Extração assistida por micro-ondas de compostos fenólicos e antioxidantes para aplicações cosméticas usando tecnologia baseada em poliol

Resumo

Este protocolo detalha a utilização de um método de extração assistida por micro-ondas à base de poliol para extrair compostos fenólicos e antioxidantes naturais, representando uma abordagem prática e ambientalmente sustentável para o desenvolvimento de extratos prontos para uso.

Resumo

A utilização de polióis como solventes verdes para extração de compostos bioativos de materiais vegetais tem ganhado atenção devido à sua segurança e comportamento inerte com produtos químicos bioativos vegetais. Este estudo explora a extração sustentável de compostos fenólicos e antioxidantes naturais da casca de café usando o método de extração assistida por micro-ondas (MAE) com solventes à base de poliol: glicerina, propilenoglicol (PG), butilenoglicol (BG), metilpropanodiol (MPD), isopentildiol (IPD), pentilenoglicol, 1,2-hexanodiol e hexilenoglicol (HG). Foi realizada uma análise comparativa de extrações com solventes convencionais e não convencionais, com foco em seu impacto nos compostos bioativos do MAE, englobando parâmetros como conteúdo fenólico total (TPC), teor total de flavonoides (TFC) e atividades antioxidantes como o ensaio de sequestro de radicais 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), o ensaio de sequestro de radicais 2,2′-azino-bis(-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS) e o ensaio de poder antioxidante redutor férrico (FRAP). Os maiores valores foram observados para TPC com extração aquosa de 1,2-hexanodiol (amostra de 52,0 ± 3,0 mg GAE/g), TFC com extração aquosa de 1,2-hexanodiol (amostra de 20,0 ± 1,7 mg QE/g), DPPH com extração aquosa de HG (amostra de 13,6 ± 0,3 mg TE/g), ABTS com extração aquosa de pentilenoglicol (amostra de 8,2 ± 0,1 mg TE/g) e FRAP com extração aquosa de HG (amostra de 21,1 ± 1,3 mg Fe (II) E/g). Esta pesquisa visa avançar a tecnologia de extração ecologicamente correta por meio de componentes naturais de plantas, promovendo a sustentabilidade ao minimizar o uso de produtos químicos perigosos e reduzir o tempo e o consumo de energia, com aplicações potenciais em cosméticos.

Introdução

Atualmente, há uma tendência global de conscientização ambiental na indústria da beleza, levando os fabricantes a se concentrarem em tecnologia verde para extração de componentes vegetais usando alternativas sustentáveis¹. Normalmente, solventes tradicionais, como etanol, metanol e hexano, são usados para extrair componentes fenólicos vegetais e antioxidantes naturais². No entanto, a presença de resíduos de solventes nos extratos vegetais representa um risco potencial para a saúde humana, induzindo irritação cutânea e ocular³, particularmente no que diz respeito à sua aplicação em cosméticos. Consequentemente, é desafiador eliminar esses resíduos de solventes dos extratos, um processo que demanda considerável investimento em tempo, energia e recursos humanos⁴. Recentemente, água superaquecida, líquidos iônicos, solventes eutéticos profundos e solventes bioderivados surgiram como abordagens promissoras para a extração de solventes verdes⁵. No entanto, seu uso ainda é limitado pela separação do produto em processos aquosos. Para enfrentar esses desafios, o desenvolvimento de extratos prontos para uso surge como uma solução viável⁶.

Os polióis são frequentemente usados em formulações cosméticas como umectantes devido à sua boa polaridade e capacidade de reter a umidade do ambiente⁷. Além disso, polióis como glicerina, propilenoglicol, butilenoglicol, metilpropanodiol, isopentildiol, pentilenoglicol, 1,2-hexanodiol e hexilenoglicol podem ser utilizados para extrações de plantas. São considerados solventes não tóxicos, biodegradáveis, ecologicamente corretos, não reativos e seguros para uso na extração de plantas⁸. Além disso, os polióis podem suportar o calor gerado durante a extração assistida por micro-ondas (MAE) devido aos seus pontos de ebulição e polaridade elevados⁹. Esses polióis são geralmente reconhecidos como produtos químicos seguros (GRAS) pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos. Ao contrário dos solventes convencionais, como etanol ou metanol, que podem exigir uma remoção rigorosa do extrato devido aos seus efeitos potencialmente nocivos, os polióis oferecem a vantagem de minimizar a energia, o tempo e os custos associados aos processos de remoção de solventes¹⁰. Isso não apenas agiliza o processo de extração, mas também aumenta a eficiência geral e a sustentabilidade do método de extração. Investigações anteriores empregaram polióis como propilenoglicol e butilenoglicol como solventes na extração de compostos bioativos de flores de Camellia sinensis ¹⁰ e polpa de café¹¹, revelando potencial significativo para seu papel como solventes alternativos sustentáveis no processo de extração de plantas. Assim, o desenvolvimento e a otimização contínuos de um sistema de solvente de polióis-água têm potencial para avanços significativos na química verde e em práticas industriais sustentáveis.

Geralmente, os compostos bioativos encontrados nas plantas são sintetizados como metabólitos secundários. Esses compostos podem ser categorizados em três grupos primários: terpenos e terpenóides, alcalóides e compostos fenólicos¹². Vários métodos de extração são utilizados em diferentes condições para isolar compostos bioativos específicos das plantas. Compostos bioativos de materiais vegetais podem ser extraídos usando técnicas convencionais ou não convencionais. Os métodos tradicionais incluem maceração, extração de refluxo e hidrodestilação, enquanto os métodos não convencionais consistem em extração assistida por ultrassom, extração assistida por enzima, extração assistida por micro-ondas (MAE), extração assistida por campo elétrico pulsado, extração de fluido supercrítico e extração de líquido pressurizado¹³. Esses métodos não convencionais são projetados para aumentar a segurança, utilizando solventes e auxiliares mais seguros, melhorando a eficiência energética, evitando a degradação dos componentes bioativos e reduzindo a poluição ambiental¹⁴.

Além disso, o MAE está entre as sofisticadas tecnologias verdes para extração de compostos bioativos de plantas. Os procedimentos convencionais de extração requerem quantidades significativas de tempo, energia e altas temperaturas, que com o tempo podem degradar compostos bioativos sensíveis ao calor¹³. Em contraste com as extrações térmicas convencionais, o MAE facilita a extração de compostos bioativos, gerando aquecimento localizado dentro da amostra, interrompendo as estruturas celulares e aumentando a transferência de massa, aumentando assim a eficiência da extração do composto. O calor é transferido de dentro das células vegetais por microondas, que operam nas moléculas de água dentro dos componentes da planta¹³. Além disso, o MAE avançou para melhorar a extração e separação de compostos ativos, aumentando o rendimento do produto, aumentando a eficiência da extração, exigindo menos produtos químicos e economizando tempo e energia, evitando a destruição de compostos bioativos¹⁵.

Esta pesquisa se concentra na extração de compostos fenólicos vegetais e antioxidantes naturais por meio de extração assistida por micro-ondas (MAE) usando diferentes tipos de polióis como solventes. O conteúdo fenólico total (TPC), o conteúdo total de flavonóides (TFC) e as atividades antioxidantes (DPPH, ABTS e FRAP) dos extratos de MAE à base de poliol são determinados. Além disso, o MAE à base de poliol é comparado com o MAE usando solventes convencionais, como água e etanol. Espera-se que esta pesquisa contribua para o desenvolvimento de tecnologia de extração ambientalmente sustentável para componentes naturais, promovendo a sustentabilidade reduzindo a dependência de produtos químicos perigosos, encurtando os tempos de processamento e minimizando o consumo de energia na produção de matérias-primas para aplicações potenciais na indústria de cosméticos.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

1. Preparação de amostras de plantas
   1. Recolher o café fresco (Coffea arabica) e secá-lo a 60 °C num secador de tabuleiros durante 72 h¹¹.
   2. Moa a casca de prata do café seco (CS) em um pó fino usando um moedor e armazene-o em temperatura ambiente para análise posterior¹¹.
      NOTA: Neste estudo, CS fresco (C. arabica) foi coletado em Baan Doi Chang, distrito de Mae Suai, Chiang Rai, Tailândia. O CS é um subproduto obtido durante o processo de descasque que remove a camada de pergaminho dos grãos de café secos após o processamento das cerejas para remover as camadas externas do fruto¹⁶.
2. Produtos químicos
   1. Utilizar reagentes químicos de qualidade analítica, com excepção dos solventes do ensaio.
      NOTA: Solventes de grau cosmético foram usados no experimento.
   2. Use os solventes (água, etanol, glicerina, propilenoglicol, butilenoglicol, hexilenoglicol, isopentildiol, 1-2 hexanodiol, pentilenoglicol e metilpropanodiol) para a extração de CS com MAE.

2. Processo de extração

1. Preparação de amostras e solventes
   1. Preparar a amostra e os solventes para o procedimento MAE de acordo com um protocolo previamente relatado⁹ com algumas modificações.
   2. Prepare cada solvente na concentração de 60% diluindo 60 mL de cada solvente com água destilada e ajustando o volume para 100 mL para extrações triplicadas.
      NOTA: Use água 100% destilada para extração de água.
   3. Pesar 0,67 g de CS e misturar com 20 ml de cada solvente de extracção na proporção de 1:30 num recipiente de reacção (figura 1A) para MAE.
      NOTA: A quantidade máxima de sólido-líquido para cada recipiente é de 2 g de amostra e 20 mL de solvente.
   4. Adicione uma barra agitadora magnética a cada recipiente para garantir uma distribuição uniforme do calor e do solvente dentro da amostra, aumentando a eficiência do processo de extração e promovendo um melhor rendimento de extração.
      NOTA: Se solventes apolares forem aplicados ao processo de extração, as barras agitadoras de Teflon podem ser usadas em vez das barras agitadoras magnéticas para fornecer aquecimento eficaz através do sistema de micro-ondas.
   5. Feche cada vaso firmemente com uma ferramenta especial (Figura 2) e coloque todos os vasos na câmara MAE (Figura 1B).
2. Configurando o instrumento e o procedimento de extração assistida por micro-ondas
   1. Execute o procedimento de extração de acordo com o protocolo de referência com algumas modificações⁹.
   2. Abra a tela do monitor para configurar o método clicando no ícone da caixa de ferramentas na barra superior e selecionando o rotor SK eT na seção de acessórios (Figura 3A,B).
   3. Selecione a taxa de agitação das barras do agitador clicando na seção do agitador e digitando 20% (Figura 4A).
      NOTA: A taxa de agitação pode ser selecionada de 0% a 100%.
   4. Clique no setor da fechadura da porta e configure-o para ativar em temperaturas superiores a 80 °C (Figura 4B).
      NOTA: Esta configuração garante o fechamento automático da porta da câmara quando a temperatura interna ultrapassa 80 °C.
   5. Clique no ícone da tabela na barra superior (Figura 5A) e defina o gradiente de temperatura (T1) para uma duração de extração de 10 min, a potência de micro-ondas para 1800 W e a temperatura para 120 °C.
   6. Ative o agitador clicando no botão do agitador até que a luz verde apareça.
   7. Defina a velocidade do ventilador para o nível 3 (máximo) (Figura 5B).
   8. Para manter o tempo de extração, selecione a temperatura de extração desejada (T2) definindo a duração da extração para 15 min, a potência de micro-ondas para 1800 W e a temperatura para 120 °C.
   9. Defina o agitador e a velocidade do ventilador conforme indicado nas seções 2.2.6 e 2.2.7 (Figura 5A,B).
      NOTA: A temperatura máxima e a potência de microondas são de 260 °C e 1800 W.
   10. Defina o tempo de resfriamento clicando no botão de resfriamento no canto inferior esquerdo da tela e selecionando a duração de 10 min (Figura 6).
   11. Salve o método clicando no ícone salvar no canto superior direito da tela (Figura 7A).
   12. Certifique-se de que, após salvar as condições do método, o gráfico de condições de extração seja exibido na tela com o botão play no canto inferior direito (Figura 7B).
   13. Inicie o processo de extração escolhendo o número de recipientes usados (Figura 7C).
       NOTA: Até 15 recipientes podem ser usados em uma extração e, se o número desejado de recipientes for utilizado, certifique-se de que os recipientes sejam colocados de forma equilibrada na câmara.
   14. Após a extração, centrifugar os extratos a 4 °C, 9072 x g, por 15 min, usando uma centrífuga refrigerada.
   15. Recolher o sobrenadante com uma pipeta de vidro de 10 ml (figura 8) e conservá-lo a -20 °C no congelador para um estudo mais aprofundado.
       NOTA: Dependendo do tamanho da partícula e da densidade do resíduo vegetal, os extratos exigirão tempos de centrifugação mais longos (20-30 min).

3. Determinação dos compostos fenólicos

1. Determinação do teor de fenólicos totais
   1. Determinar o conteúdo fenólico total dos extratos de CS referenciando o protocolo com algumas modificações¹⁷.
   2. Preparar uma diluição de 10 vezes das amostras diluindo com água destilada.
   3. Misturar 10 μL da amostra diluída com 20 μl de reagente de Folin-Ciocalteu não diluído e deixá-los reagir durante 3 min.
   4. Em seguida, adicione 100 μL de solução de 7,5% de Na₂CO₃ à mistura em cada poço de uma placa de 96 poços.
   5. Preparar diferentes concentrações para a gama de concentração padrão de ácido gálico (ver Quadro 1 e Quadro 2) diluindo com água destilada.
   6. Misture-os com 20 μL de reagente de Folin-Ciocalteu e deixe-os reagir por 3 min.
   7. Em seguida, adicione 100 μL de solução de 7,5% de Na₂CO₃ à mistura em cada poço de uma placa de 96 poços.
   8. Incube a reação por 30 min no escuro em temperatura ambiente.
   9. Medir a absorvância da solução de reacção a 765 nm utilizando um leitor de microplacas (figura 9A).
   10. Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e da absorvância a 765 nm (figura 10A).
   11. Exprimir os resultados em mg de equivalente de ácido gálico (GAE) por g de amostra e calcular utilizando a seguinte equação¹⁸:
       NOTA: mg de equivalente de ácido gálico (GAE) por g de amostra = [((A₇₆₅ - c) / m)) em μg equivalente de ácido gálico × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada em cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)]
       onde, c = interceptação y, m = inclinação
2. Determinação do teor de flavonóides totais
   1. Determinar o teor total de flavonóides do extrato de CS de acordo com o protocolo com algumas modificações¹⁷.
   2. Preparar uma diluição de 5 vezes das amostras diluindo com água destilada.
   3. Adicione 50 μL da amostra diluída a 15 μL de NaNO₂ a 5% e incube no escuro por 5 min.
   4. Misture 15 μL de solução de AlCl₃ a 10% com a reação e mantenha-a em temperatura ambiente por 6 min.
   5. Em seguida, adicione 100 μL de solução de NaOH 1 M à reação e incube por mais 10 minutos.
   6. Medir a absorvância da mistura a 510 nm (figura 9B).
   7. Prepare diferentes concentrações de quercetina na faixa padrão (consulte as Tabelas 3 e 4) adicionando-as a 15 μL de NaNO₂ a 5% e incubando no escuro por 5 min.
   8. Misture 15 μL de solução de AlCl₃ a 10% com a reação e mantenha em temperatura ambiente por 6 min.
   9. Adicione 100 μL de solução de NaOH 1 M à reação e incube por mais 10 min.
   10. Determinar a absorvância do padrão a 510 nm (figura 9B).
   11. Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e da absorvância a 510 nm (figura 10B).
   12. Exprimir os resultados em mg de equivalente de quercetina (QE) por g de amostra, calculados pela equação¹⁹ do seguinte modo:
       NOTA: mg de equivalente de quercetina (QE) por g de amostra = [((A₅₁₀ - c) / m)) em μg equivalente de quercetina × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada a cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)]
       onde, c = interceptação y, m = inclinação

4. Determinação das atividades antioxidantes

1. Ensaio de eliminação de radicais 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH)
   1. Determine a atividade de eliminação do radical DPPH do extrato de CS de acordo com o protocolo com algumas modificações¹⁷.
   2. Preparar uma diluição de 10 vezes das amostras, diluindo-as com água destilada.
   3. Misture 20 μL das amostras diluídas com 135 μL de solução de DPPH 0,1 mM.
   4. Prepare diferentes concentrações da faixa de concentração padrão Trolox (consulte as Tabelas 5 e 6) misturando com 135 μL de solução de DPPH 0,1 mM.
   5. Incube a mistura no escuro em temperatura ambiente por 30 min.
   6. Medir a absorvância da resultante a 517 nm (figura 9C).
   7. Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e % de inibição (figura 10C).
   8. Calcular a % de inibição do ensaio DPPH do seguinte modo:
      % Inibição = [(absorbância de controle − absorbância da amostra)/ absorbância de controle] × 100
   9. Exprimir os resultados em mg da capacidade antioxidante equivalente de Trolox por g de amostra, calculada pela seguinte equação²⁰:
      NOTA: mg de equivalente de Trolox (TE) por g de amostra = [((% de inibição-c) / m) em μg de equivalente de Trolox × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada em cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)]
      onde, c = interceptação y, m = inclinação
2. Ensaio de eliminação de radicais do ácido 2,2′-Azino-Bis-3-Etilbenztiazolina-6-sulfônico (ABTS)
   1. Determine a atividade de eliminação do radical ABTS do extrato de CS usando o protocolo da referência com algumas modificações¹⁷.
   2. Prepare a solução de estoque ABTS·+ misturando 7 mM de ABTS e 2,45 mM de persulfato de potássio (1:2) e incube no escuro à temperatura ambiente por 16 h.
   3. Prepare a solução de trabalho misturando 5 mL de solução estoque ABTS·+ com 100 mL de água deionizada.
   4. Misture 160 μL de solução de trabalho ABTS·+ com 10 μL da amostra diluída a 10 vezes ou padrão Trolox em diferentes concentrações (ver Tabela 7 e Tabela 8).
   5. Incube a reação no escuro em temperatura ambiente por 30 min.
   6. Determinar a absorvância da mistura a 734 nm (figura 9D).
   7. Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e % de inibição (figura 10D).
   8. Calcular % de inibição do ensaio ABTS utilizando a seguinte fórmula:
      % Inibição = [(absorbância de controle - absorbância da amostra) / absorbância de controle] × 100.
      1. Exprimir os resultados em mg da capacidade antioxidante equivalente de Trolox por g de amostra, calculada utilizando a seguinte equação²¹:
         NOTA: mg de equivalente trolox (TE) por g de amostra = [((% de inibição - c) / m)] em μg equivalente Trolox × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada a cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)]
         onde, c = interceptação y, m = inclinação
3. Ensaio de Poder Antioxidante Redutor Férrico (FRAP)
   1. Determinar a atividade antioxidante redutora de férrico do extrato de CS de acordo com o protocolo com algumas modificações¹⁷.
   2. Prepare o reagente FRAP usando um tampão de acetato de 30 mM em pH 3,6, que é uma mistura de solução de TPTZ 10 mM em HCl 40 mM e solução de FeCl_{3,6H 2}O 20 mM na proporção de 10:1:1.
   3. Coloque o reagente FRAP em um frasco âmbar até que seja necessário.
      NOTA: Certifique-se de que o reagente FRAP esteja marrom. Se contaminado por íons metálicos ou outros compostos reativos, o reagente ficará roxo e deve ser descartado. Use apenas reagentes recém-preparados.
   4. Preparar uma diluição de 5 vezes das amostras, diluindo-as com água destilada.
   5. Adicionar 10 μL da amostra diluída ou 20 μL de FeSO_{4,7H 2}O em diferentes concentrações padrão (Tabela 9 e Tabela 10) a 180 μL da solução FRAP.
   6. Incubar a reação à temperatura ambiente durante 4 min.
   7. Avaliar a absorvância da mistura a 593 nm (figura 9E).
   8. Traçar a curva de calibração padrão utilizando as concentrações do padrão e da absorvância a 593 nm (figura 10E).
   9. Exprimir os resultados em mg de FeSO₄ por g de amostra, calculados utilizando a seguinte equação²¹:
      NOTA: mg de equivalente a FeSO₄ [Fe (II) E) por g de amostra = [((A₅₉₃ - c) / m)] em μg equivalente a FeSO₄ × Volume total no alvéolo de reação (mL) x Diluição × peso da amostra seca (1 g) x Volume resultante do extrato (mL)] / [(Volume da amostra adicionada a cada alvéolo (mL) x Peso real da amostra seca (g) × fator de conversão de μg para mg (1000)]
      onde, c = interceptação y, m = inclinação
4. Realize todos os ensaios (TPC, TFC, DPPH, ABTS e FRAP) de cada amostra em triplicata. Neste estudo, a água foi usada como branco para a maioria dos ensaios, exceto DPPH, onde o etanol serviu como branco para abordar a absorbância de fundo.

5. Análise estatística

1. Use o software SPSS para realizar uma análise estatística dos dados experimentais.
2. Realize o teste de normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk.
3. Compare as substâncias bioativas e as atividades antioxidantes do extrato de MAE CS à base de polióis e extratos de MAE CS à base de solventes convencionais usando ANOVA unidirecional com os testes de intervalo múltiplo de Duncan.
4. Expresse todos os dados como média ± DP (n = 3) e defina o nível de significância em p < 0,05.

Resultados

Efeito de solventes polióis e solventes convencionais sobre o conteúdo de fenólicos totais, teor de flavonóides totais, ensaios antioxidantes DPPH, FRAP e ABTS
A polaridade do solvente deve ser compatível com a das moléculas ativas direcionadas para melhorar a eficiência de extração de substâncias bioativas das plantas²². Experimentos foram conduzidos usando vários solventes (água, etanol, glicerina, propilenoglicol, butilenoglicol, metilpropanodiol, isopentildiol, ...

Discussão

Vários fatores desempenham um papel crucial na implementação bem-sucedida do MAE, como o conteúdo fitoquímico dos componentes da planta, duração da extração, temperatura, potência de micro-ondas, relação sólido-líquido e concentração de solvente¹³. As plantas normalmente exibem perfis variados de fitoquímicos; Assim, a seleção de plantas naturais ricas em antioxidantes e compostos fenólicos é essencial²³. Além disso, constituintes bioativos distintos e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Hexanediol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
2,2 -Azino-bis 3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt (ABTS)	Sigma	A1888
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)	Sigma	D9132
2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ)	Sigma	93285
2-Digital balance	Ohaus		Pioneer
4-Digital balance	Denver	SI-234
6-hydroxy-2,5,7,8 tetramethylchroman -2-carboxylic acid (Trolox)	Sigma	238813
96-well plate	SPL Life Science
Absolute ethanol	RCI Labscan	64175
Acetic acid	RCI Labscan	64197
Aluminum chloride	Loba Chemie	898
Automatic pipette	Labnet		Biopett
Butylene glycol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Ethos X advanced microwave extraction	Milestone Srl, Sorisole, Italy
Ferrous sulfate	Ajex Finechem	3850
Folin-Ciocalteu's reagent	Loba Chemie	3870
Freezer SF	Sanyo	C697(GYN)
Gallic acid	Sigma	398225
Grinder	Ou Hardware Products Co.,Ltd
Hexylene glycol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Hydrochloric acid (37%)	RCI Labscan	AR1107
Iron (III) chloride	Loba Chemie	3820
Isopentyldiol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Methanol	RCI Labscan	67561
Methylpropanediol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Pentylene glycol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Potassium persulfate	Loba Chemie	5420
Propylene glycol	Chanjao Longevity Co., Ltd.
Quercetin	Sigma	Q4951
Refrigerated centrifuge	Hettich
Sodium acetate	Loba Chemie	5758
Sodium carbonate	Loba Chemie	5810
Sodium hydroxide	RCI Labscan	AR1325
Sodium nitrite	Loba Chemie	5954
SPECTROstar Nano microplate reader	BMG- LABTECH
SPSS software	IBM SPSS Statistics 20
Tray dryer	France Etuves	XUE343