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要約

ここでは、モノクロマルチプレックス定量的ポリメラーゼ連鎖反応(MMqPCR)アッセイを使用して相対テロメア長(TL)を測定するためのプロトコルを示します。MMqPCRアッセイは、集団ベースの研究においてヒトDNAからTLを測定するための再現性があり、効率的で、費用対効果の高い方法です。

要約

テロメアは、すべての真核生物の染色体の末端にあるリボ核タンパク質構造で、DNAを損傷から保護し、染色体の安定性を維持します。テロメア長(TL)は、さまざまな曝露、生物学的プロセス、および健康上の結果と関連しています。この記事では、ヒトDNAの相対平均TLを測定するために当研究室で日常的に実施されているモノクロマルチプレックス定量的ポリメラーゼ連鎖反応(MMqPCR)アッセイプロトコルについて説明します。PCRベースのTL測定法にはいくつかの種類がありますが、この論文で紹介されているMMqPCR法の特定のプロトコルは、再現性があり、効率的で、費用対効果が高く、集団ベースの研究に適しています。この詳細なプロトコルは、研究者が自分の研究室でこのアッセイを確立するために必要なすべての情報を概説しています。さらに、このプロトコルは、同じサンプルの反復測定にわたるクラス内相関係数(ICC)によって定義される、このアッセイによるTL測定の再現性を高めるための特定のステップを提供します。ICCは、特定の研究集団の期待検出力を評価する上で重要な要素です。そのため、TLアッセイのコホート特異的ICCを報告することは、TLの集団ベースの研究の全体的な厳密性を高めるために必要なステップです。末梢血単核細胞から抽出したDNAサンプルを用いた結果例は、このMMqPCRプロトコルを使用して再現性の高いTLデータを生成する可能性を示しています。

概要

テロメアは、すべての真核生物の染色体の末端に見られる保護複合体であり、高度に保存された反復DNA配列と関連タンパク質で構成されています。テロメアはDNAの完全性を保護し、染色体の安定性を維持します。テロメアの進行性短縮は、不完全な遅鎖DNA合成、DNA損傷、およびその他の要因の結果として、分裂細胞で発生します1,2。テロメア長(TL)が人間の生涯にわたる老化および加齢性疾患のバイオマーカーであることを裏付ける証拠の増加に伴い、ヒトへの曝露、疾患、および健康の研究におけるTLの役割を評価するために利用されるTL測定アッセイの種類が増加している3,4,5。メタアナリシスでは、TLと全死亡率、環境曝露、およびがん、心血管疾患、糖尿病などの健康転帰との関連が報告されています6,7,8,9,10,11,12,13 .これらのメタアソシエーションは、アソシエーションの強さが異なる方法論14,15,16間で異なる傾向がある2ダース以上の異なるTL測定方法論の1つを利用した研究から導き出されます。調査研究に最適なTL測定方法を選択することは、各方法が独自の長所と短所を持っているため、正確な結果を確保するための重要なステップです5,17。

試薬のコストが比較的低く、アッセイのターンアラウンドが迅速で、拡張性があり、初期DNA要件が少ないため、PCRベースのTL測定技術は、大規模なサンプル集団を持つ研究、高濃度のサンプルへのアクセスが限られている研究、またはハイスループットを優先する研究を行う場合に優先的に利用されることがよくあります。TL測定の最初のPCRベースの方法である、リチャード・カウソンによって最初に開発されたシングルプレックス定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、テロメア(T)とシングルコピー遺伝子(S)増幅の蛍光シグナルの比を利用し、別々のPCRプレート上で実行される18。このアプローチでは、反復テロメアDNA配列(T)に相補的なプライマーを使用して、サンプル中の全テロメアDNA含有量を増幅し、蛍光レポーターSYBR greenの検出によって定量します。同様に、保存された単一コピー(S)遺伝子の遺伝子間領域に相補的なプライマーを使用して、ゲノムコピー数を定量化します。これら 2 つの推定値は、プレート間のばらつきを制御するプロジェクト内のすべてのアッセイで使用されるゲノム DNA 標準曲線に対して定量化されます。全テロメアDNA(T)を単一ゲノムコピー数(S)で割ると、T/S比、つまり個々のDNAサンプル18,19の細胞当たりの平均テロメア含量を表す単位のない相対測定値が得られる。したがって、T/S 比は機能的な長さの特定の測定値ではありません。ただし、文献の基準と一致して、このプロトコル全体でサンプルあたりの平均TLという用語を使用します。

この方法は、2009年にRichard CawthonがモノクロマルチプレックスqPCR(MMqPCR)アッセイを、元のシングルプレックスqPCR法19と比較してT/S比の変動性を潜在的に低減するアプローチとして説明したときに進歩しました。MMqPCRアッセイは、qPCRアッセイの利点に加えて、1つの報告蛍光色素を使用して同じ反応ウェル内のTシグナルとSシグナルを測定するという追加の利点を備えているため、シングルプレックスqPCRに比べてエラーが減少し、精度と再現性が向上します19。さらに、このマルチプレックス法は、シングルプレックスアッセイ19と比較して必要な反応回数が半分であるため、コストを削減し、スループットを向上させる可能性がある。

MMqPCR TL測定の利点を考えると、この方法は、曝露、健康転帰、および生物学的プロセスとのTL関連に関する集団ベースの研究に適しています。ただし、このメソッドを開始するのは難しい場合があります。これらの課題に対処するために、当研究室で利用されているMMqPCR TL測定プロトコルについて詳しく説明し、アッセイの精度を高め、汚染リスクを低減し、再現性を高めるために実施された主要なステップに焦点を当てています。

さらに、このプロトコルでは、データをクリーニングし、TL測定の再現性の重要な統計的尺度であるクラス内相関係数(ICC)を計算するための手順を概説します2。私たちの代表的な結果により、このプロトコルを使用して高ICCを生成する能力を実証しています。さらに、TL測定値のばらつきを減らし、結果として生じるICCを増加させることが期待される品質管理(QC)とトラブルシューティングの手順を特定します。この方法の高い再現性、効率性、費用対効果により、MMqPCR TL測定は疫学TL研究に最適です。 図1は、このプロトコルで説明されているMMqPCR法の概要を視覚的に示しています。

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図1:メソッドの概要。 テロメアの長さを測定するためのモノクロマルチプレックス定量的ポリメラーゼ連鎖反応法の広範な概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

この研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。このプロトコルは、重複するトリプリケートの測定深度、すなわち、各サンプルを重複するプレート間で繰り返されるトリプリケート測定で実施するMMqPCRアッセイを、スループットを向上させるために2つのサーモサイクラーを同時に使用して実装するものです。重複プレートの使用は、高いICCで示される高い再現性を達成するために、このプロトコルの実装において最も重要な考慮事項です。より少ない反復を使用することは可能であるが、ICCへの影響、ひいては検出力および必要なサンプルサイズへの影響は、各検査室20,21による各コホートで慎重に検討され、測定される必要がある。サーモサイクラーが1つしかない場合は、測定深度を維持し(つまり、重複するトリプリケート)、2つのプレートを順番に実行することをお勧めします。

1. ストックの調製および保管条件

  1. このプロトコルに使用されるすべての材料と機器については、 材料の表を参照してください。さらに、MMqPCRアッセイに使用した特定のマスターミックス試薬および量については、 表1を参照してください。2つのプレートを連続して分析する場合は、濃度を維持しながらマスターミックスの量を半分にし、同じアッセイの連続したプレート間で同じ試薬アリコートが使用されるようにします。
    注:すべてのストック試薬は事前に準備し、分注した試薬は完全に解凍してから使用する必要があります。
  2. 1x Tris-EDTA、pH 7.6 (TE) を 5 mL チューブに入れ、室温 3 mL で最大 2 年間分注して保存します。
  3. 5 M Betaine を 5 mL チューブに入れ、1,280 μL 容量、-20 °C で最大 1 年間分注して保存します。
  4. SYBR Greenを3 μLの容量で個々のPCRストリップチューブに-20°Cで最大2年間分注し、ホイルで覆い、光への曝露を最小限に抑えて保存します。
  5. DNAポリメラーゼを元のチューブに-20°Cで最大1年間保存します。
  6. 10x ポリメラーゼバッファーを 1.5 mL チューブに入れ、660 μL の容量で -20 °C で最大 1 年間分注して保存します。
    1. 10xポリメラーゼバッファーを1倍バッファー希釈する場合は、0.5 mLチューブ中の89.1 μLのPCRグレードH2Oに9.9 μLの10xバッファーを添加します。-20°Cで最大1年間保管してください。
  7. 1 M MgCl2 を0.5 mLチューブに70 μLの容量で分注し、光から4°C離して最大1年間保存します。
  8. フォワードテロメアおよびリバーステロメア(T)およびシングル(S)コピー遺伝子オリゴヌクレオチド凍結乾燥プライマーは、光から離れた室温で保存してください。4つの特異的オリゴヌクレオチドプライマー配列を 表2に示します。
    注:このプロトコルの単一コピー遺伝子はアルブミンです。異なるシングルコピー遺伝子を選択する場合、許容可能なPCR効率を確保するためにプライマー濃度を調整する必要がある場合があります。
    1. プライマーの再構成:凍結乾燥プライマーチューブを各チューブに10秒間ボルテックスし、次にチューブをミニ遠心分離機に5秒間入れて、凍結乾燥ペレットがチューブの底にあることを確認してから、1x TEバッファーを添加します。
    2. 各プライマーチューブのnM濃度([nM]= α)を確認し、各プライマーチューブにα値の10倍に等しい1x TEをμLで追加して再水和します(たとえば、チューブのnM濃度が24.6 nMを示している場合は、プライマーチューブに246 μLの1x TEを添加して、各プライマーの100 μM溶液を作成します)。
    3. フォワードテロメアプライマーとリバーステロメアプライマーは16 μL容量で別々に、フォワードおよびリバースアルブミンプライマーは11 μL容量で別々にアリコートします。4種類のプライマーアリコートはすべて、-20°Cで最大6ヶ月間保存してください。
  9. dNTP混合物:4種類のdNTPSタイプの25 mMストック溶液(つまり、合計16〜32本のチューブ)のそれぞれを4〜8本のチューブで10秒間ボルテックスした後、ミニ遠心分離機を使用して室温ですばやくスピンダウンします。ミニ遠心分離機のチューブ位置にチューブを均等に配置し、蓋を閉めて機械が全速力に達し、約5秒間回転します。
    1. 5 mLのチューブに、各チューブから200〜250 μLを加え、4つのdNTPタイプのそれぞれを均等に追加し、dNTP混合物をボルテックスします。
    2. 210 μLの混合物を0.5 mLチューブに分注し、-20°Cで最大1年間保存します。
  10. ストックDTTは-20°Cで保存し、3 M酢酸ナトリウムは室温でストックします。
    1. DTTソリューション:ステンレス製のヘラを使用して、はかりで風袋を塗った計量ボートで0.1545 gのDTTを測定します。
      注意:ジチオスレイトール(DTT)は危険な試薬です。DTTは、飲み込むと有害で、皮膚の炎症を引き起こし、深刻な眼の損傷を引き起こす可能性があります。DTTを取り扱うときは、保護手袋、目の保護具、顔の保護具を着用する必要があります。さらに、DTT蒸気の呼吸を避け、DTTを取り扱うときはPCRフードで作業し、長時間または繰り返しの曝露を避ける必要があります。
    2. 15 mLチューブに33.33 μLの3 M酢酸ナトリウムと9,967 μLのPCRグレードH2Oを加えて、0.01 M酢酸ナトリウム10 mLを調製し、ボルテックスウェルでウェルします。測定したDTTを0.01 M酢酸ナトリウムの15 mLチューブに加えます。0.01 M酢酸ナトリウム溶液の約100 μLを計量ボートに移し、残留DTTを回収します。100 μLをピペットで15 mLチューブに戻します。すべてのDTTが溶液中に入ったら、チューブが完全に溶解するまでチューブをボルテックスします。
    3. 15 mLチューブの内容物をローディングトラフに注ぎ、ローディングトラフの一方の端から溶液全体を10 mLプラスチックシリンジに吸引します。滅菌済みの0.2μmの酢酸セルロースシリンジフィルターを充填したシリンジの端に25mm取り付け、1分間完全に飽和させた後、シリンジプランジャーを軽く押し下げて新しい15mLチューブに溶液をゆっくりと滴下し、溶液全体がフィルターを通って新しい15mLチューブに滴下されるようにします。
    4. 200 μLの容量のDTT溶液を0.5 mLチューブに分注し、-20°Cで最大6週間保存します。

表1:試薬の最終容量と濃度。 個々のアリコート、マスターミックス、およびPCRウェル中の試薬の量と濃度。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:テロメアおよびシングルコピー遺伝子オリゴヌクレオチドプライマー配列。 方法論で使用されるテロメアおよびアルブミンシングルコピー遺伝子プライマー配列のリスト。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

2. ゲノムDNAの抽出とサンプル調製

  1. 分析サンプルの抽出:キットまたはラボ内で確立された方法を使用して、メーカーのガイドラインに従ってサンプルのゲノムDNA抽出を行います。
    1. 分光光度計でDNAサンプルの品質を確認し、蛍光光度計で二本鎖DNA(dsDNA)を確認します。許容できない平均比 260/280 および 260/230 のサンプル、または検出を下回る dsDNA 濃度 (<0.20 ng/μL) のサンプルは、TL22,23 について分析しないでください。さらに、dsDNA濃度が高すぎて蛍光光度計を使用して読み取り値を生成できない場合は(>1000 ng/μL)、サンプルを希釈してアッセイを繰り返します。
      注:ここで提示された結果について、核酸の純度の許容値は、1.6〜2.0の260/280比と2.0〜2.2の260/230比でした。
  2. コントロールサンプルの抽出:特定のプロジェクトでアッセイされている対象サンプルと同じ生物学的材料から得られたコントロールサンプルに対してゲノムDNA抽出を実行します。すべてのアッセイで単一のDNA標準が利用されるように、コホート全体で実行することが予想されるすべてのプレートに対して十分なコントロールDNAを抽出するようにしてください。
    1. 分光光度計と蛍光光度計でコントロールDNAサンプルの品質を確認します。対照サンプルは、許容可能な平均 260/280 および 260/230 の比率と、dsDNA22,23 の検出可能な濃度を持っている必要があります。
    2. サンプルタイプと日付を標識した0.5 mLチューブに、150 μL量で2 ng/μLの濃度のアリコートコントロールDNA。コントロールDNAアリコートは-20°Cで最大5年間保存してください。同じコホートまたは研究プロジェクトから得られたすべてのサンプルのすべてのプレートに対して、1つのコントロールDNAサンプルを使用します。これらのストックアリコートを事前に準備してください。
  3. 分析サンプルの調製:開始濃度が>5 ng/μLのサンプルの場合、整数希釈係数を使用して希釈アリコートを作成し、抽出したDNAサンプル(Supplementary File 1 MMqPCR Set Up Sheet、カラムF)とPCRグレードH2O(Supplementary File 1 MMqPCRセットアップシート、カラムG)を添加して、濃度を2.5〜5.0 ng/μLに希釈します(Supplementary File 1 MMqPCRセットアップシート、列K)。<5 ng/μLの濃度でサンプルを希釈しないでください、ただし、このプロトコルを使用してサンプルを3倍アッセイするのに十分な量を分注してください。
    注:希釈アリコートは、各サンプルの対応するPCRストリップチューブに15 ngのDNAを添加できるように、サンプル調製中に作成する必要があります。サンプルアリコートにより、技術者は、サンプルが品質基準を満たさず、再実行が必要な場合に、ストックサンプルDNAの完全性に影響を与える不必要な凍結融解サイクルを回避できます。 補足ファイル1にあるサンプルMMqPCRテンプレートは、希釈アリコートを調製するための正しい希釈係数と容量を特定するのに役立ちます(補足ファイル1、MMqPCRセットアップシート、列E-I)。
    1. PCRストリップに、PCRストリップAのサンプルAにA1-8、PCRストリップBにサンプルB1-8、およびPRCストリップCにサンプルC1-8を、 補足ファイル1 のMMqPCRセットアップシートに詳述され、 表3 にリストされているように、適切に希釈されたサンプル量(補足ファイル1MMqPCR セットアップシート、カラムL)およびPCRグレードH2Oの量(補足ファイル1 )を充填しますMMqPCR Set Up Sheet、カラム M) で、PCR チューブあたり合計 15 ng の DNA と総量 75 μL の場合、脇に置きます。
      注:PCRストリップ内のサンプルは、4°Cで一晩保存し、翌日に播種することができます。
  4. 標準曲線の準備:コントロールDNAアリコートを解凍し、ボルテックスで30秒間、遠心分離機で5秒間遠心分離し、全容量(150μL)を標準曲線(SC)PCRチューブストリップの最初のチューブに吸引します。
    1. 70 μL の PCR グレード H2O を SC PCR ストリップの 2 本目から 8 本目のチューブにピペットで挿入します。コントロールDNAを1本目のチューブに再懸濁してから、70 μLを吸引し、2本目のPCRチューブに分注します。30 秒待ってから、溶液を 2 番目の PCR チューブに完全に再懸濁してから、70 μL を吸引して 3 番目の PCR チューブに分注します。これをチューブ 3 から 7 に対して繰り返して、7 つの標準試料を 2 倍に段階希釈します。最終的なチューブには、非テンプレートコントロール(NTC)として機能するために、PCRグレードH2Oのみが含まれている必要があります。SC PCRストリップを脇に置きます。

表3:プレート内のサンプルと管理基準の整理。 96ウェルPCRプレート上のすべてのサンプルと標準の位置。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

3. MMqPCRマスターミックスの調製

  1. 表1にリストされているマスターミックス試薬アリコート(DNAポリメラーゼを除く)を収集し、PCRフード内で室温に戻します。1 μL の SYBR Green 分注を 1x バッファー分注に加えます。
    注:この正確な量は、アッセイ中のピペットの精度の制限により、SYBRの正しい濃度を生成するために必要ですので、一度に1つのプレートのみを実行する場合でも、この量は変更しないままにする必要があります。
  2. すべてのアリコートを10秒間ボルテックスし、5秒間遠心分離した後、5 Mベタインを保持している5 mLチューブ(現在のマスターミックスチューブ)に次の量の試薬を加えます:1,235.2 μLのPCRグレードH2O、640 μLの10xバッファー、204.8 μLのdNTP、192 μLのDTT、 表1に記載されているように、MgCl2 64 μL、SYBR Green / 1x バッファー (ステップ 3.1 から) 48 μL、両方のテロメア プライマー 14.4 μL、および両方のアルブミン プライマー 9.6 μL です。
  3. DNAポリメラーゼを-20°Cで保存し、ボルテックスで10秒間、遠心分離して5秒間遠心分離し、マスターミックスに128μLをゆっくりと加えます。直ちにDNAポリメラーゼを-20°Cに戻します。
  4. 5 mLマスターミックスチューブを30秒間ボルテックスします。

4. 96ウェルプレートの作製

  1. 2つの96ウェルプレート、ローディングトラフ、およびマルチチャンネルピペットチップをPCRフード内に置きます。各プレートにプレート番号(1または2)のラベルを付けます。プレート1(P1プレート)を180°回して、列の番号が逆さまになるようにします。プレート2(P2)を技術者に向けて残します。
  2. 5 mLマスターミックスチューブの内容物をローディングトラフに注ぎます。ピペットチップを使用して、チューブに残っている溶液を収集して分注します。
  3. チップをマルチチャンネルピペットにロードし、各ピペットチップの基部を押して密閉します。チップに、マスターミックスが吸引される出力領域内にフィルターがないことを確認します。フィルターがある場合は、チップを交換してください。
  4. リバースピペッティングを使用してプレートに粘性マスターミックスを充填し、ローディングトラフを旋回させてから、ピペットプランジャーを最初のストップを超えて押し下げ、ピペットチップに15μL以上を吸引し、チップが同じ容量で同時に満たされるようにします。マスターミックスをカラムに排出するときは、プランジャーを最初のストップまで押し下げ、余分なマスターミックスをピペットチップに残します。プランジャーを押したまま、チップをローディングトラフに戻し、プランジャーを解放してチップをさらに15μL充填します。
    1. マスターミックスを最初にすべての偶数列またはすべての奇数列に排出し、プレート間で交互にプレートを充填します(つまり、技術者が奇数の列番号から開始することを選択した場合、P2の列1が最初に充填され、次にP1の列11、次にP2の列3が充填されます)。技術者が左から右に動作する系列 (奇数または偶数) のすべてのウェルを埋めたら、同じ方法で列の他の系列 (偶数または奇数) の列を実行します。このプロセスのグラフについては、 図 2 を参照してください。
      注:このプレート充填方法は、プレート全体の位置効果を制御するために機能します。
  5. サンプルと検量線を含む4つの閉じたPCRストリップをボルテックスし、ミニ遠心分離機でそれぞれを5秒間回転させます。
    1. PCRチューブラックにPCRストリップをプレートにどのように配置するかの順に並べます。P1の場合、最初の3つのカラムはサンプル(PCRストリップA)、カラム4〜6は標準(PCRストリップS)、カラム7〜9はサンプル(PCRストリップB)、カラム10〜12はサンプル(PCRストリップC; 図3 および 表3を参照)です。P2は技術者に対して180°回転させながら充填されるため、カラムは逆になります。
  6. 両方のプレートを180°回転させて、各プレートの技術者に対して列の番号が反転します(つまり、技術者が以前にP2のラベルに面していた場合、プレートの端でP1のラベルに面するようになります)。
  7. マルチチャンネルピペットを10 μLに設定し、手順4.3の説明に従ってピペットチップをマルチチャンネルピペットにロードします。
    1. マルチチャンネルピペットを使用して溶液を再懸濁し、ステップ4.4で説明した逆ピペッティングを行い、PCRストリップAから始めて、10 μLのサンプルと標準溶液を吸引して分注します。
    2. PCRストリップAを使用して、マスターミックスをプレートに入れたのと同様の方法(すなわち、偶数または奇数)でカラムを交互に使用して、各プレートの最初の3カラムを充填します。
    3. 次の 3 列を標準曲線 PCR ストリップで埋めます。このストリップでは、~90 μL に設定した 200 μL ピペットを使用して 7番目の 標準希釈チューブ (最後から 2 番目) を再懸濁し、マルチチャンネルピペットを使用してストリップ全体を再懸濁します。
      注:このチューブ内の容量が大きく、DNA濃度が小さいため、混合が不十分なため、PCRプレートウェル全体の測定値が頻繁に異なります。このチューブを混合するためにより大きな容量を使用すると、DNA溶液がより均一化されます。
    4. 次の3つのカラムにPCRストリップBを、最後の3カラムにPCRストリップCを充填し、各PCRストリップの間にピペットチップを交換し、 図3に示すように、両方のプレート上のすべての96ウェルに対応するサンプルとコントロール標準液を充填します。
  8. プレートが充填されたら、ベンチトップのプレートを軽くたたいて、ウェルの側面の液体が底に流れ込むことを確認してから、シーリングフィルムでプレートの上部を覆います。指先を使ってフィルムのすべての端を押し下げ、しっかりと密閉します。
    1. フードトップで30秒間渦巻いてプレートを混合し、次に密封されたプレートをウェル開口部を中央に向けてプレートスピナーに2分間置きます。
    2. プレートをサーモサイクラーに置き、プレートの列番号を読みやすい順序で並べます。サーモサイクラートップを閉じる前に、清潔なティッシュを使用して各プレートの上部を清掃します。

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図2:プレートを充填するプロセス。 (A) 奇数列を最初に埋めることを選択した場合、これがウェルが埋められる順序です。(B)最初に偶数列を埋めることを選択した場合、これがウェルが埋められる順序です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:プレートレイアウト。 PCR ストリップ A、ストリップ B、ストリップ C、および標準曲線(SC)ストリップをすべて使用して、各プレートの 3 つのカラムを充填し、各サンプルと標準希釈液の重複トリプリケートを生成する必要があります。この図は、各ストリップで埋める列を示しています。プレート2はロード前に180°反転します(列と行のヘッダーが逆さまになっていることに注意してください)が、プレートはプレート1と同じように充填されるため、プレート全体の位置効果を制御しながら、潜在的なピペッティングエラーを排除します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. MMqPCRサーモサイキング

  1. 手順4.8.1でプレートが回転している間に、コンピューターとサーモサイクラーの電源を入れます。サーモサイクラーソフトウェアを開きます。このプロトコルは、CFX Maestro ソフトウェアの使用を説明しています。
  2. MMqPCR サーモサイクリング プロトコル 19 に従って TL サーモサイクリング プロトコルを作成します19（図 4)。
    1. インキュベーションステップを追加して、DNAポリメラーゼを95°Cで15分間活性化します。
    2. プライマーとダイマーの結合を避けるため、94°Cで15秒間、49°Cで1分間、次いで94°Cで15秒間、59°Cで15秒間のサイクルを3サイクル実行します。
    3. テロメア増幅には、85 °C で 15 秒、74 °C で 30 秒の 27 サイクルを加えてから、シグナル取得を行います。
    4. アルブミン増幅の場合は、94°Cで15秒間、84°Cで30秒間の31サイクルを加えてから、シグナル取得を行います。
    5. 熱サイクルプロトコルの度数が増加するごとに、59°Cから95°Cまでの5秒間隔の溶融曲線を含めます。
  3. 両方のサーモサイクラーの [実行開始 ]をクリックします。プロンプトが表示されたら、分析ファイルのタイトルを入力します。

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図4:MMqPCRアッセイのサーモサイクリングプロファイル。 元の熱サイクリングプロトコル19に従ってソフトウェアで作成されたMMqPCRプロトコル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. MMqPCRデータ解析

  1. サーモサイクリングが完了したら、次の方法でデータを分析して、処理されたサンプルのTL値を生成します。
  2. ソフトウェアで、 プレートセットアップ 機能を選択します。ドロップダウンメニューで、[ View/Edit Plate] をクリックします。
    1. すべてのウェルをハイライト表示して [Select Fluorophores]をクリックし、[ SYBR ]というラベルの付いたボックスにチェックを入れ、他のすべてのボックスのチェックを外します。 [OK] をクリックします。
    2. すべてのウェルが強調表示されたままで、[ Load] という単語の横にある [SYBR] の横にあるチェックボックスをオンにします。これで、すべての井戸にSYBRが書かれているはずです。
    3. 次に、標準コントロール連続希釈の上部または下部にある3つのNTCウェルを強調表示し、右側のサンプルタイプメニューから NTC を選択します。これで、3つの井戸が黄色になり、NTCと呼ばれるようになります。 図 5A は P1 に選択すべきウェルを示し、 図 5B は P2 に選択すべきウェルを示しています。
      注: P2 は P1 から反転されるため、NTC は P1 の列 4 から 6 の下部に、P2 の列 7 から 9 の上部に表示されます。
    4. スタンダードコントロール連続希釈の21ウェルをハイライトし、サンプルタイプメニューから スタンダード を選択します。これらの井戸は緑色でなければなりません。これらのウェルがまだハイライト表示されている間に、[ Technical Replicate] をクリックします。「Replicate Size」メニューから「 3 」を選択し、「 Horizontal > Apply」を選択します。これらのウェルには、Std-1 から Std-7 までの 3 つのセットでラベルを付ける必要があります。
    5. 標準試料がハイライト表示されたまま、下にスクロールして [Dilution Series]を選択します。「Dilution Factor」フィールドに 2 を入力し、次の手順で説明するように、プレート番号に従って希釈開始濃度と方向性を入力します。
    6. P1プレートの場合、開始濃度フィールドに2.00E-03と入力し、 減少 のボックスにチェックを入れて、 適用を選択します。21 のウェルの値には、各ウェルに 2.00E-03 から 3.13E-05 までの濃度値が上から下に書かれている必要があります。
    7. P2プレートの場合、開始濃度フィールドに3.13E-5と入力し、 増加 のチェックボックスをオンにして、 適用を選択します。21 のウェルの値には、各ウェルに 3.13E-05 から 2.00E-03 までの濃度値が上から下に書かれている必要があります。
  3. サンプルについて、PCR ストリップ A の列 (P1 と P2 の 1-3) を強調表示し、サンプルタイプメニューから Unknown を選択し、Technical Replicate を選択します。「Replicate Size」メニューから「3」を選択し、「Horizontal > Apply」を選択します。これらの列のウェルは青色で、Unk-1 から Unk-8 までの 3 つのセットで行ごとにラベル付けする必要があります。
    1. PCR ストリップ B のカラム(P1 のカラム 7-9 と P2 のカラム 4-6)について、ステップ 6.3 を繰り返します。Unk-9 から Unk-16 のラベルを付ける必要があります。
    2. PCR ストリップ C のカラム(P1 と P2 のカラム 10 から 12)について、ステップ 6.3 を繰り返します。Unk-17 から Unk-24 のラベルを付ける必要があります。手順6.2〜6.3.2が完了すると、プレートセットアップウィンドウは 図5A、Bのようになります。
  4. プレート エディター ウィンドウの右下にある OK を選択します。「 はい 」をクリックして、プロンプトが表示されたら変更を適用します。
  5. アッセイレベルのQCでは、サーモサイクリングプロファイルのステップ9とステップ12の両方で、それぞれテロメアとアルブミンアンプリコンに対応する定量タブの曲線が適切であることを確認してください(例:逆増幅曲線がない)。カーブには、ソフトウェアウィンドウの右中央にあるドロップダウンメニューからアクセスします。 図6A、B は適切な曲線を示しています。
    1. ステップ9とステップ12の両方で報告されたPCR効率が90%から110%の間であり、これら2つの効率が互いに10%以上差がないことを確認してください(つまり、ステップ9の92.4%とステップ12の98%は適切ですが、ステップ9の92.4%とステップ12の108%は適切ではありません)。さらに、標準の R2 曲線が >0.995 であることを確認します。P1またはP2のいずれかがこれらの基準を満たさない場合は、プレートを再実行する必要があります。
  6. P1 では、 ステップ 9 を選択し、 図 6A、B に示すように、標準曲線に対応する 21 個のウェルを強調表示します。ソフトウェアウィンドウの右下隅にあるCq値をコピーします。 補足ファイル1として入手可能なテロメアデータシートテンプレートを開き、これらの値を標準の1シートの列Bに貼り付けます。 ステップ12 を選択してから、これらのCq値をコピーします。これらの値を標準の 1 シートの列 I に貼り付けます。
    1. ステップ 9 で勾配値を特定し、これを標準 1 シートのセル C4 に入力します。ステップ 12 で傾き値を特定し、これを標準 1 シートのセル J4 に入力します。
      注:システムは、ステップ6.6.1で特定した標準曲線の傾きを使用して、プライマーの効率パーセントを計算します。効率のパーセントは、次の式を使用して手動で計算できます。
      figure-protocol-15521
    2. 各標準希釈トリプリケートの変動係数(CV)が0.1未満であることを確認してください。0.1 以上の場合は、プレート上の 7 ポイント標準段階希釈曲線に含まれるすべての濃度のコントロールサンプルから、合計で最大 3 つの個々のウェルを除外します。1つのウェルのみをトリプリケートセットから除外する必要があります。
      注:ソフトウェア上の解析から標準点を除外すると、両方のプライマーで報告される傾き、R、y切片、および効率が変更されます。したがって、標準ウェルを分析から除外した後、ステップ 6.5.1 から 6.6.1 を繰り返す必要があります。
    3. P2解析ファイルと対応する標準2シートについて、手順6.6.1〜6.6.2を繰り返します。
    4. 標準1と標準2の両方のシートが許容可能なCVで完成した場合にのみ、分析ファイルから個々のサンプルデータを収集します。QC調整がP1 v P2シート列Lで報告されていることを確認します(P1分析ファイルで除外されたウェルの数など)。
  7. P1 解析ファイル内の 72 個のサンプルウェルのみが [Quantification] タブで青色で強調表示されていることを確認します。 図7A、B.選ぶ ステップ 9.ソフトウェアウィンドウの右下隅にあるCq値とSQ値をコピーします。これらの値をサンプル P1 シートのセル D3 から貼り付けます。選ぶ ステップ 12 次に、これらの Cq 値と SQ 値をコピーし、セル F3 から始まるサンプル P1 シートに貼り付けます。
    1. P2 解析ファイルおよび対応するサンプル P2 シート内のサンプルに対して、この手順を繰り返します。テロメアとシングルコピー(T/S)の比率(カラムH)は自動的に計算されますが、次の式を使用して手動で計算することもできます。
      figure-protocol-16524
      ここで、ET/S はテロメアまたはシングルコピー遺伝子をそれぞれ標的とする反応の指数増幅の効率であり、CqT/S は、テロメア含有量またはシングルコピー遺伝子を標的とする特定の複製が蛍光定量の臨界閾値に達するサイクルです。平均T/S比(列I)は、サンプルごとに6回の測定値にわたって計算されます。
      注:CFXのサンプルID番号は、2つのプレート間で同じ生物学的サンプルに対応していません。テロメアのデータシートテンプレートは、この違いを考慮し、適切な重複する三重を整列させます。
    2. CFX Maestro で、 図 7B に示すように、すべての分析サンプルの Cq 値が標準曲線の最低 Cq 値と最高 Cq 値の間にあることを確認します。 サンプルが図7Aに示すように範囲外にある場合は、濃度調整後に再分析する必要があります。最高濃度標準試料よりも低いCq値を持つサンプルは、範囲外にある増幅サイクル数に近似する係数で希釈する必要があり、最低濃度標準試料よりも高いCq値を持つ試料は、閾値を超える増幅サイクル数に近似する係数で濃縮する必要があります。
      注:分析サンプルの濃度に大きなばらつきがあると、潜在的なばらつきがさらに大きくなるため、注意して行う必要があります。
    3. NTC の開始濃度が、サンプルウェルに存在する DNA の平均量の 5% 未満であることを確認してください。これは、MMqPCRのサンプルP1およびサンプルP2シートの水質汚染率を表示することで確認できます。NTCが汚染を示している場合は、プレートを再実行してください。
      注:MMqPCRアッセイの感度により、制御不能な軽微な汚染により、NTCウェルが増幅することがあります。しかし、この増幅は軽微であり、サーモサイクリングプロトコルのステップ12で単一コピー遺伝子増幅の数サイクル後に発生するはずです。
    4. サンプルレベルのQCでは、サンプルP1およびサンプルP2シートの標準偏差(SD)(カラムJ)およびCV(カラムK)を確認します。サンプルのトリプリケートT/S比全体のプレート内CVが0.10(10%)未満であることを確認してください。0.1 を超えるプレート内 CV を補正するには、トリプリケートのセットから 1 つの T/S 比を除外できます。
      注:サンプルごとに6回の測定値で合計1回の複製のみを除外できます。つまり、同じサンプルの複製をP1とP2の両方で除外することはできません。
    5. P1 v P2 シートの列 G の個々のサンプルプレート間 CV が 0.05 (5%) 未満であることを確認します。0.05 を超える CV を補正するには、両方のプレートでサンプルごとに 6 つの測定値から 1 つの T/S 比を除外します。プレート内トリプリケートと必要に応じて6つの測定すべてにわたる目視検査後にサンプルを除外します。
      注:これらのQC基準、プレート内CV<10%およびプレート間CV5%<合格したサンプルのみが最終TL結果に含まれる場合があります。そうでない場合は、この分析でサンプルをP1 vs P2およびICCのデータシートから除外し、サンプルを2回目のMMqPCRアッセイで再評価する必要があります。
    6. プレートレベルのQCでは、サンプルP1およびサンプルP2シートの下部にある各プレート上のすべてのサンプルの平均プレート内変動が0.05(5%)未満であることを確認してください。追加のプレートレベルのQCについては、P1 v P2シート(セルG29)の全体的なプレート間変動が0.06(6%)未満であることを確認してください。QCに合格しなかったサンプルがセルG30のプレート間CV計算から削除されていることを確認します。
      注:関連するサンプルグループ(家族、異なるタイムポイントなど)で作業する場合、グループ内のすべてのサンプルを同じプレートで分析する必要があります。したがって、グループの1つのサンプルがQC基準に合格しなかった場合は、グループ内のすべてのサンプルを再実行する必要があります。
    7. QCに合格した各サンプルの最終TLデータ(P1 v P2シート、列I)、QCに合格した各サンプルのICC計算(ICCデータシート、列E-K)、およびP1 v P2シートの最終アッセイ実行QCデータ(列J-L)を別々の全体コホートまたは実験データファイルに記録します。
  8. テロメア研究ネットワーク(TRN)によって作成された 補足ファイル2 を使用して、プロジェクト20のICCを計算します。
  9. 最後に、TL研究間の比較可能性を向上させるために、コホート内のすべてのサンプルの平均T/S比を個々のサンプルのT/S比から差し引き、コホート内のすべてのサンプルのSDで除算する次の式を使用して、個別の全体コホートまたは実験データファイルの各サンプルの最終TLデータをZスコアに変換します。
    figure-protocol-18895

figure-protocol-19061
図5:ソフトウェアベースのプレートセットアップ。 (A)手順1-6.2を完了した後のP6.4プレートのソフトウェアベースのプレートセットアップ。(B)手順2-6.2を完了した後のP6.4プレートのソフトウェアベースのプレートセットアップ。サンプルIDと標準IDは、ソフトウェアがウェル位置に基づいてサンプルIDを割り当てる方法(P1のCFXサンプル1がP2のCFXサンプル24である)のため、2つのCFXプレート間で整列されません。補足ファイル1で提供されているExcelテンプレートは、これを考慮しており、同じ生物学的サンプルに対して行われたプレート間測定が互いに適切に位置合わせされていることを確認しています。

figure-protocol-19700
図6:tエロメアアンプリコンとアルブミンアンプリコンの標準曲線。(A)この標準曲線は、代表結果データセットのP1テロメアアンプリコンからのものです。1つの標準は、QC基準を満たさなかったため、削除されました。(B)この標準曲線は、代表結果データセットのP2アルブミンアンプリコンからのものです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-20225
図7:テロメアおよびシングルコピー遺伝子アンプリコン (A)テロメア増幅および(B)ソフトウェアに表示される代表的な結果で報告されたサンプルのアルブミン遺伝子増幅。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

7. MMqPCRデータレポーティング

  1. MMqPCRから作成したTLデータを用いて研究結果を報告する場合は、TRN Minimum Reporting Guidelinesに記載されている項目の報告を確実に行ってください。これらのガイドラインはTRNのウェブサイト(https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/)にあり、この情報を報告するためのテンプレートは補足ファイル3に記載されています。必要に応じて、このプロトコルとその他のTRNガイドラインとリソースを引用してください。

代表的な結果

表4および表5に示す結果は、プロトコルに従うことによって得られた再現性の高いTL測定の例を示しています。これらの結果を得るために、メーカーのガイドラインに従って、市販のキットを使用して24の末梢血単核細胞(PBMC)サンプルからDNAを抽出しました。これらの 24 個のサンプルを 2 つの 96 ウェルプレートで分析しました。すべてのDNAサンプルは、分光光度計と蛍光光度計を使用して、平均260/280比、平均260/230比、およびdsDNA濃度を使用して品質をチェックし、アッセイの適格性とサンプル希釈係数を決定しました(表6)。表6は、分光光度計を使用して測定されたDNA濃度とは異なる可能性のあるdsDNA濃度を定量化することの重要性も強調しています。このばらつきは、定量化に対するさまざまなアプローチの結果です。具体的には、分光光度計は280 nmでの吸収に基づいてDNA濃度を導き出し、吸光度の読み取りに影響を与える汚染物質(タンパク質、塩など)による変動の影響を受けやすいです。対照的に、蛍光光度計を使用して測定されたdsDNA濃度は、dsDNAに特異的に結合する色素の蛍光によって決定されるため、DNA含有量をより正確に反映していると推定されます。DNAサンプルは、MMqPCR TL分析の前に最大3回の凍結融解サイクルを経験しました。コントロールDNAは、1人の個人からのPBMCのプールDNA抽出から作成され、これを使用してDNAの2 ng/μLから0.0313 ng/μLまでの7点段階希釈を作成しました。PCR Step 9(テロメアアンプリコン)およびステップ 12(このプロトコルではシングルコピー遺伝子アンプリコン、アルブミン)用に作成された独立した標準曲線を図 6A、B に示します。アッセイは市販のリアルタイムPCR検出システムで実行され、図8に示すように、個々のアンプリコン製品が異なる温度で生成されることを示す融解曲線が生成されました。

表4:最適な代表的な結果を得るためのMMqPCR測定からの出力データ。 24 サンプルの平均 T/S 比、SD、CV、Z スコア TL。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表5:テロメア長データ出力。 MMqPCRアッセイの生データは、ソフトウェアで解析され、 その後、Supplementary File 1として添付されているスプレッドシートテンプレートに追加され、さらなる解析とQCが可能になります。このTLテンプレート出力シートは、データの概要を示し、両方のプレートにわたる各サンプルのサンプルID、平均TL、SD、およびCVを表示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表6:サンプル結果の分光光度計と蛍光光度計のDNA品質指標。 重複する分光光度計分析とdsDNAおよびサンプルごとの汚染物質の特異蛍光光度計測定からのQCデータ。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-2058
図8:メルトカーブの例。 ソフトウェアで生成されたサンプルデータのメルトカーブ。前のピーク ~80 °C はテロメアアンプリコンを表し、~89 °C のセカンダリピークはアルブミンアンプリコンを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このプロジェクトでは、すべての実行で平均テロメア効率は90.7〜102.1の範囲で98.6%、平均アルブミン効率は93.6〜108.2の範囲で102.3%でした。標準曲線から平均 0.97 回の繰り返しが除去されており、これはこのプロトコルの QC 基準を満たしています。平均プレート間CVは1.83%でSDは0.00616、平均プレート内CVは3.78%でSDは0.00658でした。これらの代表的なサンプルの平均TLを表4および表5に示します。 平均TLは1.37で、SDは0.24、範囲は0.84〜2.32でした。サンプルあたりのT/S比、SD、CV、およびZスコアTLを表4に示します。MMqPCR アッセイの T/S 比出力は TL の相対測定値であるため、研究間の比較を可能にするために、比率をこの Z スコアに変換しました。このプロジェクトのICCは、バッチ効果と実行効果20を考慮して、補足ファイル2にあるTRNガイドラインで説明されているように、Rスクリプトを使用して計算されました。プロジェクト内ICCを計算するために、通過したサンプルの10%を再実行し、コホートの各プレートから少なくとも1つのサンプルをICCプレートに確実に配置しました。プロジェクト全体のICCが0.801 [CI: 0.703, 0.86]であることは、TL結果の高い再現性を示しています。

すべての結果が最適になるわけではありません。 図9および 表 7の結果は、MMqPCRアッセイの結果が最適ではないことを示しています。 図9は、テロメア効率が90%未満で、QC基準を下回っている標準曲線を示しており、プレート全体を繰り返す必要があります。プライマー効率の問題は、通常、試薬の問題によるものであるため、試薬の有効期限と有効期限を追跡することは、どの試薬が低効率の原因であるかを判断するための最初のステップとして重要です。期限切れの試薬は、プレートを再度実行する前に交換する必要があります。 表 7は、初期のサンプルレベルのQC基準を満たしたプレートを示していますが、プレート間のばらつきが大きいため、プレートレベルのQC失敗につながっています。プレート間のばらつきは、通常、ピペッティングとプレート充填技術のエラーによるものです。この場合、技術者はプレートのセットアップ中に発生した問題を評価し、ピペットが校正されていることを確認する必要があります。

figure-representative results-3824
図 9: 最適でない結果。 ソフトウェアに表示されたこの標準曲線は、テロメアプライマーの増幅効率が90%未満であったため、QCに合格しませんでした。画像はP1のものですが、P2も同様に効率が低かったです。この分析のデータは使用できず、期限切れの原因試薬を交換した後、すべてのサンプルを再度実行する必要がありました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 7: 最適でない結果。 この表は、多くのサンプルが QC 基準を満たさなかった分析のテロメアデータテンプレートを示しています。再分析が必要なサンプルはCV値に基づいて決定され、サンプル名は識別しやすいように赤いフォントに変更されました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1: テロメアデータスプレッドシートテンプレート。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2: ICC計算。このプロトコルは、テロメア研究ネットワーク(TRN)によって作成されました。このファイルは20から変更されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3: TRN レポートのガイドライン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

2002年以前の大規模な集団ベースの研究で最も一般的に使用されたTL測定方法は、最終制限フラグメント長(TRF)のサザンブロット分析であった24,25。TRFは、専門のラボで優れた精度と再現性を提供するにもかかわらず、必要なDNAの量と質、および限られたスループットのために適用性が限られているため、qPCRベースのTLアッセイ、ひいてはMMqPCRアッセイの利用が増加する背景となっています。MMqPCR TL法は、各QC基準に細心の注意を払ってセットアップ、最適化、および保守することで、再現性のあるTL測定を提供します。アッセイの信頼性を確保するためには、分析した各コホートの特定のICCの計算と報告が必要です。DNAの品質と技術的な専門知識にもよりますが、MMqPCR法は、少量のDNAを必要とし、シングルプレックスPCRよりも信頼性が高く、他の方法よりも試薬コストと技術者の時間効率が高いため、TLを調査する大規模な集団ベースの研究に適しています。高ICCを生成する能力は、TLの大規模な集団ベースの研究のためのMMqPCRの使用をサポートする追加データを提供します。MMqPCR TL測定は、全死因死亡率、老化、生涯ストレス、環境曝露、および心血管疾患やがんなどの身体的健康転帰のバイオマーカーとしてのTLの役割を定義しようとする幅広い研究に適用することができます4,7,8,10,11,12,13,26,27,28、29、30、31。

MMqPCR法の1つの制限は、TLをT/S比、つまりシングルコピー遺伝子の選択、マスターミックス組成、およびPCRサイクリングパラメータ32の選択によって異なる長さの相対的な推定値として報告することである。T/S比はユニットレスです。したがって、他のTL測定方法と組み合わせることなく、この方法は塩基対値18,33,34で推定を報告することはできません。その結果、T/S比は、研究間で関連性を持つためにZスコアに変換する必要があります35。これをラボ、メソッド、アッセイ全体で行う際には、十分な注意を払う必要があります。さらに、この方法は、ゲルベースのハイブリダイゼーションアッセイと同様に、間質性テロメアの定量を含むことができる。しかし、これらの配列は、ゲノム当たりの総テロメアDNA含有量のごくわずかな割合を占めている。さらに、間質テロメア配列は、標準的なテロメアリピートから逸脱する不整合な塩基対配列を含む可能性が高く、プライマーの結合と増幅の可能性が低下します。さらに、MMqPCRアッセイに必要なDNAの量が最小限であることは有利ですが、qPCRベースのTLの測定は、サンプルの保存条件、DNA抽出方法、生体組織36,37など、DNAの品質と完全性に影響を与える分析前の要因によって影響を受けることに注意することが重要です。これらの因子の分析制御により、qPCR38を使用して生成されたTL測定の外部妥当性を強化できることが示されています。それでも、DNA品質の違いがMMqPCRアッセイによって生成されるTLに与える影響は、特に体系的に評価する必要があります。これは、サンプルがこのアプローチを使用してTLの正確な推定値を生成するのに十分な品質であるかどうかを判断するための現在のデータに基づいたガイダンスが存在しないためです。これらの制限にもかかわらず、集団レベルの健康転帰に関する研究に対するこのアッセイの応用はかなりのものです。

MMqPCRアッセイを利用する際には、精度とスループットの継続的な評価が必要です。現在の設計では、技術者は2台のサーモサイクラーを使用して、重複したプレート上でサンプルのトリプリケートを同時に実行します。複数のサーモサイクラーがいない場合は、重複-三重測定を保持し、プレートを順番に実行して、スループットが低下しても精度を向上させることをお勧めします。例えば、シングルトリプリケート測定を採用するなど、精度よりもスループットを優先する決定は、分析サンプルの分析を進める前に、結果として得られるICCの徹底的なテストと評価を伴う必要があります。スループットと精度に関する決定を下す際には、サンプルサイズとサンプルDNAの品質を考慮する必要があります。サンプルサイズが小さい場合やDNAサンプルの品質が悪い場合は、より高い精度を優先する必要があります23。これは、関連するグループ(家族、複数の時点を持つ被験者など)のサンプルを扱う場合にさらに重要になります。このような場合、実験を開始する前に関連するサンプルを同じプレートに割り当てるなど、慎重な計画が、不注意によるグループごとの交絡による統計的検出力の損失を防ぐ1つの方法です。

このアッセイでは、分光光度計を使用してDNAサンプルの品質を評価しました:260/280比で1.6〜2.0、260/230比で2.0〜2.2の範囲のサンプルが許容できると考えられました。この品質評価と蛍光光度計による二本鎖DNAの正確な評価は、再現性のあるTLデータを取得するためのこのプロトコルの重要なステップです。DNAインテグリティの他の、より記述的な測定、例えば、フラグメントサイズおよび/またはアガロースゲルを介して決定されるDNA品質の要約測定(例えば、DNAインテグリティ数)も、サンプル品質を決定する際に利用され得る38。また、サンプルの希釈は、MMqPCRアッセイを実行するためのサンプル調製時にのみ行うことをお勧めします。これにより、DNAアリコートが抽出後に受ける操作が可能な限り最小限に抑えられ、アッセイ前の取り扱いのばらつきが減少します。DNAサンプルを輸送する必要がある場合は、低濃度のDNAサンプルで発生する分解を軽減するために、可能な限り高い濃度のドライアイスで輸送する必要があります39,40。凍結融解サイクルで起こるDNAの分解のため、DNAをストックするための凍結融解の数は最小限に抑えるべきである41。プールされたコントロールDNAのアリコートは、アッセイを実行する前にコホートを作成し、個々の分析DNAサンプルのアリコートを作成する必要があります。

アッセイ性能とQCの主要な指標には、NTCシグナル、プレート間およびプレート内CV、標準曲線R2が含まれます。QC基準を満たさないことは、いくつかの方法で軽減できます。PCRグレードH2Oストックを定期的に交換し、各プレートのペアにPCRグレードH2Oサブストックを分注することで、汚染源とNTC増幅を最小限に抑えることができます。コンタミネーションを軽減するための追加のステップには、次のものが含まれます:MMqPCRアッセイ専用の特定のPCRフードを指定します。PCRフードと機器をDNA除染液で拭く。部屋に紫外線を照射する。PCRフード内で無菌技術を練習します。アッセイの再現性を高め、CVを減少させるために、サンプル、希釈液、およびPCRストリップをそれぞれのボルテックスステップで激しくボルテックスし、DNAサンプルをピペッティングする際には十分に再懸濁することをお勧めします。閾値標準R2 曲線(<0.995)を下回る場合は、プレートローディング中のピペッティングエラーに起因する可能性が最も高いです。これを回避するには、正確なピペッティングに細心の注意を払い、ピペットを毎年校正し、ロード前に標準PCRストリップを精力的に混合し、効率的なワークフローを促進するために消耗品を慎重に整理します。2台のマシンと1つのプレートを使用して、一貫して高いCVを出力することが観察された場合は、問題を改善するための潜在的な方法としてマシンを整備する必要があります。メーカーのQCプレートは、サーモサイクラーの性能を評価するために、プレート上で定期的に実行する必要があります。

上記の推奨手順を適用しても問題が解決しない場合は、次の手順を使用してプロトコルのトラブルシューティングを行うことができます。すべての試薬が分注された時期と関連する有効期限を記録しておくと、必然的に問題が発生した場合のトラブルシューティングプロセスを効率化するのに役立ちます。トラブルシューティングプロセスの重要な部分は、一度に1つの試薬のみを調整して、プレートがQC基準に合格しない特定の原因を特定することです。例えば、テロメア遺伝子とシングルコピー遺伝子の両方の効率が低い場合、アンプリコン特異的プライマーよりもDTT、dNTP、SYBRアリコートなどの共有試薬が原因である可能性が高くなります。記載されている価格では、新しいアリコートをDTT、dNTPの順にテストし、最後に問題がまだ続く場合は新しいSYBRアリコートをテストする必要があります。逆に、アンプリコン(テロメアまたはシングルコピー遺伝子)の1つだけが効率が低い場合、困難の原因はプライマーの1つである可能性が高くなります。 図 8 に示されている融解曲線のピークの解釈は、トラブルシューティングのための重要な情報のソースとして役立ちます。2つの溶融曲線ピークの可視化は、個々の問題サンプルが標準試料や残りの分析サンプルによって示されるピークの一般的な傾向から際立つため、特定の試料の潜在的な問題を特定するために使用できます。メルトカーブは、特定のアンプリコンのピークが他のアンプリコンよりも系統的に鋭くない場合に、特定のプライマーの問題を診断するためにも使用できます。

この原稿では、公衆衛生研究に幅広く適用可能なTL測定のためのMMqPCRアッセイを成功裏にセットアップする方法を詳しく説明し、この効率的で費用対効果の高い方法のアクセシビリティと信頼性を向上させることを目的としたQCとトラブルシューティングに関する主要な推奨事項を紹介します。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、この作業を可能にしたテロメア研究ネットワーク諮問委員会と国立老化研究所/国立環境健康科学研究所の資金提供(U24 AG066528およびU24 AG066528-S1)に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5mL TubesUSA Scientific1605-0099Seal-Rite 0.5mL Microcentrifuge Tubes, Sterile
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
1.5mL TubesUSA Scientific1615-5599Seal-Rite 1.5mL Microcentrifuge Tubes, Sterile
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
100mM DTTIn HouseNot ApplicableMade with stock DTT, diluted sodium acetate, and PCR Grade H2O
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
15mL TubesThermo Fisher14-959-53ACorning 352196 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
1M MgCl2Thermo Fisher50152107Biotang Inc 1M MgCl2 1M Magnesium Chloride Solution, Prepared in 18.2 Megohms Water and Filtered through 0.22 Micron Filter
Storage Temperature and Conditions: 4 °C 
1x Gold BufferIn HouseNot Applicable10X Gold Buffer diluted with PCR Grade H2O
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
25mM dNTPsNew England BioLabsN0446SDeoxynucleotide Solution Set
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
5mL TubesThermo Fisher3391276Argos Technologies Microcentrifuge Tubes – 5mL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
96 Well PlateBio-RadHSP9601Hard-Shell 96-Well PCR Plates, Low Profile, Thin Wall, Skirted, White / Clear
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Aluminum FoilOffice Depot3489072Reynolds Wrap Stanard Aluminum Foil Roll, 12" x 75', Silver
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
AmpliTaq Gold Kit – Polymerase and BufferThermo Fisher4311806AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 (MgCl2 in this kit is not used), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
BetaineThermo FisherAAJ77507ABBetaine, 5M Solution, Molecular Biology Grade, Ultrapure, 10mL
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
Big Tube RackThermo Fisher344817Fisherbrand 4-Way Tube Rack
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
CFX Maestro SoftwareBio-Rad12004110Software for real-time PCR plate setup, data collection, statistics, and graphiing of results
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems with Starter PackageBio-Rad184509696-well optical module for real-time PCR
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
DTTFisher ScientificAAJ1539706Dithiothreitol, >99.5+ Molecular Biology Grade, 5 g
Storage Temperature and Conditions: minus 20 °C 
ELIMINaseFisher Scientific04-355-32ELIMINase Laboratory Decontaminant
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
HEPA FilterUSA ScientificReplacement FiltersHigh-Efficiency Particulate Air Filter for AirClean Workstations
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
KimwipesThermo Fisher06666AKimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Loading TroughThermo Fisher14387069Thermo Scientific Matrix Reagent Reservoirs
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Microsoft ExcelMicrosoftNot ApplicableMicrosoft 365 package, Excel software application
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Mini CentrifugeGenesee Scientific31-500BPoseidon 31-500B Mini Centrifuge, Blue Lid
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
PCR Grade H2OThermo FisherAM9937Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
PCR HoodUSA Scientific4263-2588Nucleic Acid Workstation with HEPA Filtration, AirClean Systems Combination PCR Workstation
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
PCR StripsThermo FisherAB0776Low Profile Tubes and Flat Caps, Strips of 8
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
PCR Tube RackThermo Fisher344820Fisherbrand 96-Well PCR Tube Rack
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Multichannel)Ranin17005860Pipette Tips SR LTS 20µL F 960A/5, 20µL Maximum
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Single Channel)USA Scientific1181-385010µL Graduated TipOne RPT Filter Tips
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Single Channel)USA Scientific1180-185020µL Beveled TipOne RPT Filter Tips
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Single Channel)USA Scientific1111-0880200µL Natural TipOne Pipette Tips in Racks
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipette Tips (Single Channel)USA Scientific1111-28901000µL Natural Graduated TipOne Pipette Tips in Racks
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Multichannel)Ranin17013802Pipet-Lite Multi Pipette L8-10XLS, 0.5 to 10µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Multichannel)Ranin17013803Pipet-Lite Multi Pipette L8-20LS+, 2 to 20µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Single Channel)Thermo FisherF144802GGilson Pipetman Classic Pipets, 1 to 10µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Single Channel)Thermo FisherF123600Gilson Pipetman Classic Pipets, 2 to 20µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Single Channel)Thermo FisherF123601Gilson Pipetman Classic Pipets, 20 to 200µL
Storage Temperature and Conditions: Room temperature
Pipettors (Single Channel)Thermo FisherF123602Gilson Pipetman Classic Pipets, 200 to 1000µL
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Sodium AcetateThermo FisherJ63560.EQE3M NaOAc pH 5.2
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SYBR GreenThermo FisherS7563SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain – 10,000X Concentrate in DMSO
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Syringe FiltersFisher Scientific09-927-55AGD/X 25 mm Sterile Syringe Filter, cellulose acetate filtration medium, 0.2 μm
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SyringesThermo Fisher148232ABD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles, 10mL
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TE BufferFisher ScientificBP2474100TE Buffer, Tris-EDTA, 1X Solution, pH 7.6, Molecular Biology, Fisher BioReagents
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Weigh BoatThermo Fisher01-549-752Fisherbrand Sterile Hexagonal Weighing Boat, 10mL
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