הקמת מודל חזירים לחקר שימור והשתלה דינמית של הרחם

Summary

מתואר מודל רחם חזירים מפורט וניתן לשחזור, החל מרכש כירורגי ועד להתחלת זלוף מכונה, המאפשר לחקור את שימור הרחם בהשתלה.

Abstract

נכון להיום, השתלת רחם היא האפשרות היחידה עבור נשים עם אי פוריות רחם מוחלטת, כמו אלו עם תסמונת רוקיטנסקי, לחוות הריון וללדת. למרות העניין הגובר בהשתלת רחם בשנים האחרונות, מספר נושאים עדיין דורשים מחקר נוסף, כולל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה והשפעתה על איכות השתל ודחייתו. ספרות עדכנית הדגישה שיעור סיבוכים טרומבוטיים של עד 20% לאחר השתלת רחם. סוג זה של סיבוך עלול לנבוע מנזק לתאי אנדותל הנגרם על ידי היפוקסיה, מה שמוביל לעתים קרובות לדחיית שתל הרחם. היפוקסיה נגרמת במהלך אחסון קר סטטי, שנשאר תקן הזהב לשימור השתלים בהשתלת איברים מוצקים. לאחרונה, הוכח כי שימור דינמי באמצעות זלוף מכונה משפר את האחסון לטווח ארוך של איברים קונבנציונליים ושוליים על ידי הפחתת פגיעה איסכמית והיפוקסית. בפרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר כל שלב כירורגי הכרוך ברכש רחם חזירי ושימור דינמי, המבוסס על שני פדיקלים ברחם, כדי לאפשר חיבור והתחלה של פרוטוקול זלוף המכונה.

Introduction

השתלת רחם (UTx) התפתחה משמעותית בעשר השנים האחרונות, כאשר מספר צוותים החלו בתוכניות מחקר קליניות. נכון להיום, האינדיקציה העיקרית ל-UTx היא אי פוריות רחמית מוחלטת עקב אגנזה של הרחם, כולל תסמונת מאייר-רוקיטנסקי-קיסטר-האוזר (MRKH). תסמונת MRKH היא הפרעה מולדת עם שכיחות של אחת מכל 5,000 לידות חי נקבות¹. UTx יכול לטפל בגורמים נוספים לאי פוריות, כולל אלה הנובעים מכריתת רחם עקב מחלה ממארת, דימום לאחר לידה, שרירנים ברחם, השלכות זיהומיות ומומים מולדים שונים. זה מצביע על כך שכ-1 מכל 500 נשים עשויה להיות זכאית ל-UTx.

ה-UTx הקליני הראשון אי פעם התרחש בשנת 2000 בערב הסעודית², אך סיבוכים בכלי הדם הובילו לכריתת רחם שלושה חודשים לאחר מכן. מאז, בוצעו מספר מקרים של UTx, המבוססים על תורמים חיים ומתים כאחד, וכתוצאה מכך יותר מ-80 לידות חי ^3,4. בדומה לתחום השתלת איברים מוצקים והשתלות אלוקולריות מרוכבות (VCA), דחייה חיסונית היא אתגר משמעותי ב-UTx. ⁵ מספר גורמים יכולים להוביל לדחיית השתל, כולל כשל מיקרו-סירקולטורי וקיפאון ורידי, שניהם עלולים להוביל לסיבוך פקקתי. בסקירה שנערכה לאחרונה בחקר כלי דם ברחם בהשתלה, קריסטק ועמיתיו דיווחו על עד 15% פקקת עורקים ו-5% פקקת ורידים⁶. בנוסף, איסכמיה קרה וחמה הם גורמים קריטיים שיש לטפל בהם להשתלה מוצלחת, שכן פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI) עלולה להוביל לתפקוד לקוי של השתל ולדחייה חריפה ^7,8. מיוציטים מגיבים ללחץ איסכמי על ידי ייצור לקטט עד 6 שעות⁹, ולאחר מכן נזק לתאי השריר הוא בלתי הפיך. ההשפעה של איסכמיה קרה על השריר תועדה במחקרים קליניים, והוכח כי השימוש בתמיסה תוך-תאית דמוית אוניברסיטת ויסקונסין במהלך אחסון קר סטטי (SCS) משפר את השימור עם תגובה התכווצות טובה יותר לפרוסטגלנדין וריכוזי ATP גבוהים יותר בהשוואה לתמיסת אצטט של רינגר¹⁰. עם זאת, ההשפעה של איסכמיה חמה וקרה נותרה נחקרת בצורה גרועה ב-UTx.

SCS נותר תקן הזהב לשימור VCA, כולל הרחם, ולרוב השתלות האיברים המוצקים. עם זאת, בשנים האחרונות, התקדמות משמעותית במערכות זלוף מכונות ופתרונות שימור הובילו לשינוי פרדיגמה. ישנן כיום ראיות חזקות התומכות בכך שזלוף מכונה דינמי יכול לשפר ולהאריך את השימור של איברים מוצקים בריאים ושוליים 11,12,13,14,15. טכניקה זו משמשת כיום בדרך כלל בפרקטיקה הקלינית להשתלת ריאות, לב, כבד וכליות 14,16,17,18. שימור איברים דינמי הוכיח יתרונות מרובים, כולל מזעור איסכמיה קרה ופגיעות היפוקסיה על ידי אספקת חמצן רציפה ואספקת חומרים מזינים, פינוי מטבוליטים רעילים ושיפור איכות השתל ופרמטרי הכדאיות^12,19. פותחו מספר אופנים, החל מהיפותרמיה ועד זלוף מכונה נורמותרמית (עם או בלי נושאי חמצן), עם מספר פרפוזטים זמינים, אך רק מעטים נבדקו על הרחם²⁰. כדי להבטיח את התרומה המשמעותית של נקודות מבט מחקריות כאלה, יש חשיבות מכרעת למודלים כירורגיים פרה-קליניים רלוונטיים.

בעבודה זו, זלוף מכונה תת-נורמותרמית (SNMP) משמש כשיטת שימור איברים דינמיים מחומצנים בטמפרטורת החדר (בסביבות 20 מעלות צלזיוס) על ידי זרימת פרפוזה דרך משאבת רולר ומחמצן. נעשה שימוש במודל חזירי הרלוונטי למחקרים על UTx ושימור בשל הדמיון שלו למערכת הרבייה האנושית מבחינת אנטומיה, פיזיולוגיה וגודל כלי דם^21,22. הרחם נרכש לאחר מוות במחזור הדם, מה שמספק רלוונטיות לתרומה לאחר מוות לבבי ומרמז על אפשרות לעיכוב ברכישה לאחר כל שאר האיברים המוצקים הרלוונטיים^23,24. בנוסף, מודל זה מקל על פיתוח מחקרי שימור רחם במעבדות השתלות מבוססות המתמקדות באיברים אחרים, תוך יישום עקרונות "3Rs"²⁵. המטרה היא לבסס מודל שימור חדש המבוסס על פדיקל רחמי ולהעריך את אמינותו לשימור דינמי. כל שלבי ההליך מפורטים, מכריתת הרחם ועד לשימור, ומקיפים נקודות מפתח מודגשות בשימוש ב-SNMP.

הפרוטוקול המתואר להלן קדם לניסוי מקדים המבוסס על משאבה בודדת ומערכת זרימה "צינורית Y" לשני עורקי הרחם (איור משלים 1). לאחר 4 שעות-SNMP, האיבר עלה ביותר מ-50% ממשקלו ההתחלתי. זרימה, לחץ, התנגדות ושונות במשקל מוצגים באיור משלים 2. מערכת זלוף אחת שהופרדה לשתי זרימות לא אפשרה אפנון של כל קצב זרימה ללחץ של כל צד. במקרה זה, SNMP הוביל לבצקת משמעותית במחצית האיבר (איור משלים 3). מערכת זו התגלתה כלא מתאימה למודל הרחם, בין היתר מכיוון שאין להתייחס אליה כמודל סימטרי לחלוטין. לכן, נעשה שימוש בשתי מערכות של זלוף מכונה בפרוטוקול זה, אחת לכל עורק רחם.

Protocol

כל בעלי החיים קיבלו טיפול הומני בהתאם למדריך המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, והפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (IACUC). בסך הכל, 6 נקבות מיני-חזירות יוקטן במשקל 30-40 ק"ג שימשו לרכש רחם, כאשר ארבע רחם עברו SNMP. כל בעלי החיים עברו הפרין במינון מלא אחד (100 יחב"ל/ק"ג) לפני המתת חסד. רכישת איברים התרחשה לאחר המוות עם פחות מ-60 דקות של איסכמיה חמה. ניתן היה לקצור איברים אחרים מאותו תורם למחקרים שונים, על פי עקרונות "3Rs"²⁵. עיין בטבלת החומרים לפרטים על כל הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול.

1. הכנה טרום ניתוחית (יום לפני הניתוח)

1. הכן את תמיסת הפרפוזה. עבור זלוף מכונה תת-נורמותרמית, נעשה שימוש בפתרון Steen+ המותאם ל-VCA^26,27. נעשה שימוש בליטר אחד של תמיסה לרחם, וההרכב מפורט בטבלה 1.
   הערה: כמות גדולה של נתרן הידרוקסיד מתווספת לפרפוזה במטרה להשיג pH של סביב 7.5-7.6. ערך זה גבוה במפורש אך הכרחי מכיוון שה-pH נוטה לרדת כאשר המכונה מופצת ומחומצנת בתערובת קרבוגן (95% חמצן; 5% פחמן דו חמצני).
2. הגדר את מערכת הזלוף של המכונה (איור 1). בדוק אם יש נזילות ובועות כאשר מופץ פרפוזה.

2. רכש רחם לאחר המוות

הערה: כדי לדמות תרומה לאחר מוות לבבי ו/או רכש לאחר המוות, יש להמית את בעל החיים בהתאם להנחיות המקומיות של IACUC. יש להעדיף הזרקה תוך ורידית של פנטוברביטל על מנת למנוע רעילות שעלולה להפריע למחקר.

1. הנח את החיה המורדמת במצב שכיבה. שפשפו את אזור הבטן והניחו וילונות סטריליים.
2. בצע חתך אינפרא טבורי חציוני של 10 ס"מ עם להב #20.
3. פתח את הרקמה התת עורית ואת האפונורוזיס בעזרת אזמל חשמלי חד קוטבי.
   הערה: יש לשים לב שלא לפגוע במעיים על ידי פתיחת חלל הבטן.
4. הניחו בצד את המעי הדק עם גזה כירורגית וחשפו את הרחם.
   הערה: אנטומיית הרחם של המודל בו נעשה שימוש מוצגת באיור 2A.
5. המשך באופן דומה לצד שמאל וימין כדלקמן:
   1. זהה את כלי הרחם.
      הערה: וריד הרחם ממוקם לרוחב עורק הרחם (איור 3).
   2. צור פתח לרצועה הרחבה לרוחב לווריד הרחם בעזרת מלקחיים בזווית ישרה.
   3. דרך פתח זה, הכנס 2-0 תפרי קשירת משי כדי לקשור את כלי השחלה ולשחרר את הרחם מרקמת החיבור שמסביב ברצועה הרחבה באמצעות צריבה.
   4. קשרו את כלי הרחם-שחלות עם 2-0 תפרי קשירת משי והוציאו את השחלה והצינור.
   5. שלד כלי רחם וחלק אותם קרוב ככל האפשר לכלי הכסל הפנימיים.
      הערה: יש לשים לב לשמירה על הפדיקל זמן רב ככל האפשר כדי להקל על הקנולציה ולצפות לנסיגת פדיקל לאחר ניתוקו.
   6. חזור על שלבים 2.5.1-2.5.5 בצד הנגדי.
6. הסר את הרחם על ידי חיתוך צוואר הרחם בעזרת אזמל חשמלי חד קוטבי.
   הערה: השתמש בזמן מגע ארוך כדי להבטיח קרישה תקינה של כלי צוואר הרחם, ולמנוע דליפה במהלך הזלוף.

3. הכנה לזלוף

1. על שולחן צד יש להרחיב את שני עורקי הרחם באמצעות מרחיב מיקרו-כירורגי ולהכניס אנגיוקטטר. אבטח את הקנולציה עם קשרי משי 3-0 (איור 2B).
   הערה: כאן, אנגיוקטטר 18 G שימש לכל העורקים. יש להקפיד לא להכניס את הקטטר רחוק מדי כדי למנוע קנולציה סלקטיבית, מכיוון שההסתעפות קרובה יחסית. ורידי הרחם אינם קנולרים, מכיוון שזרימה ורידית מספיקה כדי לשמור על לומן של כלי דם אלה פתוח, מה שמאפשר איסוף קל. בנוסף לחיסכון בזמן, קנולציה טראומטית עלולה להוביל לנזק לכלי הדם ועשויה להשפיע על זרימת הוורידים.
2. יש לשטוף לאט ידנית את שני עורקי הרחם עם 20 מ"ל תמיסת הפרין מכל צד עד שכל הכלים נשטפים החוצה והזרימות היוצאות נקיות.
   הערה: יש לשים לב לא לשטוף בלחץ גבוה, מה שעלול להוביל לפציעות מיקרו-וסקולריות ולכישלון זלוף.
3. שקלו את הרחם.

4. זלוף מכונה תת-נורמותרמית

הערה: עבור הרחם, נדרשות שתי מערכות עצמאיות של זלוף מכונה. כל עורק רחם מחובר למערכת זלוף המורכבת ממשאבת רולר, מחמצן, מלכודת בועות וחיישן לחץ. הפרפוזה במאגר מסתובבת דרך צינורות סיליקון המחוברים לאלמנטים המפורטים לעיל לפני שהיא עוברת דרך האיבר דרך עורק הרחם לווריד הרחם בכל צד, שם הפרפוזה יוצאת ומשתחררת באותו מאגר.

1. חבר את הרחם למערכות הזלוף של המכונה על ידי חיבור צינוריות עורק הרחם לתוך צינור הזרימה (איור 1).
2. בעזרת משאבת הגליל, כוונן את קצב הזרימה לנמוך (2.5-4.0 מ"ל/דקה) כדי לשמור על לחץ עורקי קבוע בין 25-35 מ"מ כספית.
3. להעריך פרמטרי כדאיות בכל נקודת זמן מוגדרת מראש הן בזרימה והן ביציאה באמצעות מזרק של 1 מ"ל וניתוח דגימות עם מכונת מערכת גזי הדם [למשל, מדדי גזי דם (pH, pCO₂, pO₂, לקטט, עודף בסיס, ביקרבונט), גלוקוז, נתרן, אשלגן, סידן, כלוריד].
   הערה: בפרוטוקול זה, הזלוף נמשך 4 שעות, ודגימות מהזרימה הנכנסת והיוצאת נלקחות כל 30 דקות.
4. שקלו את הרחם בסוף הזלוף.

תוצאות

במהלך הזילוף, המערכת חוברה לחיישן לחץ שרשם את הלחץ במהלך הניסוי. הלחץ נרשם בתחילה עבור מערכת נטולת רחם, שהופחתה מרישומי הלחץ במהלך זלוף הרחם כדי להשיג את לחץ האיברים האמיתי. קצב הזרימה הותאם לשמירה על הלחץ בטווח הרצוי ונשלט על ידי משאבת הגליל. ההתנגדות חושבה באמצעות הנוס?...

Discussion

השתלת רחם, הנחשבת לעתים קרובות לחלק מ-VCA, התפתחה במהירות בשנים האחרונות. במקביל, החלו לחקור זלוף מכונה ב-VCA מכיוון שהוא הראה ראיות חזקות בשיפור שימור איברים מוצקים. זלוף מכונה היפותרמי ותת-נורמותרמי איפשר שימור של עד 24 שעות בדגמי חזירים של VCA ^26,27,28

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Pixie Oxygenation System	Medtronic	BBP241	Oxygenator
Bovin serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647	Perfusate component
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506	Perfusate component
Carbon Dioxide Oxygen	Airgas	UN3156	Carbon Dioxide Oxygen mix gas
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	49159	Perfusate component
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusate component
Dextran	Thermo scientific	406271000	Perfusate component
Heparin sodium injection	Eugia Pharma	63739-953-25	Perfusate component
Humulin Regular Insulin human	Lilly	0002-8215-01	Perfusate component
Hydrocortisone sodium succinate	Pfizer	0009-0011-03	Perfusate component
Magnesium chloride hexa-hydrate	Sigma-Aldrich	M9272	Perfusate component
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	Roller pump
Polyethylene glycol 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	Perfusate component
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Perfusate component
Pressure Monitor, Portable, PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	Pressure sensor
Radnoti Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149	Bubble trap
RAPIDPoint500	Siemens	500	Blood Gas System
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Perfusate component
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Perfusate component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	72068	Perfusate component
Sodium phosphate monobasique dihydrate	Sigma-Aldrich	71505	Perfusate component
Syringe 1 mL	BD	309659	Sample procurement
Vancomycine hydrochloride	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	Perfusate component