* These authors contributed equally
כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת אורך הטלומרים היחסי (TL) באמצעות בדיקת תגובת שרשרת פולימראז כמותית מונוכרום (MMqPCR). בדיקת MMqPCR היא שיטה חוזרת, יעילה וחסכונית למדידת TL מדנ"א אנושי במחקרים מבוססי אוכלוסייה.
טלומרים הם מבנים ריבונוקלאו פרוטאינים בקצה כל הכרומוזומים האיקריוטים המגנים על הדנ"א מפני נזק ושומרים על יציבות הכרומוזומים. אורך הטלומרים (TL) נקשר לחשיפות שונות, תהליכים ביולוגיים ותוצאי בריאות. מאמר זה מתאר את פרוטוקול בדיקת תגובת שרשרת פולימראז כמותי מונוכרום (MMqPCR) שנערך באופן שגרתי במעבדה שלנו למדידת TL ממוצע יחסי מדנ"א אנושי. ישנן מספר שיטות שונות למדידת TL מבוססות PCR, אך הפרוטוקול הספציפי לשיטת MMqPCR המוצג בפרסום זה ניתן לחזרה, יעיל, חסכוני ומתאים למחקרים מבוססי אוכלוסייה. פרוטוקול מפורט זה מתאר את כל המידע הדרוש לחוקרים כדי לבסס בדיקה זו במעבדה שלהם. בנוסף, פרוטוקול זה מספק צעדים ספציפיים להגדלת יכולת השחזור של מדידת TL על ידי בדיקה זו, המוגדרת על ידי מקדם המתאם התוך-מעמדי (ICC) על פני מדידות חוזרות ונשנות של אותה דגימה. בית הדין הפלילי הבינלאומי הוא גורם קריטי בהערכת הכוח הצפוי לאוכלוסיית מחקר ספציפית; ככזה, דיווח על ICCs ספציפיים לעוקבה עבור כל בדיקת TL הוא צעד הכרחי כדי לשפר את הקשיחות הכוללת של מחקרים מבוססי אוכלוסייה של TL. תוצאות לדוגמה המשתמשות בדגימות DNA שחולצו מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים מדגימות את ההיתכנות של הפקת נתוני TL הניתנים לחזרה באמצעות פרוטוקול MMqPCR זה.
טלומרים הם קומפלקסים מגנים הנמצאים בקצה כל הכרומוזומים האיקריוטיים, המורכבים מרצפי דנ"א שמורים מאוד, חוזרים על עצמם וחלבונים הקשורים אליהם. הטלומר מגן על שלמות הדנ"א ושומר על יציבות הכרומוזומים. התקצרות הדרגתית של הטלומרים מתרחשת בתאים מתחלקים כתוצאה מסינתזה חלקית של גדיל מפגר, נזק לדנ"א וגורמים אחרים 1,2. עדויות מוגברות התומכות באורך הטלומרים (TL) כסמן ביולוגי של הזדקנות ומחלות הקשורות לגיל לאורך תוחלת החיים האנושית לוו בעלייה בסוגי מבחני מדידת TL המשמשים להערכת התפקיד של TL במחקרים על חשיפה אנושית, מחלות ובריאות 3,4,5. מטא-אנליזות דיווחו על קשרים של TL עם תמותה כוללת, חשיפות סביבתיות ותוצאי בריאות, כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם וסוכרת 6,7,8,9,10,11,12,13 . מטא-אסוציאציות אלה נובעות ממחקרים המשתמשים באחת מלמעלה משני תריסר מתודולוגיות מדידה שונות של TL, כאשר נקודות החוזק של אסוציאציות נוטות להשתנות בין מתודולוגיות שונות 14,15,16. בחירת שיטת מדידת TL אופטימלית למחקר היא צעד מכריע להבטחת תוצאות מדויקות, שכן לכל שיטה יתרונות וחסרונות משלה 5,17.
בשל העלות הנמוכה יחסית של ריאגנטים, תפנית מהירה בבדיקה, מדרגיות ודרישת DNA ראשונית נמוכה יותר, טכניקות מדידת TL מבוססות PCR משמשות לעתים קרובות באופן מועדף בעת ביצוע מחקרים עם אוכלוסיות מדגם גדולות, מחקרים עם גישה מוגבלת לדגימות עם ריכוזי DNA גבוהים, או מחקרים המתעדפים תפוקה גבוהה. השיטה הראשונה המבוססת על PCR למדידת TL, תגובת שרשרת פולימראז כמותית סינגלפלקס (qPCR) שפותחה במקור על ידי ריצ'רד קותון, משתמשת ביחס בין אותות הפלואורסצנטיות של הטלומרים (T) והגברה של גן עותק יחיד (S), הפועלים על לוחות PCR נפרדים18. בגישה זו, פריימרים המשלימים את רצפי הדנ"א הטלומרים החוזרים (T) משמשים להגברת תכולת הדנ"א הטלומרי הכולל בדגימה ומכומתים על ידי זיהוי כתב הפלואורסצנטי SYBR ירוק. באופן דומה, פריימרים המשלימים אזור אינטרגני של גן עותק יחיד (S) שמור משמשים לכימות מספר העתק הגנום. שתי הערכות אלה מכומתות ביחס לעקומת תקן DNA גנומית המשמשת בכל הבדיקות בפרויקט לבקרת השונות מלוח לצלחת. חלוקת הדנ"א הטלומרי הכולל (T) במספר העתק גנום יחיד (S) מייצרת את יחס T/S, מדידה יחסית חסרת יחידה המייצגת תוכן טלומרי ממוצע לתא עבור דגימת DNA בודדת18,19. לפיכך, יחס T/S אינו מדידה ספציפית של אורך פונקציונלי; עם זאת, בהתאם לנורמות הספרותיות, אנו משתמשים במונח TL ממוצע למדגם לאורך פרוטוקול זה.
שיטה זו התקדמה בשנת 2009 כאשר ריצ'רד קות'ון תיאר את בדיקת המולטיפלקס qPCR (MMqPCR) במונוכרום כגישה להפחתת השונות ביחס T/S ביחס לשיטת הסינגלפלקס qPCR המקורית19. לבדיקת MMqPCR יש את היתרונות של בדיקת qPCR עם יתרון נוסף של מדידת אותות T ו- S באותה תגובה היטב באמצעות פלואורופור דיווח אחד, ובכך להקטין את השגיאה ביחס ל- qPCR singleplex וכתוצאה מכך דיוק ושחזור גבוהים יותר19. יתר על כן, שיטת מולטיפלקס זו עשויה להוזיל עלויות ולשפר את התפוקה מכיוון שנדרשות מחצית ממספר התגובות בהשוואה לבדיקת סינגפלקס19.
בהתחשב ביתרונות של מדידת MMqPCR TL, שיטה זו מתאימה היטב למחקרים מבוססי אוכלוסייה של קשרי TL עם חשיפות, תוצאות בריאותיות ותהליכים ביולוגיים. עם זאת, ייזום השיטה יכול להיות מאתגר. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, אנו מתארים, בפירוט, את פרוטוקול מדידת MMqPCR TL המשמש במעבדה שלנו, תוך הדגשת שלבי מפתח שיושמו כדי להגביר את דיוק הבדיקה, להפחית את הסיכון לזיהום ולשפר את יכולת החזרתיות.
יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר שלבים לניקוי נתונים ולחישוב מקדם המתאם התוך-מעמדי (ICC), מדד סטטיסטי חשוב של יכולת השחזור של מדידות TL2. עם התוצאות המייצגות שלנו, אנו מדגימים את היכולת ליצור ICCs גבוהים באמצעות פרוטוקול זה. בנוסף, אנו מזהים בקרת איכות (QC) ושלבי פתרון בעיות הצפויים להפחית את השונות במדידות TL ולהגדיל את ה- ICC המתקבל. בשל יכולת החזרתיות הגבוהה של שיטה זו, יעילות ועלות-תועלת, מדידת MMqPCR TL אידיאלית למחקר TL אפידמיולוגי. איור 1 מספק סקירה חזותית של שיטת MMqPCR כמתואר בפרוטוקול זה.
איור 1: סקירה כללית של השיטה. סקירה רחבה של שיטת תגובת שרשרת פולימראז כמותי מונוכרום מולטיפלקס למדידת אורך טלומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות המוסדיים. פרוטוקול זה מתאר את בדיקת MMqPCR שבוצעה בעומק מדידה של טריפליקטים כפולים, כלומר, מדידות משולשות של כל דגימה החוזרת על עצמה על פני לוחות כפולים, המיושמות באמצעות שני thermocyclers בו זמנית כדי לשפר את התפוקה. השימוש בלוחות כפולים הוא שיקול ראשון במעלה שנעשה ביישום פרוטוקול זה כדי להשיג יכולת שחזור גבוהה כפי שצוין על ידי ICCs גבוהים. למרות שניתן להשתמש בפחות משכפלים, ההשפעה על ICC, ולאחר מכן על הכוח וגודל הדגימה הדרוש, צריכה להישקל בזהירות ולהימדד עם כל קבוצה ועוקבה על ידי כל מעבדה20,21. אם רק תרמוסייקל אחד זמין, אנו ממליצים לשמור על עומק המדידה (כלומר, טריפליקטים כפולים), ולהריץ 2 לוחות ברצף.
1. הכנת מלאי ותנאי אחסון
טבלה 1: נפחים סופיים וריכוזים של ריאגנטים. נפחים וריכוזים של ריאגנטים באליציטוטים בודדים, תערובת אב, ובבארות PCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: רצפי פריימר של טלומרים ועותק יחיד של גן אוליגונוקלאוטיד (oligonucleotide primer). רשימה של רצפי הפריימר של גן הטלומרים והאלבומין המשמשים במתודולוגיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
2. מיצוי DNA גנומי והכנת דגימות
טבלה 3: ארגון דגימות ותקן בקרה בצלחת. מיקום כל הדגימות והתקנים על צלחת PCR של 96 בארות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
3. הכנת תערובת מאסטר MMqPCR
4. הכנת צלחת 96 באר
איור 2: תהליך מילוי צלחות. (א) אם בוחרים למלא תחילה טורים אי-זוגיים, זהו סדר מילוי הבארות. (ב) אם בוחרים למלא תחילה עמודים זוגיים, זהו סדר מילוי הבארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פריסת לוחות. יש להשתמש ברצועת PCR A, ברצועה B, ברצועה C וברצועת העקומה הסטנדרטית (SC) כדי למלא שלוש עמודות בכל לוח כדי לייצר טריפליקטים כפולים של כל דגימה ודילול סטנדרטי. דיאגרמה זו מראה אילו מהעמודות יש למלא בכל רצועה. לוחית שתיים מתהפכת ב-180° (שימו לב שכותרות העמודות והשורות הפוכות) לפני הטעינה, אך הלוח ממולא באופן זהה ללוח הראשון, ובכך מבטל שגיאות פיפטינג פוטנציאליות ועדיין שולט באפקטי המיקום על פני הלוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
5. תרמוצילקינג MMqPCR
איור 4: פרופיל Thermocycling של בדיקת MMqPCR. פרוטוקול MMqPCR שנוצר בתוכנה בהתאם לפרוטוקול thermocycling המקורי19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
6. ניתוח נתוני MMqPCR
איור 5: הגדרת לוחות מבוססת תוכנה. (A) הגדרת צלחת מבוססת תוכנה עבור לוח P1 לאחר השלמת שלבים 6.2-6.4. (B) הגדרת צלחת מבוססת תוכנה עבור לוח P2 לאחר השלמת שלבים 6.2-6.4. מזהים לדוגמה ומזהים סטנדרטיים אינם מיושרים בין שני לוחות CFX בגלל האופן שבו התוכנה מקצה מזהים לדוגמה בהתבסס על מיקום טוב (כלומר, מדגם CFX 1 ב- P1 הוא מדגם CFX 24 ב- P2). תבנית האקסל המסופקת בקובץ משלים 1 מתייחסת לכך, ומבטיחה שמדידות בין-לוחיות המבוצעות על אותה דגימה ביולוגית מיושרות כראוי זו לזו אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: עקומות סטנדרטיות עבוראמפליקונים מסוג t elomere ואלבומין. (A) עקומה סטנדרטית זו היא מאפליקון הטלומרים P1 של מערך הנתונים של התוצאות המייצגות. תקן אחד הוסר מכיוון שלא עמד בקריטריונים של בקרת איכות. (B) עקומה סטנדרטית זו היא מאפליקון אלבומין P2 של מערך הנתונים של התוצאות המייצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: אמפליקונים של גן טלומרים ועותק יחיד. (A) הגברה של טלומרים ו-(B) הגברה של גן אלבומין של דגימות שדווחו בתוצאות מייצגות המוצגות בתוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
7. דיווח נתוני MMqPCR
התוצאות המוצגות בטבלה 4 ובטבלה 5 מציעות דוגמה למדידות TL חוזרות מאוד המתקבלות על ידי ביצוע הפרוטוקול. לצורך תוצאות אלה, DNA הופק מ-24 דגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC) באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להנחיות היצרנים. 24 דגימות אלה נערכו על פני שתי צלחות בנות 96 בארות. כל דגימות הדנ"א נבדקו לאיכות באמצעות ספקטרופוטומטר ופלואורומטר, תוך שימוש ביחס ממוצע של 260/280, יחס ממוצע של 260/230 וריכוז dsDNA כדי לקבוע זכאות לבדיקה וגורם דילול הדגימה (טבלה 6). טבלה 6 מדגישה גם את החשיבות של כימות ריכוז dsDNA, שיכול להיות שונה מריכוז DNA שנמדד באמצעות ספקטרופוטומטר. שונות זו היא תוצאה של גישות שונות לכימות. באופן ספציפי, הספקטרופוטומטר גוזר ריכוז DNA המבוסס על ספיגה של 280 ננומטר והוא רגיש לתנודות עקב מזהמים (למשל, חלבון, מלח וכו ') המשפיעים על קריאות הספיגה. לעומת זאת, ריכוזי dsDNA הנמדדים באמצעות פלואורומטר נקבעים על ידי פלואורסצנטיות של צבע שנקשר באופן ספציפי ל- dsDNA, וככזה, מניחים שהוא השתקפות מדויקת יותר של תוכן ה- DNA. דגימות הדנ"א חוו עד שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה לפני ניתוח MMqPCR TL. דנ"א הבקרה נוצר ממיצוי DNA מאוגד של PBMCs מאדם אחד, אשר שימש ליצירת דילול סדרתי של שבע נקודות מ-2 ng/μL ל-0.0313 ng/μL של DNA. עקומות התקן הבלתי תלויות שנוצרו עבור PCR שלב 9 (אמפליקון טלומרים) ושלב 12 (אמפליקון גן עותק יחיד, אלבומין בפרוטוקול זה) מוצגות באיור 6A,B. הבדיקות הופעלו על מערכת זיהוי PCR מסחרית בזמן אמת שיצרה עקומת התכה שמראה את תוצרי האמפליקון הבודדים המיוצרים בטמפרטורות נפרדות כפי שניתן לראות באיור 8.
טבלה 4: נתוני פלט ממדידת MMqPCR לקבלת תוצאות מייצגות מיטביות. יחסי T/S ממוצעים, SDs, קורות חיים ו-TL עם ציון Z עבור 24 דגימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 5: פלט נתונים באורך טלומרים. נתונים גולמיים מבדיקת MMqPCR מנותחים בתוכנה ולאחר מכן מתווספים לתבנית הגיליון האלקטרוני המצורפת כקובץ משלים 1 לניתוח נוסף ו- QC. גיליון פלט זה של תבנית TL מציג סיכום של הנתונים, ומציג מזהי מדגם, ממוצע TLs, SDs וקורות חיים עבור כל מדגם בשני הלוחות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 6: מדדי איכות DNA ספקטרופוטומטר ופלואורומטר לקבלת תוצאות דגימה. נתוני QC מניתוח ספקטרופוטומטר כפול ומדידת פלואורומטר סינגולרי של dsDNA וכל זיהום לדגימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור 8: עקומת התכה לדוגמה. עקומת התכה עבור נתונים לדוגמה כפי שנוצרו בתוכנה. השיא המוקדם יותר ~ 80 ° C מייצג את אמפליקון הטלומרים והשיא המשני ב ~ 89 ° C מייצג את אמפליקון אלבומין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
עבור פרויקט זה, יעילות הטלומרים הממוצעת הייתה 98.6% עם טווח של 90.7 עד 102.1 ויעילות האלבומין הממוצעת הייתה 102.3% עם טווח של 93.6 עד 108.2 בכל הריצות. היה ממוצע של 0.97 עותקים משוכפלים שהוסרו מהעקומות הסטנדרטיות, מה שעומד בקריטריוני QC של פרוטוקול זה. קורות החיים הבין-לוחית הממוצעים היו 1.83% עם SD של 0.00616 וקורות החיים התוך-לוחית הממוצעים היו 3.78% עם SD של 0.00658. ממוצע ה-TL עבור מדגמים מייצגים אלה מוצג בטבלה 4 ובטבלה 5. ה-TL הממוצע היה 1.37 עם SD של 0.24 וטווח של 0.84 עד 2.32. יחס T/S, SD, CV ו-TL עם ציון Z לכל מדגם מפורטים בטבלה 4. מכיוון שפלט יחס T/S של בדיקת MMqPCR הוא מדידה יחסית של TL, היחסים הפכו לציון Z זה כדי לאפשר השוואה צולבת. ICC עבור פרויקט זה חושב באמצעות סקריפט R כמתואר בהנחיות TRN הנמצאות בקובץ משלים 2, תוך התחשבות באפקטים של אצווה והפעלה20. על מנת לחשב את ה-ICC בתוך הפרויקט, הרצנו מחדש 10% מהדגימות החולפות, והקפדנו לאכלס את לוחות ICC בדגימה אחת לפחות מכל צלחת של הקבוצה. ICC הפרויקט הכולל של 0.801 [CI: 0.703, 0.86] מציין את יכולת השחזור הגבוהה של תוצאות TL.
לא כל התוצאות יהיו אופטימליות. התוצאות באיור 9 ובטבלה 7 מראות תוצאות תת-אופטימליות מבדיקת MMqPCR. איור 9 מציג עקומה סטנדרטית עם יעילות טלומרים מתחת ל-90%, שהיא מתחת לתקני QC, מה שמחייב חזרה על כל הצלחת. בעיות עם יעילות פריימר נובעות בדרך כלל מבעיה עם ריאגנטים, ולכן חשוב לעקוב אחר התאריכים שבהם ריאגנטים הם aliquoted ומתי הם פג כצעד ראשון בקביעה איזה מגיב אחראי על יעילות נמוכה. ריאגנטים שפג תוקפם צריכים להיות מוחלפים לפני הפעלת הצלחת שוב. טבלה 7 מציגה לוח שעבר את קריטריוני QC הראשוניים ברמת הדגימה, אך יש לו רמה גבוהה של שונות בין הלוחות, מה שמוביל לכשל QC ברמת הצלחת. השונות בין הצלחות נובעת בדרך כלל מטעויות בטכניקות הפיפטינג ומילוי הצלחות. במקרה זה, על הטכנאי להעריך את כל הבעיות שהתרחשו במהלך הגדרת הצלחת ולוודא שהפיפטות מכוילות אותן.
איור 9: תוצאות תת-אופטימליות. עקומה סטנדרטית זו המוצגת בתוכנה לא עברה QC, שכן יעילות ההגברה של פריימר הטלומרים הייתה פחות מ -90%. התמונה לקוחה מ-P1, אך ל-P2 הייתה יעילות נמוכה דומה. לא ניתן היה להשתמש בנתונים מריצה זו והיה צורך להפעיל שוב את כל הדגימות לאחר החלפת מגיב הסיבתי שפג תוקפו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 7: תוצאות תת-אופטימליות. הטבלה מציגה את תבנית נתוני הטלומרים עבור ריצה שבה רבות מהדגימות לא עמדו בתקני QC. דוגמאות שהיה צורך להריץ מחדש נקבעו על סמך ערכי CV ואז שם המדגם שונה לגופן אדום לזיהוי קל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: תבנית גיליון אלקטרוני של נתוני Telomere. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: חישוב ICC. פרוטוקול זה נוצר על ידי רשת המחקר של טלומר (TRN). קובץ זה שונה מ-20. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: הנחיות דיווח TRN. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
השיטה הנפוצה ביותר למדידת TL במחקרים מבוססי אוכלוסייה גדולים יותר, לפני 2002, הייתה ניתוח הכתם הדרומי של אורכי שברי הגבלה טרמינליים (TRF)24,25. TRF, למרות שהוא מספק דיוק ויכולת שחזור מעולים במעבדות מיוחדות, מוגבל בתחולתו בשל כמות ואיכות הדנ"א הנדרש והתפוקה המוגבלת, ובכך מספק את הרקע לניצול מוגבר של מבחני TL מבוססי qPCR, ולאחר מכן מבחן MMqPCR. שיטת MMqPCR TL מספקת מדידת TL הניתנת לחזרה בעת הגדרה, אופטימיזציה ותחזוקה תוך תשומת לב קפדנית לכל קריטריוני QC. החישוב והדיווח של ICC הספציפי עבור כל קבוצה שנותחה נדרשים כדי להבטיח את אמינות הבדיקה. בעוד שהיא כפופה לאיכות ה- DNA ולמומחיות טכנית, שיטת MMqPCR מתאימה היטב למחקרים מבוססי אוכלוסייה גדולים החוקרים TL מכיוון שהיא דורשת כמויות קטנות של DNA, אמינה יותר מ- PCR יחיד, והיא יעילה יותר בעלויות מגיב וזמן טכנאי מאשר שיטות אחרות. היכולת ליצור ICCs גבוהים מספקת נתונים נוספים התומכים בשימוש ב- MMqPCR למחקרים מבוססי אוכלוסייה גדולים של TL. מדידת MMqPCR TL יכולה להיות מיושמת במגוון רחב של מחקרים המבקשים להגדיר את תפקידו של TL כסמן ביולוגי של תמותה מכל הסיבות, הזדקנות, מתח לכל החיים, חשיפות סביבתיות ותוצאי בריאות גופנית כגון מחלות לב וכלי דם וסרטן 4,7,8,10,11,12,13,26,27,28, 29,30,31.
מגבלה אחת של שיטת MMqPCR היא שהיא מדווחת על TL כיחס T/S, אומדן יחסי של אורך המשתנה בהתאם לבחירת גן עותק יחיד, הרכב תערובת אב ופרמטרים של מחזור PCR32. יחס T/S הוא חסר יחידה. לפיכך, ללא שילוב עם מתודולוגיות מדידה אחרות של TL, שיטה זו אינה מסוגלת לדווח על אומדנים בערכי זוגות בסיסים 18,33,34. כתוצאה מכך, יש להפוך את יחס T/S לציון Z כדי להיות רלוונטי בין מחקרים35. יש לנקוט משנה זהירות כאשר עושים זאת במעבדות, שיטות ובדיקות. יתר על כן, שיטה זו, כמו עם בדיקות הכלאה מבוססות ג'ל, יכול לכלול כימות של טלומרים interstitial. עם זאת, רצפים אלה מהווים חלק קטן מאוד מתכולת הדנ"א הכוללת של הטלומרים בכל גנום. בנוסף, רצפים טלומריים אינטרסטיציאליים נוטים יותר להכיל רצפי זוגות בסיסים שאינם תואמים אשר חורגים מחזרות הטלומרים הקנוניות, מה שמקטין את הסבירות לקשירה והגברה של פריימר. בנוסף, בעוד שהכמות המינימלית של DNA הדרושה לבדיקת MMqPCR היא יתרון, חשוב לציין כי מדידות מבוססות qPCR של TL מושפעות מגורמים פרה-אנליטיים המשפיעים על איכות ושלמות ה- DNA, כולל תנאי אחסון דגימות, מתודולוגיית מיצוי DNA ורקמות ביולוגיות36,37. הוכח כי בקרה אנליטית עבור גורמים אלה יכולה לשפר את התוקף החיצוני של מדידות TL שנוצרו באמצעות qPCR38. אף על פי כן, ההשפעה של הבדלים באיכות הדנ"א על TL הנוצרת על ידי בדיקת MMqPCR באופן ספציפי צריכה להיות מוערכת באופן שיטתי, מכיוון שלא קיימת הדרכה עדכנית מבוססת נתונים לקביעה אם דגימה היא באיכות מספקת כדי ליצור הערכה מדויקת של TL באמצעות גישה זו. למרות מגבלות אלה, היישומים של בדיקה זו למחקרים על תוצאות בריאותיות ברמת האוכלוסייה הם ניכרים.
בעת שימוש בבדיקת MMqPCR, נדרשת הערכה מתמדת של דיוק ותפוקה. כפי שתוכנן כעת, טכנאים מריצים טריפליקטים של דגימות בו זמנית על לוחות כפולים באמצעות שני thermocyclers. בהיעדר תרמוסייזרים מרובים, אנו ממליצים לשמור מדידות כפולות-משולשות ולוחות הפעלה ברצף לקבלת דיוק משופר גם במחיר של תפוקה מופחתת. כל החלטה לתעדף תפוקה על פני דיוק, למשל על ידי שימוש במדידות משולשות בודדות, צריכה להיות מלווה בבדיקה יסודית והערכה של ה- ICCs המתקבלים לפני שתמשיך בניתוח של דגימות אנליטיות. בעת קבלת החלטות לגבי תפוקה ודיוק, יש לקחת בחשבון את גודל הדגימה ואת איכות ה- DNA של הדגימה. גודל דגימה קטן יותר או דגימות דנ"א באיכות ירודה מחייבים מתן עדיפות לדיוק גבוה יותר23. יש לכך חשיבות גדולה עוד יותר בעבודה עם דגימות מקבוצות קשורות (למשל, בני משפחה, נבדקים עם נקודות זמן מרובות). במקרים אלה, תכנון זהיר, למשל הקצאת דגימות קשורות לאותה צלחת לפני תחילת הניסוי, הוא אחת הדרכים למנוע אובדן כוח סטטיסטי באמצעות קבוצה לא מכוונת על ידי בלבול לוחות.
לצורך בדיקה זו נעשה שימוש בספקטרופוטומטר להערכת איכות דגימת ה-DNA: דגימות בטווח של 1.6-2.0 עבור יחסים של 260/280 ו-2.0-2.2 עבור יחסים של 260/230 נחשבו מקובלות. הערכת איכות זו וההערכה המדויקת של DNA דו-גדילי באמצעות פלואורומטר הם שלבים קריטיים בפרוטוקול זה לקבלת נתוני TL הניתנים לחזרה. מדדים אחרים, תיאוריים יותר, של שלמות הדנ"א, כגון גודל המקטע ו / או מדדי סיכום של איכות ה- DNA שנקבעו באמצעות ג'ל אגרוז (למשל, מספר שלמות DNA) עשויים לשמש גם בקביעת איכות הדגימה38. כמו כן, אנו ממליצים כי דילול הדגימות יתרחש רק בזמן הכנת הדגימה להפעלת בדיקת MMqPCR. זה מבטיח כי aliquots DNA לעבור כמות מינימלית של מניפולציה לאחר מיצוי ככל האפשר, הפחתת השונות בטיפול לפני המבחן. אם יש צורך להעביר דגימות DNA, יש לשלוח אותן על קרח יבש בריכוז הגבוה ביותר האפשרי כדי למתן את ההתפרקות המתרחשת בדגימות DNA בריכוזים נמוכים יותר39,40. בשל השפלת הדנ"א המתרחשת במחזורי הקפאה-הפשרה, יש למזער את מספר הפשרות ההקפאה למלאי הדנ"א41. יש ליצור Aliquots של DNA הבקרה המאוגמת לפני הפעלת הקוהורט וליצור aliquots של דגימות DNA אנליטיות בודדות לפני הפעלת הבדיקה.
מדדי מפתח של ביצועי בדיקה ו- QC כוללים אות NTC, קורות חיים interplate ו- intraplate ועקומה סטנדרטית R2. אי עמידה בקריטריוני QC ניתן למתן במספר דרכים. שינוי מלאי PCR דרגה H2O באופן קבוע וציטוט של תת-מלאי PCR דרגה H2O עבור כל זוג לוחות לרוץ ימזערו את מקורות הזיהום, כמו גם הגברת NTC. צעדים נוספים להפחתת זיהום כוללים: הגדרת מכסה מנוע PCR ספציפי המוקדש לבדיקת MMqPCR בלבד; ניגוב מכסה המנוע והציוד של ה-PCR באמצעות תמיסת טיהור DNA; הקרנת החדר באור אולטרה סגול; ותרגול טכניקה סטרילית כאשר במכסה המנוע PCR. כדי לשפר את יכולת החזרה של הבדיקה ולהקטין את קורות החיים, מומלץ לבצע מערבולות דגימות, דילולים ורצועות PCR במרץ בשלבי המערבולת המתאימים להן ולהשהות מחדש ביסודיות בעת ביצוע דגימות DNA. עקומת R2 סטנדרטית מתחת לסף (<0.995) מיוחסת ככל הנראה לשגיאות צנרת במהלך טעינת לוחות. כדי להימנע מכך, שימו לב היטב לצנרת מדויקת וכיילו פיפטים מדי שנה, ערבבו במרץ רצועות PCR סטנדרטיות לפני הטעינה, וארגנו בזהירות חומרים מתכלים כדי לקדם זרימת עבודה יעילה. אם נצפה שימוש בשתי מכונות וצלחת אחת כדי להפיק קורות חיים גבוהים יותר באופן עקבי, יש לטפל במכונה כדרך פוטנציאלית להקל על הבעיה. לוחות QC מהיצרן צריכים להיות מופעלים על הצלחות באופן קבוע כדי להעריך את הביצועים של thermocycler.
אם הבעיות נמשכות גם לאחר יישום השלבים המומלצים לעיל, ניתן להשתמש בשלבים הבאים כדי לפתור את בעיות הפרוטוקול. שמירה על תיעוד של מתי כל הריאגנטים היו aliquoted וכל תאריכי התפוגה הרלוונטיים יכול לעזור לייעל את תהליך פתרון הבעיות כאשר קשיים מתעוררים באופן בלתי נמנע. חלק חשוב בכל תהליך פתרון בעיות הוא להתאים רק מגיב אחד בכל פעם כדי לקבוע את הגורם הספציפי לכך שצלחות לא עוברות את קריטריוני ה- QC, החל מגיב הזול ביותר המדובר. לדוגמה, אם גם לטלומרים וגם לגן עותק יחיד יש יעילות נמוכה, ריאגנטים משותפים כגון DTT, dNTPs, או SYBR aliquot הם הסיבה סביר יותר מאשר פריימרים ספציפיים לאמפליקון. במחיר הרשום, aliquots חדש צריך להיבדק בסדר של DTT, ולאחר מכן dNTPs, ולאחר מכן, אם הבעיה עדיין נמשכת, חדש SYBR aliquots. לעומת זאת, אם רק לאחד האמפליקונים (טלומרים או גן העתק יחיד) יש יעילות נמוכה, הגורם לקושי הוא סביר יותר לאחד הפריימרים. פענוח פסגות עקומת ההיתוך המוצגות באיור 8 יכול לשמש כמקור מידע מרכזי לפתרון בעיות. ניתן להשתמש בהדמיה של שתי פסגות עקומת ההתכה כדי לזהות בעיות פוטנציאליות במדגם מסוים, שכן מדגם בעיה בודד יבלוט מהמגמה הכללית של פסגות המוצגות על ידי תקנים או דגימות אנליטיות נותרות. עקומת ההתכה יכולה לשמש גם לאבחון בעיות בפריימר מסוים אם הפסגות של אמפליקון נתון הן באופן שיטתי פחות חדות מאחרות.
כתב יד זה מפרט כיצד להגדיר בהצלחה את בדיקת MMqPCR למדידת TL עם ישימות רחבה למחקר בריאות הציבור ומציג המלצות מרכזיות עבור QC ופתרון בעיות במטרה להגביר את הנגישות והאמינות של שיטה יעילה וחסכונית זו.
למחברים אין מה לחשוף.
המחברים רוצים להודות לוועדה המייעצת של רשת המחקר של טלומר ולמכון הלאומי להזדקנות / המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (U24 AG066528 ו-U24 AG066528-S1) שאפשרו עבודה זו.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5mL Tubes | USA Scientific | 1605-0099 | Seal-Rite 0.5mL Microcentrifuge Tubes, Sterile Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
1.5mL Tubes | USA Scientific | 1615-5599 | Seal-Rite 1.5mL Microcentrifuge Tubes, Sterile Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
100mM DTT | In House | Not Applicable | Made with stock DTT, diluted sodium acetate, and PCR Grade H2O Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C |
15mL Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | Corning 352196 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
1M MgCl2 | Thermo Fisher | 50152107 | Biotang Inc 1M MgCl2 1M Magnesium Chloride Solution, Prepared in 18.2 Megohms Water and Filtered through 0.22 Micron Filter Storage Temperature and Conditions: 4 °C |
1x Gold Buffer | In House | Not Applicable | 10X Gold Buffer diluted with PCR Grade H2O Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C |
25mM dNTPs | New England BioLabs | N0446S | Deoxynucleotide Solution Set Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C |
5mL Tubes | Thermo Fisher | 3391276 | Argos Technologies Microcentrifuge Tubes – 5mL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
96 Well Plate | Bio-Rad | HSP9601 | Hard-Shell 96-Well PCR Plates, Low Profile, Thin Wall, Skirted, White / Clear Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Aluminum Foil | Office Depot | 3489072 | Reynolds Wrap Stanard Aluminum Foil Roll, 12" x 75', Silver Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
AmpliTaq Gold Kit – Polymerase and Buffer | Thermo Fisher | 4311806 | AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 (MgCl2 in this kit is not used), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C |
Betaine | Thermo Fisher | AAJ77507AB | Betaine, 5M Solution, Molecular Biology Grade, Ultrapure, 10mL Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C |
Big Tube Rack | Thermo Fisher | 344817 | Fisherbrand 4-Way Tube Rack Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
CFX Maestro Software | Bio-Rad | 12004110 | Software for real-time PCR plate setup, data collection, statistics, and graphiing of results Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems with Starter Package | Bio-Rad | 1845096 | 96-well optical module for real-time PCR Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
DTT | Fisher Scientific | AAJ1539706 | Dithiothreitol, >99.5+ Molecular Biology Grade, 5 g Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C |
ELIMINase | Fisher Scientific | 04-355-32 | ELIMINase Laboratory Decontaminant Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
HEPA Filter | USA Scientific | Replacement Filters | High-Efficiency Particulate Air Filter for AirClean Workstations Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Kimwipes | Thermo Fisher | 06666A | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Loading Trough | Thermo Fisher | 14387069 | Thermo Scientific Matrix Reagent Reservoirs Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Microsoft Excel | Microsoft | Not Applicable | Microsoft 365 package, Excel software application Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Mini Centrifuge | Genesee Scientific | 31-500B | Poseidon 31-500B Mini Centrifuge, Blue Lid Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
PCR Grade H2O | Thermo Fisher | AM9937 | Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
PCR Hood | USA Scientific | 4263-2588 | Nucleic Acid Workstation with HEPA Filtration, AirClean Systems Combination PCR Workstation Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
PCR Strips | Thermo Fisher | AB0776 | Low Profile Tubes and Flat Caps, Strips of 8 Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
PCR Tube Rack | Thermo Fisher | 344820 | Fisherbrand 96-Well PCR Tube Rack Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipette Tips (Multichannel) | Ranin | 17005860 | Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5, 20µL Maximum Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipette Tips (Single Channel) | USA Scientific | 1181-3850 | 10µL Graduated TipOne RPT Filter Tips Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipette Tips (Single Channel) | USA Scientific | 1180-1850 | 20µL Beveled TipOne RPT Filter Tips Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipette Tips (Single Channel) | USA Scientific | 1111-0880 | 200µL Natural TipOne Pipette Tips in Racks Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipette Tips (Single Channel) | USA Scientific | 1111-2890 | 1000µL Natural Graduated TipOne Pipette Tips in Racks Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipettors (Multichannel) | Ranin | 17013802 | Pipet-Lite Multi Pipette L8-10XLS, 0.5 to 10µL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipettors (Multichannel) | Ranin | 17013803 | Pipet-Lite Multi Pipette L8-20LS+, 2 to 20µL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipettors (Single Channel) | Thermo Fisher | F144802G | Gilson Pipetman Classic Pipets, 1 to 10µL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipettors (Single Channel) | Thermo Fisher | F123600 | Gilson Pipetman Classic Pipets, 2 to 20µL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipettors (Single Channel) | Thermo Fisher | F123601 | Gilson Pipetman Classic Pipets, 20 to 200µL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pipettors (Single Channel) | Thermo Fisher | F123602 | Gilson Pipetman Classic Pipets, 200 to 1000µL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Plate Sealing Film | Bio-Rad | MSB1001 | Microseal “B” PCR Plate Sealing Film, Adhesive, Optical Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Plate Spinner | Thermo Fisher | 14-100-141 | Fisherbrand Mini Plate Spinner Centrifuge, 230 V Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Pre-Hood Filter | USA Scientific | 4235-3724 | Prefilter for AirClean Systems Workstations Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
R Software | The R Project for Statistical Computing | Not Applicable | R version 4.2.2 Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Scale | Thermo Fisher | 01-922-329 | OHAUS 30430060 PR Series Analytical Balance, 62g Capacity Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Scissors | Office Depot | 458612 | Office Depot Brand Scissors, 8”, Straight, Black, Pack of 2 Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Sharpies | Sharpie | 2151734 | Brush Twin Permanent Markers, Black Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Single Copy Gene Forward Primer | Integrated DNA Technologies | Custom | See separate table Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated |
Single Copy Gene Reverse Primer | Integrated DNA Technologies | Custom | See separate table Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated |
Small Tube Rack | Thermo Fisher | 21-402-17 | Thermo Fisher 8601 Reversible Microtube Racks with Lid Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Sodium Acetate | Thermo Fisher | J63560.EQE | 3M NaOAc pH 5.2 Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Stainless Steel Spatula | Thermo Fisher | 3990240 | Bel-Art SP Scienceware Stainless-Steel Sampling Spoon and Spatula Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
SYBR Green | Thermo Fisher | S7563 | SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain – 10,000X Concentrate in DMSO Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated |
Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-927-55A | GD/X 25 mm Sterile Syringe Filter, cellulose acetate filtration medium, 0.2 μm Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Syringes | Thermo Fisher | 148232A | BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles, 10mL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
TE Buffer | Fisher Scientific | BP2474100 | TE Buffer, Tris-EDTA, 1X Solution, pH 7.6, Molecular Biology, Fisher BioReagents Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Telomere Forward Primer | Integrated DNA Technologies | Custom | See separate table Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated |
Telomere Reverse Primer | Integrated DNA Technologies | Custom | See separate table Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C when rehydrated |
UV Light | USA Scientific | 4288-2540 | UV Light Bulb for Workstations Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Vortex | Thermo Fisher | 14-955-151 | Fisherbrand Mini Vortex Mixer, 115 V, 50/60 Hz Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Weigh Boat | Thermo Fisher | 01-549-752 | Fisherbrand Sterile Hexagonal Weighing Boat, 10mL Storage Temperature and Conditions: Room temperature |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved