JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בשיטת מיצוי מבוססת פוליאול בסיוע מיקרוגל למיצוי תרכובות פנוליות ונוגדי חמצון טבעיים, המייצגת גישה מעשית ובת קיימא מבחינה סביבתית לפיתוח תמציות מוכנות לשימוש.

Abstract

השימוש בפוליאולים כממסים ירוקים להפקת תרכובות ביו-אקטיביות מחומרים צמחיים זכה לתשומת לב בשל בטיחותם והתנהגותם האינרטית עם כימיקלים ביו-אקטיביים צמחיים. מחקר זה בוחן מיצוי בר-קיימא של תרכובות פנוליות ונוגדי חמצון טבעיים מעור כסוף קפה באמצעות שיטת מיצוי בסיוע מיקרוגל (MAE) עם ממיסים מבוססי פוליאול: גליצרין, פרופילן גליקול (PG), בוטילן גליקול (BG), מתילפרופנדיול (MPD), איזופנתילדיול (IPD), פנטילן גליקול, 1,2-הקסנדיול והקסילן גליקול (HG). ניתוח השוואתי נערך על מיצויי ממסים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים, תוך התמקדות בהשפעתם על התרכובות הביו-אקטיביות של MAE, המקיף פרמטרים כגון תוכן פנולי כולל (TPC), תכולת פלבנואידים כוללת (TFC), ופעילויות נוגדות חמצון כמו 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging assay (DPPH), 2,2′-azino-bis(-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) רדיקלים scavenging assay (ABTS), ואת ferric reduction antioxidant power assay (FRAP). הערכים הגבוהים ביותר נצפו עבור TPC עם מיצוי מימי-1,2-הקסנדיול (52.0 ± 3.0 מ"ג GAE/g דגימה), TFC עם מיצוי מימי-1,2-הקסנדיול (20.0 ± 1.7 מ"ג QE/g דגימה), DPPH עם מיצוי מימי-HG (13.6 ± 0.3 מ"ג TE/g דגימה), ABTS עם מיצוי מימי-פנטילן גליקול (8.2 ± 0.1 מ"ג TE/g דגימה), ו-FRAP עם מיצוי מימי-HG (21.1 ± 1.3 מ"ג Fe (II) E/g דגימה). מחקר זה נועד לקדם טכנולוגיית מיצוי ידידותית לסביבה באמצעות רכיבים צמחיים טבעיים, קידום קיימות על ידי מזעור השימוש בכימיקלים מסוכנים תוך הפחתת זמן וצריכת אנרגיה, עם יישומים פוטנציאליים בקוסמטיקה.

Introduction

כיום, קיימת מגמה עולמית של מודעות סביבתית בתעשיית היופי, המובילה יצרנים להתמקד בטכנולוגיה ירוקה למיצוי רכיבי צמחים באמצעות חלופות בנות קיימא1. בדרך כלל, ממסים מסורתיים כגון אתנול, מתנול והקסאן משמשים למיצוי רכיבים פנוליים צמחיים ונוגדי חמצון טבעיים2. עם זאת, נוכחותם של שאריות ממס בתמציות צמחים מהווה סיכון פוטנציאלי לבריאות האדם, וגורמת לגירוי בעור ובעיניים3, במיוחד בנוגע ליישומן המיועד בקוסמטיקה. כתוצאה מכך, קשה לסלק שאריות ממס כאלה מהתמציות, תהליך הדורש השקעה ניכרת בזמן, אנרגיה ומשאבי אנוש4. לאחרונה, מים מחוממים במיוחד, נוזלים יוניים, ממיסים אאוטקטיים עמוקים וממיסים שמקורם ביולוגי התגלו כגישות מבטיחות למיצוי ממס ירוק5. עם זאת, השימוש בהם עדיין מוגבל על ידי הפרדת מוצרים בתהליכים מבוססי מים. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, הפיתוח של תמציות מוכנות לשימוש מתגלה כפתרון בר קיימא6.

פוליאולים משמשים לעתים קרובות בפורמולציות קוסמטיות כחומרי לחות בגלל הקוטביות הטובה שלהם ויכולתם לשמור על לחות מהסביבה7. נוסף על כך, ניתן להשתמש בפוליאולים כגון גליצרין, פרופילן גליקול, בוטילן גליקול, מתילפרופנדיול, איזופנתילדיול, פנטילן גליקול, 1,2-הקסנדיול והקסילן גליקול למיצוי צמחים. הם נחשבים לממסים לא רעילים, מתכלים, ידידותיים לסביבה, לא תגובתיים ובטוחים לשימוש במיצוי צמחים8. בנוסף, פוליאולים יכולים לעמוד בחום שנוצר במהלך מיצוי בעזרת מיקרוגל (MAE) בשל נקודות הרתיחה הגבוהות והקוטביותשלהם 9. פוליאולים אלה מוכרים בדרך כלל ככימיקלים בטוחים (GRAS) על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA). שלא כמו ממסים קונבנציונליים כגון אתנול או מתנול, אשר עשויים לדרוש הסרה קפדנית מן התמצית בשל ההשפעות המזיקות האפשריות שלהם, פוליאולים מציעים את היתרון של מזעור האנרגיה, הזמן, ואת העלויות הכרוכות בתהליכי הסרת ממס10. זה לא רק מייעל את תהליך החילוץ אלא גם משפר את היעילות הכוללת והקיימות של שיטת החילוץ. מחקרים קודמים השתמשו בפוליאולים כגון פרופילן גליקול ובוטילן גליקול כממסים במיצוי תרכובות ביו-אקטיביות מפרחי Camellia sinensis 10 ועיסת קפה11, וחשפו פוטנציאל משמעותי לתפקידם כממיסים חלופיים בני קיימא בתהליך מיצוי הצמח. לפיכך, המשך הפיתוח והאופטימיזציה של מערכת ממס מים פוליאולים טומן בחובו פוטנציאל להתקדמות משמעותית בכימיה ירוקה ובשיטות תעשייתיות בנות קיימא.

באופן כללי, תרכובות ביו-אקטיביות הנמצאות בצמחים מסונתזות כמטבוליטים משניים. ניתן לסווג תרכובות אלה לשלוש קבוצות עיקריות: טרפנים וטרפנואידים, אלקלואידים ותרכובות פנוליות12. שיטות מיצוי שונות משמשות בתנאים שונים כדי לבודד תרכובות ביו-אקטיביות ספציפיות מצמחים. ניתן להפיק תרכובות ביו-אקטיביות מחומרים צמחיים בטכניקות קונבנציונליות או לא קונבנציונליות. השיטות המסורתיות כוללות מיצוי רפלוקס וזיקוק הידרו, בעוד שהשיטות הלא קונבנציונליות כוללות מיצוי בעזרת אולטרסאונד, מיצוי בעזרת אנזימים, מיצוי בסיוע מיקרוגל (MAE), מיצוי בסיוע שדה חשמלי פועם, מיצוי נוזלים סופר-קריטי ומיצוי נוזלים בלחץ13. שיטות לא קונבנציונליות אלה נועדו לשפר את הבטיחות על ידי שימוש בממסים וחומרי עזר בטוחים יותר, שיפור היעילות האנרגטית, מניעת התפרקות של רכיבים ביו-אקטיביים והפחתת זיהום סביבתי14.

יתר על כן, MAE היא בין הטכנולוגיות הירוקות המתוחכמות למיצוי תרכובות ביו-אקטיביות מצמחים. הליכי מיצוי קונבנציונליים דורשים כמויות משמעותיות של זמן, אנרגיה וטמפרטורות גבוהות, אשר לאורך זמן עלולות לפגוע בתרכובות ביו-אקטיביות רגישות לחום13. בניגוד למיצוי תרמי קונבנציונלי, MAE מאפשר מיצוי של תרכובות ביו-אקטיביות על ידי יצירת חימום מקומי בתוך הדגימה, שיבוש מבני התא ושיפור העברת המסה, ובכך מגביר את יעילות מיצוי התרכובות. חום מועבר מתוך תאי הצמח באמצעות גלי מיקרו, הפועלים על מולקולות המים שבתוך רכיבי הצמח13. יתר על כן, MAE התקדמה לשיפור המיצוי וההפרדה של חומרים פעילים, הגדלת תפוקת המוצר, שיפור יעילות המיצוי, הדורשת פחות כימיקלים, וחיסכון בזמן ובאנרגיה תוך מניעת הרס של תרכובות ביו-אקטיביות15.

מחקר זה מתמקד במיצוי של תרכובות פנוליות צמחיות ונוגדי חמצון טבעיים באמצעות מיצוי בסיוע מיקרוגל (MAE) תוך שימוש בסוגים שונים של פוליאולים כממסים. התוכן הפנולי הכולל (TPC), תכולת הפלבנואידים הכוללת (TFC) והפעילות נוגדת החמצון (DPPH, ABTS ו-FRAP) של תמציות MAE מבוססות פוליאול נקבעות. בנוסף, MAE מבוסס פוליאול מושווה עם MAE באמצעות ממסים קונבנציונליים כגון מים ואתנול. מחקר זה צפוי לתרום לפיתוח טכנולוגיית מיצוי בת קיימא מבחינה סביבתית עבור רכיבים טבעיים, קידום קיימות על ידי הפחתת ההסתמכות על כימיקלים מסוכנים, קיצור זמני עיבוד ומזעור צריכת האנרגיה בייצור חומרי גלם ליישומים פוטנציאליים בתעשיית הקוסמטיקה.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה ניסיונית

  1. הכנת דוגמת צמח
    1. אספו קפה טרי כסוף עור (Coffea arabica) וייבשו אותו בטמפרטורה של 60°C במגש מייבש למשך 72 שעותו-11.
    2. טחנו את הקפה המיובש (CS) לאבקה דקה באמצעות מטחנה ואחסנו אותו בטמפרטורת החדר לניתוח נוסף11.
      הערה: במחקר זה, CS טרי (C. arabica) נאסף מבאן דוי צ'אנג, מחוז מה סואי, צ'יאנג ראי, תאילנד. CS הוא תוצר לוואי המתקבל בתהליך הקליפה המסיר את שכבת הקלף מפולי הקפה המיובשים לאחר עיבוד הדובדבנים להסרת שכבות הפרי החיצוניות16.
  2. כימיקלים
    1. השתמש בריאגנטים כימיים באיכות כיתה אנליטית, למעט הממסים בניסוי.
      הערה: בניסוי נעשה שימוש בממיסים קוסמטיים.
    2. השתמש בממסים (מים, אתנול, גליצרין, פרופילן גליקול, בוטילן גליקול, הקסילן גליקול, איזופנתילדיול, 1-2 הקסנדיול, פנטילן גליקול ומתילפרופנדיול) למיצוי CS עם MAE.

2. תהליך החילוץ

  1. הכנת דגימה וממס
    1. הכן את הדגימה ואת הממסים עבור הליך MAE על פי פרוטוקול9 שדווח בעבר עם כמה שינויים.
    2. הכינו כל ממס בריכוז של 60% על ידי דילול 60 מ"ל מכל ממס במים מזוקקים והתאמת הנפח ל-100 מ"ל למיצוי משולש.
      הערה: יש להשתמש ב-100% מים מזוקקים להפקת מים.
    3. שקלו 0.67 גרם CS וערבבו עם 20 מ"ל מכל ממס מיצוי ביחס של 1:30 במיכל תגובה (איור 1A) עבור MAE.
      הערה: הכמות המוצקה-נוזלית המקסימלית עבור כל כלי היא 2 גרם מדגם ו -20 מ"ל של ממס.
    4. הוסף מוט מערבל מגנטי לכל כלי כדי להבטיח פיזור אחיד של החום והממס בתוך הדגימה, לשפר את יעילות תהליך המיצוי ולקדם תפוקת מיצוי טובה יותר.
      הערה: אם משתמשים בממיסים לא קוטביים בתהליך המיצוי, ניתן להשתמש בחטיפי בוחש טפלון במקום בחישושים מגנטיים כדי לספק חימום יעיל באמצעות מערכת המיקרוגל.
    5. סגרו כל כלי בחוזקה בעזרת כלי מיוחד (איור 2) והכניסו את כל הכלים לתא MAE (איור 1B).
  2. הגדרת מכשיר ונוהל חילוץ בסיוע מיקרוגל
    1. בצע את הליך החילוץ על פי פרוטוקול הייחוס עם כמה שינויים9.
    2. פתח את מסך הצג כדי להגדיר את השיטה על-ידי לחיצה על סמל ארגז הכלים בסרגל העליון ובחירת רוטור SK eT באזור האביזרים (איור 3A,B).
    3. בחר את קצב הערבוב של מוטות הבוחש על-ידי לחיצה על אזור הבוחש והקלדת 20% (איור 4A).
      הערה: ניתן לבחור את קצב הערבוב בין 0% ל-100%.
    4. לחצו על סקטור מנעולי הדלת והגדירו אותו להפעלה בטמפרטורות העולות על 80 מעלות צלזיוס (איור 4B).
      הערה: הגדרה זו מבטיחה סגירה אוטומטית של דלת התא כאשר הטמפרטורה הפנימית עולה על 80°C.
    5. לחץ על סמל הטבלה בסרגל העליון (איור 5A) והגדר את שיפוע הטמפרטורה (T1) למשך מיצוי של 10 דקות, עוצמת מיקרוגל ל- 1800 W וטמפרטורה ל- 120 ° C.
    6. הפעל את הבוחש על ידי לחיצה על כפתור הבוחש עד להופעת האור הירוק.
    7. הגדר את מהירות מאוורר המפוח לרמה 3 (מרבית) (איור 5B).
    8. כדי להחזיק את זמן החילוץ, בחר את טמפרטורת החילוץ הרצויה (T2) על ידי הגדרת משך החילוץ ל - 15 דקות, עוצמת המיקרוגל ל -1800 W והטמפרטורה ל -120 ° C.
    9. הגדר את מהירות הבוחש והמאוורר כאמור בסעיפים 2.2.6 ו- 2.2.7 (איור 5A,B).
      הערה: הטמפרטורה המרבית והספק המיקרוגל הם 260°C ו-1800 W.
    10. הגדר את זמן הקירור על-ידי לחיצה על לחצן הקירור בפינה השמאלית התחתונה של המסך ובחירת משך הזמן של 10 דקות (איור 6).
    11. שמור את השיטה על-ידי לחיצה על סמל השמירה בפינה השמאלית העליונה של המסך (איור 7A).
    12. ודא שלאחר שמירת תנאי השיטה, גרף תנאי החילוץ יוצג על המסך עם לחצן ההפעלה בפינה הימנית התחתונה (איור 7B).
    13. התחילו את תהליך החילוץ על-ידי בחירת מספר כלי הדם שבהם נעשה שימוש (איור 7C).
      הערה: ניתן להשתמש בעד 15 כלי שיט בחילוץ אחד, ואם משתמשים במספר הרצוי של כלי שיט, יש לוודא את המיקום המאוזן של כלי הדם בתא.
    14. לאחר המיצוי, צנטריפוגה את התמציות ב 4 ° C, 9072 x גרם, במשך 15 דקות, באמצעות מכונת צנטריפוגות קירור.
    15. אספו את הסופרנטנט עם פיפטת זכוכית בנפח 10 מ"ל (איור 8) ואחסנו אותה בטמפרטורה של -20°C במקפיא למחקר נוסף.
      הערה: בהתאם לגודל החלקיקים ולצפיפות שאריות הצמח, התמציות ידרשו זמני צנטריפוגה ארוכים יותר (20-30 דקות).

3. קביעת תרכובות פנוליות

  1. קביעת התוכן הפנולי הכולל
    1. קבע את התוכן הפנולי הכולל של תמציות CS על-ידי הפניה לפרוטוקול עם כמה שינויים17.
    2. הכינו דילול פי 10 של דגימות על ידי דילול במים מזוקקים.
    3. ערבבו 10 μL של הדגימה המדוללת עם 20 μL של מגיב Folin-Ciocalteu לא מדולל ואפשרו להם להגיב במשך 3 דקות.
    4. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של 7.5% Na2CO3 פתרון לתערובת בכל באר של צלחת 96 באר.
    5. הכינו ריכוזים שונים לטווח הריכוזים הסטנדרטי של חומצה גאלית (ראו טבלה 1 וטבלה 2) על ידי דילול במים מזוקקים.
    6. מערבבים אותם עם 20 μL של מגיב Folin-Ciocalteu ולאפשר להם להגיב במשך 3 דקות.
    7. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של 7.5% Na2CO3 פתרון לתערובת בכל באר של צלחת 96 באר.
    8. לדגור על התגובה במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    9. מדדו את ספיגת תמיסת התגובה ב-765 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות (איור 9A).
    10. שרטט את עקומת הכיול הסטנדרטית באמצעות ריכוזי התקן והספיגה ב-765 ננומטר (איור 10A).
    11. בטא את התוצאות כמ"ג שווה ערך לחומצה גאלית (GAE) לכל גרם של הדגימה, וחשב באמצעות המשוואה הבאה18:
      הערה: מ"ג שווה ערך לחומצה גאלית (GAE) לגרם מדגם = [(A765 - c) / m)) במיקרוגרם שווה ערך לחומצה גאלית × נפח כולל בבאר תגובה (מ"ל) x דילול × משקל הדגימה היבשה (1 גרם) x נפח התוצאה של תמצית (מ"ל)] / [(נפח הדגימה שנוסף לכל באר (מ"ל) x משקל בפועל של דגימה יבשה (g) גורם המרה × ממק"ג למ"ג (1000)]
      כאשר, c = y-intercept, m = שיפוע
  2. קביעת תכולת הפלבנואידים הכוללת
    1. קבע את תכולת הפלבנואידים הכוללת של תמצית CS בהתאם לפרוטוקול עם כמה שינויים17.
    2. מכינים דילול פי 5 של דגימות על ידי דילול במים מזוקקים.
    3. הוסיפו 50 μL של הדגימה המדוללת ל-15 μL של 5% NaNO2 ודגרו בחושך במשך 5 דקות.
    4. יש לערבב 15 μL של תמיסת 10% AlCl3 עם התגובה ולשמור אותה בטמפרטורת החדר למשך 6 דקות.
    5. לאחר מכן, הוסף 100 μL של תמיסת 1 M NaOH לתגובה ודגר במשך 10 דקות נוספות.
    6. מדדו את ספיגת התערובת ב-510 ננומטר (איור 9B).
    7. הכינו ריכוזים שונים של קוורצטין בטווח הסטנדרטי (ראו טבלה 3 ו-4) על-ידי הוספתם ל-15 מיקרוליטר של 5% NaNO2 ודגירתם בחושך למשך 5 דקות.
    8. יש לערבב 15 μL של תמיסת 10% AlCl3 עם התגובה ולשמור בטמפרטורת החדר למשך 6 דקות.
    9. הוסף 100 μL של תמיסת 1M NaOH לתגובה ודגר עוד במשך 10 דקות.
    10. קבעו את ספיגת התקן ב-510 ננומטר (איור 9B).
    11. שרטט את עקומת הכיול הסטנדרטית באמצעות ריכוזי התקן והספיגה ב-510 ננומטר (איור 10B).
    12. בטאו את התוצאות כ-mg של קוורצטין שווה ערך (QE) לגרם של הדגימה, המחושב על ידי משוואה19 באופן הבא:
      הערה: מ"ג קוורצטין שווה ערך (QE) לגרם מדגם = [(A510 - c) / m)) במיקרוגרם קוורצטין שווה ערך × נפח כולל בבאר תגובה (מ"ל) x דילול × משקל הדגימה היבשה (1 גרם) x נפח התוצאה של תמצית (מ"ל)] / [(נפח הדגימה שנוסף לכל באר (מ"ל) x משקל בפועל של דגימה יבשה (גרם) גורם המרה × ממק"ג למ"ג (1000)]
      כאשר, c = y-intercept, m = שיפוע

4. קביעת הפעילות נוגדת החמצון

  1. 1,1-Diphenyl-2-Picryl-Hydrazil (DPPH) בדיקת ניקוי רדיקלים
    1. קבע את פעילות ניקוי רדיקלי DPPH של תמצית CS בהתאם לפרוטוקול עם כמה שינויים17.
    2. הכינו דילול פי 10 של הדגימות על ידי דילול שלהן במים מזוקקים.
    3. מערבבים 20 μL של הדגימות המדוללות עם 135 μL של תמיסת DPPH 0.1 mM.
    4. הכינו ריכוזים שונים של טווח הריכוזים הסטנדרטי של טרולוקס (ראו טבלה 5 ו-6) על ידי ערבוב עם 135 μL של תמיסת DPPH של 0.1 mM.
    5. דוגרים על התערובת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    6. מדדו את ספיגת התוצאה ב-517 ננומטר (איור 9C).
    7. התווה את עקומת הכיול הסטנדרטית באמצעות ריכוזים של עיכוב סטנדרטי ו- % עיכוב (איור 10C).
    8. חשב את % עיכוב של בדיקת DPPH באופן הבא:
      % עיכוב = [(ספיגת בקרה - ספיגת דגימה)/ ספיגת בקרה] × 100
    9. בטא את התוצאות כ- mg של יכולת נוגדת חמצון שוות ערך ל- Trolox לכל גרם של הדגימה, המחושבת על ידי המשוואה הבאה20:
      הערה: מ"ג של טרולוקס שווה ערך (TE) לגרם מדגם = [((% עיכוב-c) / m) במיקרוגרם טרולוקס שווה ערך × נפח כולל בבאר תגובה (מ"ל) x דילול × משקל הדגימה היבשה (1 גרם) x נפח התוצאה של תמצית (מ"ל)] / [(נפח הדגימה שנוסף לכל באר (מ"ל) x משקל בפועל של דגימה יבשה (g) גורם המרה × ממק"ג למ"ג (1000)]
      כאשר, c = y-intercept, m = שיפוע
  2. 2,2′-Azino-bis-3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulphonic acid (ABTS) בדיקת ניקוי רדיקלים
    1. קבע את פעילות ניקוי הרדיקלים ABTS של תמצית CS באמצעות הפרוטוקול מההפניה עם כמה שינויים17.
    2. הכינו את תמיסת המלאי ABTS·+ על ידי ערבוב 7 mM ABTS ו-2.45 mM אשלגן פרסולפט (1:2) ודגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות.
    3. הכן את פתרון העבודה על ידי ערבוב 5 מ"ל של תמיסת מלאי ABTS·+ עם 100 מ"ל של מים נטולי יונים.
    4. ערבבו 160 μL של תמיסת עבודה ABTS·+ עם 10 μL של הדגימה המדוללת פי 10 או תקן טרולוקס בריכוזים שונים (ראו טבלה 7 וטבלה 8).
    5. לדגור על התגובה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    6. קבעו את ספיגת התערובת ב-734 ננומטר (איור 9D).
    7. שרטט את עקומת הכיול הסטנדרטית באמצעות ריכוזים של עיכוב סטנדרטי ו- % עיכוב (איור 10D).
    8. חשב % עיכוב של בדיקת ABTS באמצעות הנוסחה הבאה:
      % עיכוב = [(ספיגת בקרה - ספיגת דגימה) / ספיגת בקרה] × 100.
      1. הבע את התוצאות כמ"ג של יכולת נוגדת החמצון המקבילה של טרולוקס לגרם של הדגימה, המחושבת באמצעות המשוואה הבאה21:
        הערה: מ"ג של טרולוקס שווה ערך (TE) לגרם מדגם = [((% עיכוב - c) / m)) במיקרוגרם שווה ערך לטרולוקס × נפח כולל בבאר תגובה (מ"ל) x דילול × משקל הדגימה היבשה (1 גרם) x נפח התוצאה של תמצית (מ"ל)] / [(נפח הדגימה שנוסף לכל באר (מ"ל) x משקל בפועל של דגימה יבשה (גרם) גורם המרה × ממק"ג למ"ג (1000)]
        כאשר, c = y-intercept, m = שיפוע
  3. בדיקת כוח נוגד חמצון להפחתת ברזל (FRAP)
    1. קבע את הפעילות נוגדת החמצון להפחתת הפרי של תמצית CS בהתאם לפרוטוקול עם כמה שינויים17.
    2. הכן את מגיב ה-FRAP באמצעות חיץ אצטט של 30 mM ב-pH 3.6, שהוא תערובת של תמיסת TPTZ של 10 mM ב-HCl של 40 mM ותמיסת FeCl3.6H 2O של 20 mM ביחס של 10:1:1.
    3. הכניסו את מגיב ה-FRAP לבקבוק ענבר עד לצורך.
      הערה: ודא שמגיב ה-FRAP חום. אם הוא מזוהם על ידי יוני מתכת או תרכובות תגובתיות אחרות, המגיב יהפוך לסגול ויש להשליכו. השתמש רק בריאגנטים טריים.
    4. הכינו דילול פי 5 של הדגימות על ידי דילול שלהן במים מזוקקים.
    5. הוסף 10 μL של הדגימה המדוללת או 20 μL של FeSO4.7H 2O בריכוזים סטנדרטיים שונים (טבלה 9 וטבלה 10) ל- 180 μL של תמיסת FRAP.
    6. לדגור על התגובה בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות.
    7. העריכו את ספיגת התערובת ב-593 ננומטר (איור 9E).
    8. שרטט את עקומת הכיול הסטנדרטית באמצעות ריכוזי התקן והספיגה ב-593 ננומטר (איור 10E).
    9. בטא את התוצאות כ- mg של FeSO4 לגרם של המדגם, המחושב באמצעות המשוואה הבאה21:
      הערה: mg FeSO4 שווה ערך (Fe (II) E) לכל דגימה g = [((A593 - c) / m)) ב μg FeSO4 שווה ערך × נפח כולל בתגובה היטב (mL) x דילול × משקל הדגימה היבשה (1 גרם) x נפח התוצאה של תמצית (mL)] / [(נפח הדגימה נוסף לכל באר (mL) x משקל בפועל של מדגם יבש (g) גורם המרה × מ μg ל mg (1000)]
      כאשר, c = y-intercept, m = שיפוע
  4. בצע את כל הבדיקות (TPC, TFC, DPPH, ABTS ו- FRAP) של כל דגימה במשולש. במחקר זה, מים שימשו כריק עבור רוב הבדיקות, למעט DPPH, שם אתנול שימש כריק כדי לטפל בספיגת רקע.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בתוכנת SPSS כדי לבצע ניתוח סטטיסטי של נתוני הניסוי.
  2. ביצוע בדיקת התקינות באמצעות מבחן שפירא-וילק.
  3. השווה את החומרים הביו-אקטיביים והפעילויות נוגדות החמצון של תמצית MAE CS מבוססת פוליאולים ותמציות MAE CS קונבנציונליות מבוססות ממסים באמצעות ANOVA חד-כיווני עם בדיקות הטווח המרובות של Duncan.
  4. בטא את כל הנתונים כממוצע ± SD (n = 3) והגדר את רמת המובהקות ב - p < 0.05.

תוצאות

השפעת ממיסי פוליאולים וממיסים קונבנציונליים על התוכן הפנולי הכולל, תכולת הפלבנואידים הכוללת, DPPH, FRAP ובדיקות נוגדות חמצון ABTS
קוטביות הממס צריכה להיות תואמת לזו של מולקולות פעילות ממוקדות כדי לשפר את יעילות המיצוי של חומרים ביו-אקטיביים מצמחים22. ניסויים נערכו באמצע...

Discussion

גורמים שונים ממלאים תפקיד מכריע ביישום מוצלח של MAE, כגון התוכן הפיטוכימי של רכיבי הצמח, משך המיצוי, טמפרטורה, עוצמת מיקרוגל, יחס מוצק-נוזל וריכוז ממס13. צמחים בדרך כלל מציגים פרופילים שונים של פיטוכימיקלים; לפיכך, הבחירה של צמחים טבעיים עשירים נוגדי חמצון ותרכובות פנוליות הוא ח?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי אוניברסיטת מה פאה לואנג. המחברים מבקשים להודות למכון התה והקפה של אוניברסיטת מה פאה לואנג על הקלת הקשר בין החוקרים לחקלאים המקומיים בנוגע לרכישת דגימות קפה כסופות עור.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-HexanediolChanjao Longevity Co., Ltd.
2,2 -Azino-bis 3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt (ABTS)SigmaA1888
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)SigmaD9132
2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ)Sigma93285
2-Digital balanceOhausPioneer
4-Digital balanceDenverSI-234
6-hydroxy-2,5,7,8 tetramethylchroman -2-carboxylic acid (Trolox)Sigma238813
96-well plateSPL Life Science
Absolute ethanolRCI Labscan64175
Acetic acidRCI Labscan64197
Aluminum chlorideLoba Chemie898
Automatic pipetteLabnetBiopett
Butylene glycolChanjao Longevity Co., Ltd.
Ethos X advanced microwave extractionMilestone Srl, Sorisole, Italy
Ferrous sulfateAjex Finechem3850
Folin-Ciocalteu's reagentLoba Chemie3870
Freezer SFSanyoC697(GYN)
Gallic acidSigma398225
GrinderOu Hardware Products Co.,Ltd
Hexylene glycolChanjao Longevity Co., Ltd.
Hydrochloric acid (37%)RCI LabscanAR1107
Iron (III) chlorideLoba Chemie3820
IsopentyldiolChanjao Longevity Co., Ltd.
MethanolRCI Labscan67561
Methylpropanediol Chanjao Longevity Co., Ltd.
Pentylene glycolChanjao Longevity Co., Ltd.
Potassium persulfateLoba Chemie5420
Propylene glycolChanjao Longevity Co., Ltd.
QuercetinSigmaQ4951
Refrigerated centrifugeHettich
Sodium acetateLoba Chemie5758
Sodium carbonateLoba Chemie5810
Sodium hydroxideRCI LabscanAR1325
Sodium nitriteLoba Chemie5954
SPECTROstar Nano microplate readerBMG- LABTECH
SPSS softwareIBM SPSS Statistics 20
Tray dryerFrance EtuvesXUE343

References

  1. Wawoczny, A., Gillner, D. The most potent natural pharmaceuticals, cosmetics, and food ingredients isolated from plants with deep eutectic solvents. J Agric Food Chem. 71 (29), 10877-10900 (2023).
  2. Syukur, M., Prahasiwi, M. S., Yuliani, S., Purwaningsih, Y., Indriyanti, E. Profiling of active compounds of extract ethanol, n-hexane, ethyl acetate and fraction ethanol of star anise (Illicium verum hook. F.) and determination of total flavonoids, total phenolics and their potential as antioxidants. Sci Technol Indones. 8 (2), 219-226 (2023).
  3. Supjaroenporn, C., Khongcharoen, P., Myo, H., Khat-Udomkiri, N. Studying the optimization, characterization, and antioxidant activities of phenolic extracts extracted from Rhus chinensis Mill. Leaf using microwave-assisted extraction system with glycerol as a green solvent. Curr Bioact Compd. 20 (3), 68-82 (2024).
  4. Gasser, M. S., Abdel Rahman, R. O. Sustainability of solvent extraction techniques in pollution prevention and control. Handbook of advanced approaches towards pollution prevention and control. , 33-66 (2021).
  5. Płotka-Wasylka, J., Rutkowska, M., Owczarek, K., Tobiszewski, M., Namieśnik, J. Extraction with environmentally friendly solvents. TrAC, Trends Anal Chem. 91, 12-25 (2017).
  6. Queffelec, J., Beraud, W., Torres, M. D., Domínguez, H. Advances in obtaining ready-to-use extracts with natural solvents. Sustain Chem Pharm. 38, 101478 (2024).
  7. Can Karaca, A., Erdem, I. G., Ak, M. M. Effects of polyols on gelation kinetics, gel hardness, and drying properties of alginates subjected to internal gelation. LWT. 92, 297-303 (2018).
  8. Nastasi, J. R., Daygon, V. D., Kontogiorgos, V., Fitzgerald, M. A. Qualitative analysis of polyphenols in glycerol plant extracts using untargeted metabolomics. Metabolites. 13 (4), 566 (2023).
  9. Khat-Udomkiri, N., Gatnawa, G., Boonlerd, N., Myo, H. Valorization of Camellia sinensis flowers in cosmetic and pharmaceutical applications: Optimization of microwave-assisted glycerin extraction. Waste Biomass Valori. 15, 323-335 (2023).
  10. Myo, H., Yaowiwat, N., Pongkorpsakol, P., Aonbangkhen, C., Khat-Udomkiri, N. Butylene glycol used as a sustainable solvent for extracting bioactive compounds from Camellia sinensis flowers with ultrasound-assisted extraction. ACS omega. 8 (5), 4976-4987 (2023).
  11. Myo, H., Khat-Udomkiri, N. Optimization of ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from coffee pulp using propylene glycol as a solvent and their antioxidant activities. Ultrason Sonochem. 89, 106127 (2022).
  12. Twaij, B. M., Hasan, M. N. Bioactive secondary metabolites from plant sources: Types, synthesis, and their therapeutic uses. Int J Plant Biol. 13 (1), 4-14 (2022).
  13. Bitwell, C., Sen, I. S., Luke, C., Kakoma, M. K. A review of modern and conventional extraction techniques and their applications for extracting phytochemicals from plants. Sci Afr. 19, e01585 (2023).
  14. Chakrabortty, S., Kumar, A., Patruni, K., Singh, V., et al. . Recent advances in food biotechnology. , 353-370 (2022).
  15. Fan, L., et al. Mechanochemical assisted extraction as a green approach in preparation of bioactive components extraction from natural products - A review. Trends Food Sci Technol. 129, 98-110 (2022).
  16. Bessada, S. M., C Alves, R., Pp Oliveira, M. B. Coffee silverskin: A review on potential cosmetic applications. Cosmetics. 5 (1), 5 (2018).
  17. Myo, H., Nantarat, N., Khat-Udomkiri, N. Changes in bioactive compounds of coffee pulp through fermentation-based biotransformation using Lactobacillus plantarum TISTR 543 and its antioxidant activities. Fermentation. 7 (4), 292 (2021).
  18. Molole, G. J., Gure, A., Abdissa, N. Determination of total phenolic content and antioxidant activity of Commiphora mollis (oliv). Engl. Resin. BMC Chem. 16 (1), 48 (2022).
  19. Barku, V., Opoku-Boahen, Y., Owusu-Ansah, E., Mensah, E. Antioxidant activity and the estimation of total phenolic and flavonoid contents of the root extract of Amaranthus spinosus. Asian J Plant Sci Res. 3 (1), 69-74 (2013).
  20. Samarasiri, M., Chandrasiri, T., Wijesinghe, D., Gunawardena, S. Antioxidant capacity and total phenolic content variations against Morinda citrifolia L. fruit juice production methods. Int J Food Eng. 5, 293-299 (2019).
  21. Rumpf, J., Burger, R., Schulze, M. Statistical evaluation of DPPH, ABTS, FRAP, and Folin-Ciocalteu assays to assess the antioxidant capacity of lignins. Int J Biol Macromol. 233, 123470 (2023).
  22. Lainez-Cerón, E., Ramírez-Corona, N., Jiménez-Munguía, M. T., Palou, E., López-Malo, A. Extraction of bioactive compounds from plants by means of new environmentally friendly solvents. Research and technological advances in food science. , 301-332 (2022).
  23. Yu, M., Gouvinhas, I., Rocha, J., Barros, A. I. R. N. A. Phytochemical and antioxidant analysis of medicinal and food plants towards bioactive food and pharmaceutical resources. Sci Rep. 11 (1), 10041 (2021).
  24. Lefebvre, T., Destandau, E., Lesellier, E. Selective extraction of bioactive compounds from plants using recent extraction techniques: A review. J Chromatogr A. 1635, 461770 (2021).
  25. Nandasiri, R., Eskin, N. M., Thiyam-Höllander, U. Antioxidative polyphenols of canola meal extracted by high pressure: Impact of temperature and solvents. J Food Sci. 84 (11), 3117-3128 (2019).
  26. Jha, A. K., Sit, N. Extraction of bioactive compounds from plant materials using combination of various novel methods: A review. Trends Food Sci Technol. 119, 579-591 (2022).
  27. Czarnecki, M. A., et al. Solvent effect on the competition between weak and strong interactions in phenol solutions studied by near-infrared spectroscopy and DFT calculations. Phys Chem Chem Phys. 23 (35), 19188-19194 (2021).
  28. Lu, W., Mackie, C. J., Xu, B., Head-Gordon, M., Ahmed, M. A computational and experimental view of hydrogen bonding in glycerol water clusters. J Phys Chem A. 126 (10), 1701-1710 (2022).
  29. Fan, C., Liu, Y., Sebbah, T., Cao, X. A theoretical study on terpene-based natural deep eutectic solvent: Relationship between viscosity and hydrogen-bonding interactions. Glob Chall. 5 (3), 2000103 (2021).
  30. Liese, S., Schlaich, A., Netz, R. R. Dielectric constant of aqueous solutions of proteins and organic polymers from molecular dynamics simulations. J Chem Phys. 156 (22), 224903 (2022).
  31. Noreland, E., Gestblom, B., Sjöblom, J. Dielectric relaxation studies of 1-hexanol and 1, 2-hexanediol in heptane. J Solution Chem. 18, 303-312 (1989).
  32. Wohlfarth, C. Permittivity (dielectric constant) of liquids. CRC Handbook of Chemistry and Physics. 6, (1994).
  33. Dean, J. R. . Extraction techniques for environmental analysis. , (2022).
  34. Nour, A. H., Oluwaseun, A. R., Nour, A. H., Omer, M. S., Ahmed, N. Microwave-assisted extraction of bioactive compounds. Microwave heating. Electromagnetic fields causing thermal and non-thermal effects. , 1-31 (2021).
  35. David, F., Ochiai, N., Sandra, P. Stir bar sorptive extraction: A versatile, sensitive and robust technique for targeted and untargeted analyses. Evolution of solid-phase microextraction technology. , (2023).
  36. López-Fernández, O., et al. Determination of polyphenols using liquid chromatography-tandem mass spectrometry technique (LC-MS/MS): A review. Antioxidants. 9 (6), 479 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved