¹⁵。MiRNA-490-3p 通过靶向 TMOD3 抑制肝细胞癌细胞增殖和侵袭¹⁶。MiR-145 通过抑制 TMOD3¹⁷ 提高耐辐射非小细胞肺癌的放射敏感性。 体外 实验显示，TMOD3 通过与赖氨酰氧化酶同源物 2 （LOXL2） 相互作用调节细胞骨架，介导食管癌细胞的侵袭¹⁸。此外，蛋白质组学分析显示，TMOD3 的高表达可能通过凋亡途径介导肺癌中的依托泊苷化疗耐药¹⁹。尽管近年来 TMOD3 在肿瘤中的研究越来越多，但仍然没有关于 TMOD3 在卵巢癌和化疗中的作用的报道。

这项研究发现 TMOD3 在卵巢癌中上调。值得注意的是，TMOD3 的上调与铂耐药有关。本研究还评估了 TMOD3 在卵巢癌中的预后价值及其与肿瘤免疫浸润的相关性。这项研究表明，TMOD3 在卵巢癌中的过表达与铂耐药有关。

研究方案

1. 基因表达综合 （GEO）

注意：TMOD3 在卵巢癌、用铂药物治疗的卵巢癌和耐药卵巢癌中的表达来自 GEO 数据集。所有数据集的研究类型均为阵列表达谱，生物体为智人。

1. 转到 GEO 数据库（参见材料表），并在搜索框中输入关键字，例如 TMOD3、卵巢癌和耐药性或数据访问（参见补充图 1A）。
2. 在 Define group 框中将数据划分为不同的组。在选项菜单中，在 Apply adjustment to the P values 框中选择 Benjamini 和 Hochberg （False discovery rate），然后单击 GEO2R 菜单中的 analyzed。单击 Download full table 以获取结果。
3. 使用绘图和统计软件调查并绘制下载的数据（参见 补充图 1B）。
4. 使用未配对的 t 检验 进行两组之间的比较。

2. TNM情节

注意：TNMplot 利用来自癌症基因组图谱 （TCGA）、产生有效治疗的治疗研究 （TARGET） 和基因型组织表达 （GTEx） 存储库²⁰ 的 RNA-seq 数据。使用 TNMplot 分析 TMOD3 在正常卵巢组织和卵巢癌中的表达。

1. 转到 TNMplot 网络工具（参见材料表），然后单击比较肿瘤和正常。
2. 在“选择基因”框中插入 TMOD3，然后在“选择组织”框中选择卵巢浆液性囊腺癌。
3. 单击 开始分析 以获取结果（参见 补充图 1C）。

3. 乌尔坎

注意：阿拉巴马大学伯明翰分校 CANcer 数据分析门户 （UALCAN） 是一个用户友好的在线资源，用于分析公开可用的癌症数据²¹。使用 UALCAN 分析 CPTAC 数据中正常组织和卵巢癌中 TMOD3 的蛋白水平表达。

1. 转到 UALCAN （参见 材料表）并单击 蛋白质组学 菜单。
2. 在 Enter gene names（输入基因名称）框中插入 TMOD3，然后在 CPTAC dataset（CPTAC 数据集）框中选择 ovarian cancer（卵巢癌）。
3. 单击 Explore 以获取结果（参见 补充图 1D）。

4. KM 绘图仪预后分析

注意：使用 Kaplan Meier 绘图仪 （KM-plotter） 分析 TMOD3 在卵巢癌中的预后价值，包括总生存期 （OS） 和无进展生存期 （PFS）²²。

1. 转到 KM 绘图仪 （参见 材料表），然后单击 启动卵巢癌的 KM 绘图仪。
2. 将 TMOD3 插入 Affy id/ 基因符号 框中。
3. 在 Split patients by box 中选择 Auto select best cutoff （自动选择最佳截止）。
4. 在对铂类化疗患者进行预后分析时，选择在化疗选项中含有铂。
5. 在 Use following dataset（s） （使用以下数据集） 中选择 TCGA 作为分析框。
6. 单击 Draw Kaplan-Meier plot 以获取结果（参见 补充图 2）。

5. ROC 绘图仪

注意：受试者工作特征曲线 （ROC） 绘图仪用于分析对铂类化疗耐药或敏感的患者的 TMOD3 表达，并允许通过 ROC 曲线验证感兴趣的基因作为预测标志物。转录组水平的 ROC 绘图仪数据集主要来自 TCGA 和 GEO 数据库，包含来自 1816 名卵巢癌患者的治疗和反应数据²³。

1. 转到 ROC 绘图仪 （参见 材料表），然后单击卵巢 癌的 ROC 绘图仪。
2. 将 TMOD3 插入 基因符号 框中。
3. 在 Responds（响应）框中选择 Relapse-free survival at 6 个月，然后在 Treatment（治疗）框中选择 Platin。
4. 单击 Calculate 获取结果（参见 补充图 3）。

6. mRNA-miRNA 分析

注意：通过 TargetScan²⁴ 预测靶向 TMOD3 的 miRNA，然后通过 cBioportal²⁵ 分析 TMOD3 与 TCGA 卵巢癌数据集中这些 miRNA 的相关性。然后，通过 Cytoscape²⁶ 可视化上述结果。LinkedOmics 分析了顺铂敏感和耐药卵巢癌患者的 MiRNA 表达²⁷。

1. 转到 TargetScan （参见 材料表），然后将 TMOD3 插入到输入 人类基因符号 框中（参见 补充图 4A）。
2. 转到 cBioportal （参见 材料表）。
3. 选择 Ovarian Serous Cystadenocarcinoma （TCGA， Nature 2011） 数据集，并在 Enter Genes 框中插入 TMOD3 和 miRNA 符号。
4. 单击 提交查询 以获取 TMOD3 与 TCGA 卵巢癌数据集中 miRNA 的相关性数据（参见 补充图 4B），然后通过 Cytoscape 可视化结果（参见 材料表）（参见 补充图 4C）。
5. 转到 LinkedOmics （参见 材料表），然后选择 TCGA_OV Sample cohort。
6. 在 Select Search Dataset （选择搜索数据集） 框中选择 clinical（临床），然后在 Select Search Dataset Attribute （选择搜索数据集属性） 框中选择 platinum status（白金级）。
7. 在 Select Target Dataset 框中选择 miRNASeq，然后在 Select Statistical Method 中选择 t-test。
8. 单击 Submit Query 以获取结果（参见 补充图 4D）。

7. 免疫浸润分析

注意：人类蛋白质图谱 （HPA） 数据库用于分析 TMOD3 在各种免疫细胞中的分布。TIMER 是一个方便的在线数据库，可分析与多种癌症类型相关的免疫浸润²⁸。本研究使用 TIMER 分析 TMOD3 mRNA 表达与卵巢癌纯度和免疫细胞浸润之间的关系。TISIDB 是肿瘤-免疫系统相互作用的在线门户²⁹。本研究使用 TISIDB 来确定 TMOD3 与卵巢癌免疫调节剂之间的相关性。

1. 转到 HPA （参见 材料表），然后在 搜索 框中插入 TMOD3，然后获得结果。
2. 选择 免疫 以显示 TMOD 3 在各种免疫细胞中的分布（参见 补充图 5A）。
3. 转到 TIMER （参见 材料表）并在 Gene Symbol 框中插入 TMOD3。
4. 在 癌症类型 框中选择 OV，然后单击 Submit 以获取结果（参见 补充图 5B）。
5. 转到 TISIDB （参见 材料表）并将 TMOD3 插入基因 符号 框中。
6. 单击 提交 以获取结果（参见 补充图 5C）。

8. 卵巢癌中的 TMOD3 共表达网络

注：LinkedOmics 分析与 TMOD3 共表达的基因，TOP50 基因通过热图显示。TMOD3 相互作用基因由 STRING³⁰ 预测。然后，重叠的基因由维恩图显示。DAVID³¹对重叠基因进行功能注释，用于基因本体生物过程 （GO-BP）、基因本体细胞成分 （GO-CC）、基因本体分子功能 （GO-MF） 和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 通路。

1. 转到 LinkedOmics，然后选择 TCGA_OV Sample cohort。
2. 在 Select Search Dataset 框和 Select Target Dataset 框中选择 RNAseq。
3. 单击 Submit Query 以获取与 TMOD3 共表达的基因的结果。
4. 转到 STRING（参见材料表），然后在蛋白质名称框中插入 TMOD3。
5. 在 Organisms 框中选择 homo sapiens，然后单击搜索以获取结果（参见补充图 6）。
6. 转到 DAVID （参见 材料表）。
7. 在 Enter Gene List（输入基因列表）框中插入重叠基因，然后在 Select Identifier（选择标识符）框中选择 ENSEMBL _GENE_SYMBOL。
8. 单击 Submit List 以获取结果（参见 补充图 7）。

9. CTD 数据库

注：CTD 数据库是分析化学、基因、表型、疾病和环境之间关系的新工具³².CTD 数据库预测靶向 TMOD3 的药物。然后使用 PubChem 数据库来确定药物的最终分子结构。

1. 转到 CTD 数据库（参见材料表），然后在 Search 菜单中选择 Chemical - Gene Interaction Query。
2. 在 GENE 框中插入 TMOD 3 ，然后单击搜索以获取结果（参见补充图 8）。
3. 转到 PubChem 数据库 （参见 材料表）并在 搜索 框中插入药物以获取结果（参见 补充图 9）。

结果

TMOD3 在卵巢癌中的表达
首先，GEO 数据库显示 TMOD3 的 mRNA 表达水平在 GSE51088 和 GSE66957 的微阵列数据集中升高（图 1A、B）。通过 TNMplot 网络工具，与正常卵巢组织相比，TMOD3 在卵巢癌中也高度表达（图 1C）。通过 UALCAN 网络工具对 CPTAC 数据的分析表明，卵巢癌中 TMOD3 的蛋白质水平也显着高于正常卵?...

讨论

细胞骨架被认为在各种肿瘤的发生和进展、治疗和预后中至关重要⁵²。与局限于红细胞和心血管系统的 TMOD1⁵³ 和局限于神经系统的 TMOD2⁵⁴ 相比，TMOD3 的分布无处不在，这使得 TMOD3 在系统性肿瘤中的研究更受欢迎 14,15,16,17,18,19

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
cBioportal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center		Correlation analysis of  TMOD3 with targeted miRNAs (https://www.cbioportal.org)
CTD database	North Carolina State University		To analyze the relationships between chemistry, genes, phenotype, disease, and environment (https://ctdbase.org/)
Cytoscape	National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health		Network Data Integration, Analysis, and Visualization (www.cytoscape.org/)
DAVID	Frederick National Laboratory for Cancer Research		A comprehensive set of functional annotation tools for investigators to understand the biological meaning behind large lists of genes(https://david.ncifcrf.gov/)
GEO	NCBI		Gene expression analysis (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ )
HPA	Knut & Alice Wallenberg foundation		The Human Protein Atlas (HPA) database helped analyze the distribution of TMOD3 in various immune cells (https://www.proteinatlas.org/)
KM-plotter	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Prognostic Analysis (https://kmplot.com/analysis/)
LinkedOmics	Baylor College of Medicine		A platform for biologists and clinicians to access, analyze and compare cancer multi-omics data within and across tumor types (http://www.linkedomics.org/)
PubChem database	U.S. National Library of Medicine		To determine the definitive molecular structure of the drug
ROC Plotter	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Validation of the interest gene as a predictive marker (http://www.rocplot.org/)
STRING	Swiss Institute of Bioinformatics		Coexpression networks analysis(https://string-db.org)
TargetScan	Whitehead Institute for Biomedical Research		Prediction of miRNA targets (www.targetscan.org/)
TIMER	Harvard University		Systematical analysis of immune infiltrates across diverse cancer types (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)
TISIDB	The University of Hong Kong		A web portal for tumor and immune system interaction(http://cis.hku.hk/TISIDB/)
TNMplot	Department of Bioinformatics of the Semmelweis University		Gene expression analysis (https://www.tnmplot.com/ )
UALCAN	The University of ALabama at Birmingham		Gene expression analysis (http://ualcan.path.uab.edu)