Создание модели свиньи для изучения динамического сохранения и трансплантации матки

Резюме

Описана подробная и воспроизводимая модель матки свиньи, начиная с хирургического вмешательства и заканчивая инициацией аппаратной перфузии, что позволяет изучать сохранение матки при трансплантации.

Аннотация

На сегодняшний день трансплантация матки является единственным вариантом для женщин с абсолютным маточным бесплодием, таких как женщины с синдромом Рокитанского, чтобы пережить беременность и родить. Несмотря на растущий интерес к трансплантации матки в последние годы, некоторые вопросы все еще требуют дальнейших исследований, в том числе ишемия-реперфузионное повреждение и его влияние на качество трансплантата и отторжение. В недавней литературе подчеркивается, что частота тромботических осложнений составляет до 20% после трансплантации матки. Этот тип осложнения может возникнуть в результате повреждения эндотелиальных клеток, вызванного гипоксией, что часто приводит к отторжению маточного трансплантата. Гипоксия индуцируется во время статического холодного хранения, которое остается золотым стандартом сохранения трансплантата при трансплантации солидных органов. В последнее время было показано, что динамическая консервация с помощью машинной перфузии улучшает долгосрочное хранение обычных и маргинальных органов за счет снижения ишемического и гипоксического повреждения. В этом протоколе мы стремимся описать каждый хирургический этап, связанный с получением и сохранением матки свиньи на основе обеих ножок матки, чтобы обеспечить подключение и инициирование протокола аппаратной перфузии.

Введение

Трансплантация матки (UTx) значительно развилась за последние десять лет, и несколько команд начали программы клинических исследований. На сегодняшний день основным показанием к ВТХ является абсолютное маточное бесплодие вследствие агенезии матки, в том числе синдром Майера-Рокитанского-Кюстера-Хаузера (MRKH). Синдром MRKH является врожденным заболеванием, встречающимся чаще одного из 5 000 живорожденных женщин¹. ЮТХ потенциально может устранить дополнительные причины бесплодия, в том числе возникшие в результате гистерэктомии из-за злокачественного заболевания, послеродового кровотечения, миомы матки, инфекционных осложнений и различных врожденных пороков развития. Это говорит о том, что примерно 1 из 500 женщин может иметь право на UTx.

Первый в истории клинический UTx был проведен в 2000 году в Саудовской Аравии², но сосудистые осложнения привели к гистерэктомии три месяца спустя. С тех пор было проведено несколько случаев ВТХ, основанных как на живых, так и на умерших донорах, в результате чего было зарегистрировано более 80 живорождений3,4. Подобно области трансплантации солидных органов и васкуляризированных композитных аллотрансплантатов (VCA), иммунное отторжение является серьезной проблемой при UTx. ⁵ К отторжению трансплантата могут привести несколько факторов, включая микроциркуляторную недостаточность и венозный застой, оба из которых могут привести к тромботическому осложнению. В недавнем обзоре, изучающем васкуляризацию матки при трансплантации, Kristek et al. сообщили о 15% артериального тромбоза и 5% венозного тромбоза⁶. Кроме того, холодная и теплая ишемия являются критическими факторами, на которые необходимо обратить внимание для успешной трансплантации, поскольку ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ) может привести к дисфункции трансплантата и острому отторжению ^7,8. Миоциты реагируют на ишемический стресс продукцией лактата в течение 6 ч⁹ ч, после чего повреждение мышечных клеток необратимо. Влияние холодовой ишемии на миометрий было задокументировано в клинических исследованиях, и было показано, что использование внутриклеточного раствора Университета Висконсина во время статического холодового хранения (SCS) улучшает сохранность с лучшей сократительной реакцией на простагландин и более высокими концентрациями АТФ по сравнению^{с раствором} ацетата Рингера. Тем не менее, влияние теплой и холодной ишемии остается плохо изученным в UTx.

SCS остается золотым стандартом для сохранения VCA, включая матку, и для большинства трансплантаций солидных органов. Однако в последние годы значительный прогресс в системах перфузии машин и решениях для консервации привел к смене парадигмы. В настоящее время существуют убедительные доказательства того, что динамическая машинная перфузия может улучшить и продлить сохранение здоровых и маргинальных солидных органов 11,12,13,14,15. Этот метод в настоящее время широко используется в клинической практике для трансплантации легких, сердца, печени и почек 14,16,17,18. Динамическое сохранение органов продемонстрировало множество преимуществ, включая минимизацию холодовой ишемии и гипоксии за счет обеспечения непрерывного снабжения кислородом и питательными веществами, очищения от токсичных метаболитов и улучшения качества и жизнеспособности трансплантата^12,19. Было разработано несколько методов, от гипотермической до нормотермической аппаратной перфузии (с переносчиками кислорода или без них), с несколькими доступными перфузатами, но только некоторые из них были протестированы на матке^. Для обеспечения существенного вклада таких исследований решающее значение имеют соответствующие доклинические хирургические модели.

В данной работе субнормотермическая машинная перфузия (SNMP) используется в качестве метода динамического консервирования кислорода при комнатной температуре (около 20 °C) путем циркуляции перфузата через роликовый насос и оксигенатор. Используется модель свиньи, которая актуальна для исследований по UTx и сохранению из-за ее сходства с репродуктивной системой человека с точки зрения анатомии, физиологии и размера сосуда^21,22. Матка закупается после смерти кровообращения, что обеспечивает актуальность для донорства после сердечной смерти и предполагает возможность задержки закупки после всех других соответствующих солидных органов^23,24. Кроме того, эта модель облегчает проведение исследований по сохранению матки в рамках существующих трансплантационных лабораторий, уделяя особое внимание другим органам, применяя принципы «3R»²⁵. Цель состоит в том, чтобы создать новую модель сохранения на основе ножок матки и оценить ее надежность для динамического сохранения. Подробно описаны все этапы процедуры, от гистерэктомии до консервации, с учетом выделенных ключевых моментов использования SNMP.

Описанный ниже протокол предшествовал предварительному эксперименту, основанному на использовании одного насоса и системы притока «Y-образной трубки» для обеих маточных артерий (дополнительный рисунок 1). После 4 ч SNMP орган набрал более 50% от своего первоначального веса. Изменение расхода, давления, сопротивления и веса показано на дополнительном рисунке 2. Единая перфузионная система, разделенная на два входа, не позволяла модулировать скорость каждого потока в соответствии с давлением каждой стороны. В этом случае SNMP приводила к значительному отеку в половине органа (дополнительный рисунок 3). Эта система оказалась непригодной для модели матки, отчасти потому, что ее не следует считать идеально симметричной моделью. Поэтому в этом протоколе были использованы две системы аппаратной перфузии, по одной на каждую маточную артерию.

протокол

Все животные получили гуманный уход в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных, а протоколы были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля. В общей сложности для получения маток было использовано 6 самок юкатанских минипигов весом 30-40 кг, при этом четыре матки были подвергнуты SNMP. Все животные были гепаринизированы одной полной дозой (100 МЕ/кг) перед эвтаназией. Забор органов происходил после смерти с менее чем 60-минутной теплой ишемией. Другие органы могли быть собраны у того же донора для других исследований в соответствии с принципом «3R»²⁵. Подробную информацию обо всех реагентах и оборудовании, использованных в протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Предоперационная подготовка (за сутки до операции)

1. Приготовьте раствор перфузата. Для субнормотермной машинной перфузии было использовано решение Steen+, оптимизированное для VCA ^26,27. Использовался один литр раствора на одну матку, а состав подробно описан в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В перфузат добавляют большое количество гидроксида натрия с целью достижения pH около 7,5-7,6. Это значение явно высокое, но необходимое, так как pH будет иметь тенденцию падать по мере циркуляции и насыщения машины кислородом карбогенной смесью (95% кислорода; 5% углекислого газа).
2. Настройте систему перфузионной обработки машины (рис. 1). Проверьте наличие утечек и пузырей при циркуляции перфузата.

2. Посмертное закупка матки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для имитации донорства после сердечной смерти и/или посмертного зародыша, животное должно быть усыплено в соответствии с местными рекомендациями IACUC. Обескровливание следует отдавать предпочтение внутривенному введению пентобарбитала, чтобы избежать токсичности, которая может помешать исследованию.

1. Усыпьте усыпленное животное в положение лежа на спине. Очистите область живота и наложите стерильные простыни.
2. Сделайте средний инфрапупочный разрез 10 см с помощью лезвия #20.
3. Вскрыть подкожную клетчатку и апоневроз с помощью монополярного электрического скальпеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует обратить внимание на то, чтобы не повредить кишечник при вскрытии брюшной полости.
4. Отведите в сторону тонкую кишку с помощью хирургической марли и обнажите матку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анатомия матки используемой модели показана на рисунке 2А.
5. Проделайте то же самое для левой и правой сторон следующим образом:
   1. Определите маточные сосуды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маточная вена расположена латерально к маточной артерии (Рисунок 3).
   2. Создайте отверстие в широкой связке латерально к маточной вене с помощью щипцов под прямым углом.
   3. Через это отверстие вставьте 2-0 швов шелковой галстука, чтобы перевязать сосуды яичников и освободить матку от окружающей соединительной ткани в широкой связке с помощью прижигания.
   4. Перевязать маточно-яичниковые сосуды шелковой завязкой 2-0 швов и удалить яичник и трубу.
   5. Скелетизируйте маточные сосуды и разделите их как можно ближе к внутренним подвздошным сосудам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо обратить внимание на то, чтобы ножка оставалась как можно дольше, чтобы облегчить канюляцию и предусмотреть ретракцию ножки после ее разрыва.
   6. Повторите шаги 2.5.1-2.5.5 с противоположной стороны.
6. Удалите матку, разрезав шейку матки монополярным электрическим скальпелем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте длительное время контакта, чтобы обеспечить надлежащую коагуляцию сосудов шейки матки, предотвращая утечку во время перфузии.

3. Подготовка к перфузии

1. На приставном столике расширьте обе маточные артерии с помощью микрохирургического расширителя и вставьте ангиокатетер. Закрепите канюляцию шелковыми завязками 3-0 (Рисунок 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для всех артерий был использован ангиокатетер 18 G. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не вводить катетер слишком далеко, чтобы избежать селективной канюляции, так как бифуркация относительно близка. Маточные вены не канюлируются, так как венозный отток достаточен для поддержания просвета этих сосудов открытым, что позволяет легко собирать. Помимо экономии времени, травматическая канюляция может привести к повреждению сосудов и потенциально повлиять на венозный отток.
2. Медленно вручную промывайте обе маточные артерии 20 мл раствора гепарина с каждой стороны, пока все сосуды не будут промыты и оттоки не станут чистыми.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует обращать внимание на то, чтобы не проводить промывание под высоким давлением, что может привести к микрососудистым повреждениям и недостаточности перфузии.
3. Взвесьте матку.

4. Субнормотермная машинная перфузия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для матки требуются две независимые системы аппаратной перфузии. Каждая маточная артерия подключена к перфузионной системе, состоящей из роликового насоса, оксигенатора, пузырьковой ловушки и датчика давления. Перфузат в резервуаре циркулирует по силиконовым трубкам, соединенным с перечисленными выше элементами, прежде чем пройти через орган через маточную артерию к маточной вене с каждой стороны, откуда перфузат выходит и высвобождается в том же резервуаре.

1. Подключите матку к аппаратным перфузионным системам, подключив канюли маточных артерий к входной трубке (рисунок 1).
2. С помощью роликового насоса отрегулируйте расход до низкого уровня (2,5-4,0 мл/мин) для поддержания постоянного артериального давления в пределах 25-35 мм рт.ст.
3. Оцените параметры жизнеспособности в каждый заданный момент времени как на входе, так и на оттоке с помощью шприца объемом 1 мл и анализируйте образцы с помощью аппарата для системы обработки газов крови [например, показатели газов крови (pH, pCO2, pO₂, лактат, избыток оснований, бикарбонат), глюкозы, натрия, калия, кальция, хлорида].
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе перфузия длится 4 часа, а образцы из притока и оттока отбираются каждые 30 минут.
4. Взвесьте матку по окончании перфузии.

Результаты

Во время перфузии система подключалась к датчику давления, который регистрировал давление во время эксперимента. Первоначально давление регистрировалось для системы, свободной от матки, которое вычиталось из записей давления во время перфузии матки для получения р?...

Обсуждение

Трансплантация матки, которую часто считают частью VCA, быстро развивалась в последние несколько лет. Параллельно с этим в VCA начали изучать машинную перфузию, поскольку она продемонстрировала убедительные доказательства в улучшении сохранения солидных органов. Гипо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Pixie Oxygenation System	Medtronic	BBP241	Oxygenator
Bovin serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647	Perfusate component
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506	Perfusate component
Carbon Dioxide Oxygen	Airgas	UN3156	Carbon Dioxide Oxygen mix gas
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	49159	Perfusate component
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusate component
Dextran	Thermo scientific	406271000	Perfusate component
Heparin sodium injection	Eugia Pharma	63739-953-25	Perfusate component
Humulin Regular Insulin human	Lilly	0002-8215-01	Perfusate component
Hydrocortisone sodium succinate	Pfizer	0009-0011-03	Perfusate component
Magnesium chloride hexa-hydrate	Sigma-Aldrich	M9272	Perfusate component
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	Roller pump
Polyethylene glycol 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	Perfusate component
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Perfusate component
Pressure Monitor, Portable, PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	Pressure sensor
Radnoti Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149	Bubble trap
RAPIDPoint500	Siemens	500	Blood Gas System
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Perfusate component
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Perfusate component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	72068	Perfusate component
Sodium phosphate monobasique dihydrate	Sigma-Aldrich	71505	Perfusate component
Syringe 1 mL	BD	309659	Sample procurement
Vancomycine hydrochloride	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	Perfusate component