Estabelecendo um modelo suíno para estudar a preservação dinâmica e o transplante do útero

Resumo

Descreve-se um modelo detalhado e reprodutível de útero suíno, desde a captação cirúrgica até o início da perfusão por máquina, permitindo o estudo da preservação do útero no transplante.

Resumo

Até o momento, o transplante de útero é a única opção para mulheres com infertilidade uterina absoluta, como aquelas com síndrome de Rokitansky, experimentarem a gravidez e darem à luz. Apesar do crescente interesse no transplante uterino nos últimos anos, várias questões ainda carecem de mais pesquisas, incluindo a lesão de isquemia-reperfusão e seu impacto na qualidade e rejeição do enxerto. A literatura recente destacou uma taxa de complicações trombóticas de até 20% após o transplante uterino. Esse tipo de complicação pode resultar de danos às células endoteliais induzidos por hipóxia, muitas vezes levando à rejeição do enxerto uterino. A hipóxia é induzida durante o armazenamento estático a frio, que continua sendo o padrão-ouro para a preservação do enxerto no transplante de órgãos sólidos. Recentemente, a preservação dinâmica usando perfusão mecânica demonstrou melhorar o armazenamento a longo prazo de órgãos convencionais e marginais, reduzindo a lesão isquêmica e hipóxica. Neste protocolo, pretendemos descrever todas as etapas cirúrgicas envolvidas na captação e preservação dinâmica do útero suíno, com base em ambos os pedículos uterinos, para permitir a conexão e o início do protocolo de perfusão por máquina.

Introdução

O transplante de útero (UTx) desenvolveu-se significativamente nos últimos dez anos, com várias equipes iniciando programas de pesquisa clínica. Até o momento, a principal indicação de UTx é a infertilidade uterina absoluta devido à agenesia uterina, incluindo a síndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH). A síndrome de MRKH é uma doença congênita com prevalência de um em cada 5.000 nascidos vivos do sexo feminino¹. A UTx poderia potencialmente abordar causas adicionais de infertilidade, incluindo aquelas resultantes de histerectomia devido a doença maligna, hemorragia pós-parto, miomas uterinos, sequelas infecciosas e várias malformações congênitas. Isso sugere que aproximadamente 1 em cada 500 mulheres pode ser elegível para UTx.

A primeira UTx clínica ocorreu em 2000 na Arábia Saudita², mas complicações vasculares levaram a uma histerectomia três meses depois. Desde então, vários casos de UTx foram realizados, com base em doadores vivos e falecidos, resultando em mais de 80 nascidos vivos ^3,4. Semelhante ao domínio do transplante de órgãos sólidos e alotransplantes compostos vascularizados (VCA), a rejeição imune é um desafio significativo no UTx. ⁵ Vários fatores podem levar à rejeição do enxerto, incluindo insuficiência microcirculatória e estase venosa, ambos os quais podem levar a complicações trombóticas. Em uma revisão recente que estudou a vascularização uterina no transplante, Kristek e col. relataram até 15% de trombose arterial e 5% de trombose venosa⁶. Além disso, a isquemia fria e quente são fatores críticos que devem ser abordados para o sucesso do transplante, pois a lesão de isquemia-reperfusão (IRI) pode levar à disfunção do enxerto e rejeição aguda ^7,8. Os miócitos respondem ao estresse isquêmico produzindo lactato por até 6 h⁹, após o qual o dano às células musculares é irreversível. O impacto da isquemia fria no miométrio foi documentado em estudos clínicos, e o uso de solução intracelular da Universidade de Wisconsin durante o armazenamento estático a frio (SCS) demonstrou melhorar a preservação com melhor resposta contrátil à prostaglandina e maiores concentrações de ATP quando comparado à solução de acetato de Ringer¹⁰. No entanto, o impacto da isquemia quente e fria permanece pouco explorado na UTx.

O SCS continua sendo o padrão-ouro para a preservação da VCA, incluindo o útero, e para a maioria dos transplantes de órgãos sólidos. No entanto, nos últimos anos, avanços significativos em sistemas de perfusão de máquinas e soluções de preservação levaram a uma mudança de paradigma. Atualmente, existem fortes evidências de que a perfusão dinâmica da máquina pode melhorar e prolongar a preservação de órgãos sólidos saudáveis e marginais 11,12,13,14,15. Essa técnica é comumente utilizada na prática clínica para transplante de pulmão, coração, fígado e rim 14,16,17,18. A preservação dinâmica de órgãos demonstrou múltiplos benefícios, incluindo a minimização de lesões por isquemia fria e hipóxia, fornecendo suprimento contínuo de oxigênio e nutrientes, eliminando metabólitos tóxicos e melhorando a qualidade do enxerto e os parâmetros de viabilidade^12,19. Múltiplas modalidades foram desenvolvidas, variando de perfusão hipotérmica a normotérmica por máquina (com ou sem carreadores de oxigênio), com vários perfusados disponíveis, mas apenas alguns foram testados no útero²⁰. Para garantir a contribuição substancial de tais perspectivas de pesquisa, modelos cirúrgicos pré-clínicos relevantes são de importância crucial.

Neste trabalho, a perfusão subnormotérmica por máquina (SNMP) é utilizada como método de preservação dinâmica oxigenada de órgãos à temperatura ambiente (em torno de 20 °C) por meio da circulação de um perfusato através de uma bomba de rolos e um oxigenador. É empregado um modelo suíno que é relevante para estudos sobre UTx e preservação devido às suas semelhanças com o sistema reprodutor humano em termos de anatomia, fisiologia e tamanho do vaso^21,22. O útero é obtido após a morte circulatória, proporcionando relevância para a doação após a morte cardíaca e sugerindo a possibilidade de um atraso na captação após todos os outros órgãos sólidos relevantes^23,24. Além disso, esse modelo facilita o desenvolvimento de estudos de preservação do útero dentro de laboratórios de transplante estabelecidos com foco em outros órgãos, aplicando os princípios dos "3Rs"²⁵. O objetivo é estabelecer um novo modelo de preservação baseado em pedículos uterinos e avaliar sua confiabilidade para preservação dinâmica. Todas as etapas do procedimento são detalhadas, desde a histerectomia até a preservação, englobando os pontos-chave destacados no uso do SNMP.

O protocolo descrito abaixo precedeu um experimento preliminar baseado em uma única bomba e um sistema de influxo "Y-tubing" para ambas as artérias uterinas (Figura Suplementar 1). Após 4 h-SNMP, o órgão ganhou mais de 50% de seu peso inicial. Fluxo, pressão, resistência e variação de peso são mostrados na Figura Suplementar 2. Um único sistema de perfusão separado em dois influxos não permitiu a modulação de cada vazão para a pressão de cada lado. Nesse caso, o SNMP levou a edema substancial em metade do órgão (Figura 3 suplementar). Este sistema mostrou-se inadequado para o modelo uterino, em parte porque não deveria ser considerado um modelo perfeitamente simétrico. Portanto, dois sistemas de perfusão por máquina foram utilizados neste protocolo, um para cada artéria uterina.

Protocolo

Todos os animais receberam cuidados humanitários seguindo o Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts (IACUC). No geral, 6 miniporcas fêmeas de Yucatán pesando 30-40 kg foram usadas para a obtenção do útero, com quatro úteros submetidos ao SNMP. Todos os animais foram heparinizados com uma dose completa (100 UI/kg) antes da eutanásia. A captação de órgãos ocorreu post-mortem com menos de 60 min de isquemia quente. Outros órgãos poderiam ter sido colhidos do mesmo doador para diferentes estudos, de acordo com os princípios dos "3Rs"²⁵. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os reagentes e equipamentos usados no protocolo.

1. Preparo pré-operatório (dia anterior à cirurgia)

1. Prepare a solução de perfusato. Para a perfusão subnormotérmica da máquina, foi utilizada uma solução Steen+ otimizada para VCA ^26,27. Utilizou-se um litro de solução por útero, cuja composição está detalhada na Tabela 1.
   NOTA: Uma grande quantidade de hidróxido de sódio é adicionada ao perfusato com o objetivo de atingir um pH de cerca de 7,5-7,6. Este valor é expressamente alto, mas necessário, pois o pH tenderá a cair à medida que a máquina é circulada e oxigenada com uma mistura de carboidratos (95% de oxigênio; 5% de dióxido de carbono).
2. Configure o sistema de perfusão da máquina (Figura 1). Verifique se há vazamentos e bolhas quando o perfusato estiver circulando.

2. Colheita de útero post mortem

NOTA: Para simular a doação após morte cardíaca e/ou aquisição post-mortem, o animal deve ser sacrificado de acordo com as diretrizes locais da IACUC. A exsanguinação deve ser preferida à injeção intravenosa de pentobarbital para evitar toxicidade que possa interferir no estudo.

1. Coloque o animal sacrificado em decúbito dorsal. Esfregue a área abdominal e coloque cortinas estéreis.
2. Faça uma incisão infraumbilical mediana de 10 cm com uma lâmina # 20.
3. Abra o tecido subcutâneo e a aponeurose com um bisturi elétrico monopolar.
   NOTA: Deve-se prestar atenção para não danificar os intestinos abrindo a cavidade abdominal.
4. Separe o intestino delgado com uma gaze cirúrgica e exponha o útero.
   NOTA: A anatomia uterina do modelo utilizado é mostrada na Figura 2A.
5. Proceda da mesma forma para os lados esquerdo e direito da seguinte forma:
   1. Identifique os vasos uterinos.
      NOTA: A veia uterina está posicionada lateralmente à artéria uterina (Figura 3).
   2. Crie uma abertura no ligamento largo lateralmente à veia uterina com uma pinça em ângulo reto.
   3. Através desta abertura, insira suturas de gravata de seda 2-0 para ligar os vasos ovarianos e liberar o útero do tecido conjuntivo circundante no ligamento largo usando cauterização.
   4. Ligue os vasos útero-ovarianos com suturas de gravata de seda 2-0 e remova o ovário e a trompa.
   5. Esqueletize os vasos uterinos e divida-os o mais próximo possível dos vasos ilíacos internos.
      NOTA: Deve-se prestar atenção para manter o pedículo o maior tempo possível para facilitar a canulação e antecipar a retração do pedículo após o corte.
   6. Repita as etapas 2.5.1-2.5.5 no lado oposto.
6. Remova o útero cortando o colo do útero com um bisturi elétrico monopolar.
   NOTA: Use um longo tempo de contato para garantir a coagulação adequada dos vasos do colo do útero, evitando vazamentos durante a perfusão.

3. Preparação para perfusão

1. Em uma mesa lateral, dilate ambas as artérias uterinas usando um dilatador microcirúrgico e insira um angiocateter. Prenda a canulação com laços de seda 3-0 (Figura 2B).
   NOTA: Aqui, um angiocateter 18 G foi usado para todas as artérias. Deve-se tomar cuidado para não inserir o cateter muito longe para evitar a canulação seletiva, pois a bifurcação é relativamente próxima. As veias uterinas não são canuladas, pois o fluxo venoso é suficiente para manter o lúmen desses vasos aberto, permitindo fácil coleta. Além de economizar tempo, a canulação traumática pode levar a danos vasculares e potencialmente afetar o fluxo venoso.
2. Lave lentamente as duas artérias uterinas com 20 mL de solução de heparina de cada lado até que todos os vasos sejam lavados e as saídas estejam limpas.
   NOTA: Deve-se prestar atenção para não lavar com alta pressão, o que pode levar a lesões microvasculares e falha de perfusão.
3. Pese o útero.

4. Perfusão subnormotérmica da máquina

NOTA: Para o útero, são necessários dois sistemas independentes de perfusão por máquina. Cada artéria uterina é conectada a um sistema de perfusão composto por uma bomba de rolo, um oxigenador, uma armadilha de bolhas e um sensor de pressão. O perfusato em um reservatório circula através de tubos de silicone conectados aos elementos listados acima antes de percorrer o órgão através da artéria uterina até a veia uterina de cada lado, onde o perfusato sai e é liberado no mesmo reservatório.

1. Conecte o útero aos sistemas de perfusão da máquina conectando as cânulas da artéria uterina ao tubo de entrada (Figura 1).
2. Usando a bomba de rolo, ajuste a vazão para baixa (2.5-4.0 mL/min) para manter uma pressão arterial constante entre 25-35 mmHg.
3. Avalie os parâmetros de viabilidade em cada ponto de tempo predefinido no fluxo de entrada e saída usando uma seringa de 1 mL e analisando amostras com a máquina do sistema de gases sanguíneos [por exemplo, métricas de gases sanguíneos (pH, pCO₂, pO₂, lactato, excesso de bases, bicarbonato), glicose, sódio, potássio, cálcio, cloreto].
   NOTA: Neste protocolo, a perfusão dura 4 h, e amostras da entrada e da saída são coletadas a cada 30 min.
4. Pese o útero no final da perfusão.

Resultados

Durante a perfusão, o sistema foi conectado a um sensor de pressão que registrou a pressão durante o experimento. A pressão foi inicialmente registrada para um sistema livre de útero, que foi subtraído dos registros de pressão durante a perfusão uterina para obter a pressão real do órgão. A vazão foi adaptada para manter a pressão dentro da faixa desejada e foi controlada pela bomba de rolo. A resistência foi calculada pela fórmula R = P / Q (R: resistência (mmHg.mL.min-1...

Discussão

O transplante de útero, muitas vezes considerado parte da ACV, desenvolveu-se rapidamente nos últimos anos. Paralelamente, a perfusão de máquina começou a ser explorada na ACV, uma vez que demonstrou evidências robustas na melhoria da preservação de órgãos sólidos. A perfusão mecânica hipotérmica e subnormotérmica permitiu a preservação por até 24 h em modelos suínos de ACV miocutânea e óssea 26,27,28.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Pixie Oxygenation System	Medtronic	BBP241	Oxygenator
Bovin serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647	Perfusate component
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506	Perfusate component
Carbon Dioxide Oxygen	Airgas	UN3156	Carbon Dioxide Oxygen mix gas
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	49159	Perfusate component
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusate component
Dextran	Thermo scientific	406271000	Perfusate component
Heparin sodium injection	Eugia Pharma	63739-953-25	Perfusate component
Humulin Regular Insulin human	Lilly	0002-8215-01	Perfusate component
Hydrocortisone sodium succinate	Pfizer	0009-0011-03	Perfusate component
Magnesium chloride hexa-hydrate	Sigma-Aldrich	M9272	Perfusate component
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	Roller pump
Polyethylene glycol 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	Perfusate component
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Perfusate component
Pressure Monitor, Portable, PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	Pressure sensor
Radnoti Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149	Bubble trap
RAPIDPoint500	Siemens	500	Blood Gas System
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Perfusate component
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Perfusate component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	72068	Perfusate component
Sodium phosphate monobasique dihydrate	Sigma-Aldrich	71505	Perfusate component
Syringe 1 mL	BD	309659	Sample procurement
Vancomycine hydrochloride	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	Perfusate component