자궁 동적 보존 및 이식을 연구하기 위한 돼지 모델 구축

요약

외과적 조달에서 기계 관류 시작에 이르기까지 상세하고 재현 가능한 돼지 자궁 모델을 설명하여 이식 시 자궁 보존에 대한 연구를 가능하게 합니다.

초록

현재까지 자궁 이식은 로키탄스키 증후군과 같은 절대 자궁 불임을 앓고 있는 여성이 임신을 경험하고 출산할 수 있는 유일한 옵션입니다. 최근 몇 년 동안 자궁 이식에 대한 관심이 높아지고 있음에도 불구하고, 허혈-재관류 손상과 이식편의 품질 및 거부 반응에 미치는 영향을 포함하여 몇 가지 문제는 여전히 추가 연구가 필요합니다. 최근 문헌에 따르면 자궁 이식 후 혈전성 합병증 발생률이 최대 20%에 이른다고 합니다. 이러한 유형의 합병증은 저산소증으로 인한 내피 세포 손상으로 인해 발생할 수 있으며, 종종 자궁 이식 거부 반응으로 이어질 수 있습니다. 저산소증은 정적 냉장 보관 중에 유발되며, 이는 고형 장기 이식에서 이식편 보존의 황금 표준으로 남아 있습니다. 최근에는 기계 관류를 이용한 동적 보존이 허혈성 및 저산소성 손상을 줄여 기존 장기와 가장자리 장기의 장기 보관을 개선하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜에서는 기계 관류 프로토콜의 연결 및 시작을 가능하게 하기 위해 양쪽 자궁 척추경을 기반으로 돼지 자궁 조달 및 동적 보존과 관련된 모든 수술 단계를 설명하는 것을 목표로 합니다.

서문

자궁 이식(UTx)은 지난 10년 동안 크게 발전했으며, 여러 팀이 임상 연구 프로그램을 시작했습니다. 현재까지 UTx의 주요 징후는 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) 증후군을 포함한 자궁 무력증으로 인한 절대 자궁 불임입니다. MRKH 증후군은 여성 5,000명 중 1명꼴로 유병률이 높은 선천성 질환이다¹. UTx는 악성 질환으로 인한 자궁 절제술, 산후 출혈, 자궁 근종, 감염성 후유증 및 다양한 선천적 기형으로 인한 불임의 추가 원인을 잠재적으로 해결할 수 있습니다. 이는 약 500명 중 1명의 여성이 UTx를 받을 자격이 있음을 시사합니다.

최초의 임상 UTx는 2000년 사우디아라비아에서 발생^{했으나 2}, 혈관 합병증으로 인해 3개월 후 자궁절제술을 받았다. 그 이후로, 살아있는 기증자와 사망한 기증자를 기반으로 여러 UTx 사례가 수행되어 80명 이상의 생존 출산이 이루어졌습니다 ^3,4. 고형 장기 이식 및 혈관 복합 동종 이식(VCA)의 영역과 유사하게, 면역 거부 반응은 UTx에서 중요한 과제입니다. ⁵ 미세순환 부전(microcirculatory failure)과 정맥 정체(venous stasis)를 포함한 여러 요인이 이식 거부 반응을 유발할 수 있으며, 둘 다 혈전성 합병증을 유발할 수 있습니다. 이식 시 자궁 혈관형성을 연구한 최근 문헌고찰에서, Kristek 등은 최대 15%의 동맥 혈전증과 5%의 정맥 혈전증을 보고했다⁶. 또한, 허혈-재관류 손상(IRI)은 이식 기능 장애와 급성 거부 반응을 유발할 수 있으므로 추위허혈과 온난성 허혈은 성공적인 이식을 위해 반드시 해결해야 하는 중요한 요인입니다 ^7,8. 근세포는 최대 6시간⁹분 동안 젖산을 생성하여 허혈성 스트레스에 반응하며, 그 후에는 근육 세포 손상이 돌이킬 수 없습니다. 저온 허혈이 근막에 미치는 영향은 임상 연구에서 문서화되었으며, 정적 냉장 보관(SCS) 중 세포 내 유사 위스콘신 대학 용액을 사용하면 Ringer의 아세테이트 용액과 비교할 때 프로스타글란딘에 대한 더 나은 수축 반응과 더 높은 ATP 농도로 보존이 개선되는 것으로 나타났습니다¹⁰. 그러나 따뜻한 허혈과 차가운 허혈의 영향은 UTx에서 잘 조사되지 않았습니다.

SCS는 자궁을 포함한 VCA 보존과 대부분의 고형 장기 이식에 대한 황금 표준으로 남아 있습니다. 그러나 최근 몇 년 동안 기계 관류 시스템과 보존 솔루션의 상당한 발전으로 패러다임의 전환이 이루어졌습니다. 동적 기계 관류가 건강하고 가장자리가 있는 고형 기관의 보존을 개선하고 연장할 수 있다는 것을 뒷받침하는 강력한 증거가 있습니다 11,12,13,14,15. 이 기술은 현재 폐, 심장, 간 및 신장 이식을 위한 임상 실습에서 일반적으로 사용됩니다 14,16,17,18. 동적 장기 보존은 지속적인 산소 및 영양분 공급을 통해 한강 허혈 및 저산소증 손상을 최소화하고, 독성 대사 산물을 제거하며, 이식편의 품질 및 생존 매개변수를 개선하는 등 여러 가지 이점을 입증했습니다^12,19. 저체온에서 정상온열 기계 관류(산소 운반체 유무에 관계없이)에 이르기까지 여러 가지 관류요법이 개발되었으며, 몇 가지 관류물을 사용할 수 있지만 자궁에서 테스트된 것은 소수에 불과합니다²⁰. 이러한 연구 관점의 실질적인 기여를 보장하기 위해서는 관련 전임상 수술 모델이 매우 중요합니다.

이 연구에서는 SNMP(Subnormothermic Machine Perfusion)를 롤러 펌프와 산소 공급기를 통해 관류액을 순환시켜 실온(약 20°C)에서 산소화 동적 장기 보존 방법으로 사용합니다. 돼지 모델은 해부학, 생리학 및 혈관 크기 측면에서 인간 생식 기관과의 유사성으로 인해 UTx 및 보존에 대한 연구와 관련이 있는 사용된다^21,22. 자궁은 순환계 폐사 후 조달되며, 이는 심장사 후 기증에 대한 관련성을 제공하고 다른 모든 관련 고형 장기 이후에 조달이 지연될 가능성을 시사합니다^23,24. 또한, 이 모델은 "3Rs" 원칙²⁵을 적용하여 다른 장기에 초점을 맞춘 기존 이식 실험실 내에서 자궁 보존 연구의 개발을 촉진합니다. 목표는 자궁 경추를 기반으로 한 새로운 보존 모델을 확립하고 동적 보존에 대한 신뢰성을 평가하는 것입니다. 자궁절제술부터 보존에 이르기까지 모든 시술 단계가 상세히 설명되어 있으며, SNMP 사용에 대한 강조된 요점을 포함하고 있습니다.

아래에 설명된 프로토콜은 양쪽 자궁 동맥에 대한 단일 펌프와 "Y-튜브" 유입 시스템을 기반으로 하는 예비 실험에 선행했습니다(보충 그림 1). 4 h-SNMP 후, 장기는 초기 체중의 50% 이상을 증가시켰다. 유량, 압력, 저항 및 중량 변화는 보충 그림 2에 나와 있습니다. 두 개의 유입으로 분리된 단일 관류 시스템은 각 측면의 압력에 대한 각 유량의 조절을 허용하지 않았습니다. 이 경우, SNMP는 장기의 절반에서 상당한 부종을 일으켰습니다(보충 그림 3). 이 체계는 자궁 모델에 적합하지 않은 것으로 판명되었는데, 부분적으로는 완벽하게 대칭적인 모델로 간주되어서는 안 되기 때문이었다. 따라서 이 프로토콜에는 각 자궁 동맥에 하나씩 두 개의 기계 관류 시스템이 사용되었습니다.

프로토콜

모든 동물은 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 인도적인 치료를 받았으며, 프로토콜은 매사추세츠 종합병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 전체적으로 체중이 30-40kg인 6마리의 암컷 유카탄 미니피그가 자궁 조달에 사용되었으며, 4마리의 자궁은 SNMP를 받았습니다. 모든 동물은 안락사 전에 1회 전체 용량(100IU/kg)으로 헤파린화되었습니다. 장기 적출은 60분 미만의 따뜻한 허혈과 함께 사후 이루어졌습니다. 다른 장기는 "3Rs" 원칙²⁵에 따라 다른 연구를 위해 동일한 기증자로부터 적출되었을 수 있다. 프로토콜에 사용된 모든 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 수술 전 준비(수술 전날)

1. 관류액 용액을 준비합니다. 비정상 보온 기계 관류의 경우 VCA에 최적화된 Steen+ 솔루션이 사용되었습니다^26,27. 자궁당 1리터의 용액을 사용하였으며, 조성물은 표 1에 상세히 기술되어 있다.
   참고 : 약 7.5-7.6의 pH를 달성하기 위해 다량의 수산화 나트륨을 관류 액에 첨가합니다. 이 값은 명백히 높지만 기계가 탄수화물 혼합물(95% 산소, 5% 이산화탄소)로 순환되고 산소화됨에 따라 pH가 떨어지는 경향이 있으므로 필요합니다.
2. 기계 관류 시스템을 설정합니다(그림 1). 관류액이 순환될 때 누출 및 기포가 있는지 확인하십시오.

2. 사후 자궁 조달

참고: 심장사 및/또는 사후 조달 후 기증을 시뮬레이션하려면 동물을 현지 IACUC 지침에 따라 안락사시켜야 합니다. 연구를 방해할 수 있는 독성을 피하기 위해 펜토바르비탈 정맥 주사보다 출혈이 선호되어야 합니다.

1. 안락사된 동물을 누운 자세로 눕힙니다. 복부를 문지르고 멸균 커튼을 놓습니다.
2. #10 블레이드로 20cm 중앙 하부 배꼽 절개를 만듭니다.
3. 단극 전기 메스로 피하 조직과 건막증을 엽니다.
   알림: 복강을 열어 장을 손상시키지 않도록 주의해야 합니다.
4. 수술용 거즈로 소장을 정리하고 자궁을 드러냅니다.
   참고: 사용된 모델의 자궁 해부학적 구조는 그림 2A에 나와 있습니다.
5. 왼쪽과 오른쪽에 대해서도 다음과 같이 유사하게 진행합니다.
   1. 자궁 혈관을 확인합니다.
      참고: 자궁 정맥은 자궁 동맥 옆으로 위치합니다(그림 3).
   2. 직각 집게로 자궁 정맥 측면으로 넓은 인대에 구멍을 만듭니다.
   3. 이 구멍을 통해 2-0 실크 넥타이 봉합사를 삽입하여 난소관을 결찰하고 소작을 사용하여 넓은 인대의 주변 결합 조직에서 자궁을 방출합니다.
   4. 자궁-난소 혈관을 2-0 실크 타이 봉합사로 접합하고 난소와 난관을 제거합니다.
   5. 자궁 혈관을 골격화하고 가능한 한 내부 장골 혈관에 가깝게 분열합니다.
      참고: 캐뉼레이션을 용이하게 하고 절단된 후 척추경 후퇴를 예상하기 위해 척추경을 가능한 한 오래 유지하는 데 주의를 기울여야 합니다.
   6. 반대쪽에서 2.5.1-2.5.5 단계를 반복합니다.
6. 단극 전기 메스로 자궁 경부를 절단하여 자궁을 제거합니다.
   참고: 적절한 자궁경부 혈관 응고를 보장하기 위해 긴 접촉 시간을 사용하여 관류 중 누출을 방지하십시오.

3. 관류 준비

1. 사이드 테이블에서 미세수술 확장기를 사용하여 양쪽 자궁 동맥을 확장하고 혈관 카테터를 삽입합니다. 3-0 실크 넥타이로 캐뉼레이션을 고정합니다(그림 2B).
   참고: 여기에서 모든 동맥에 18G 혈관 카테터가 사용되었습니다. 분기가 비교적 가깝기 때문에 선택적 도관을 피하기 위해 카테터를 너무 멀리 삽입하지 않도록 주의해야 합니다. 자궁 정맥은 캐뉼레이션이 없는데, 정맥 유출이 이 혈관의 내강을 열어 두기에 충분하여 쉽게 채취할 수 있기 때문입니다. 시간을 절약하는 것 외에도 외상성 삽관은 혈관 손상을 유발할 수 있으며 잠재적으로 정맥 흐름에 영향을 미칠 수 있습니다.
2. 모든 혈관이 씻겨 나가고 유출이 깨끗해질 때까지 양쪽 측면에 20mL의 헤파린 용액을 넣고 양쪽 자궁 동맥을 천천히 수동으로 세척합니다.
   알림: 미세혈관 손상 및 관류 실패로 이어질 수 있는 고압으로 세척되지 않도록 주의해야 합니다.
3. 자궁의 무게를 잰다.

4. 비정상온열 기계 관류

참고: 자궁의 경우 두 개의 독립적인 기계 관류 시스템이 필요합니다. 각 자궁동맥은 롤러 펌프, 산소공급기, 버블 트랩, 압력 센서로 구성된 관류 시스템에 연결되어 있습니다. 저장고의 관류물은 자궁 동맥을 통해 장기를 통해 양쪽의 자궁 정맥으로 흐르기 전에 위에 나열된 원소에 연결된 실리콘 튜브를 통해 순환하며, 여기서 관류액은 동일한 저장소에서 나와 방출됩니다.

1. 자궁 동맥 캐뉼라를 유입 튜브에 연결하여 자궁을 기계 관류 시스템에 연결합니다(그림 1).
2. 롤러 펌프를 사용하여 유속을 낮음(2.5-4.0mL/분)으로 조정하여 25-35mmHg 사이의 일정한 동맥압을 유지합니다.
3. 1mL 주사기를 사용하여 유입 및 유출의 사전 정의된 각 시점에서 생존력 매개변수를 평가하고 혈액 가스 시스템 기계[예: 혈액 가스 지표(pH, pCO₂, pO₂, 젖산염, 염기 과잉, 중탄산염), 포도당, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 염화물]로 샘플을 분석합니다.
   참고: 이 프로토콜에서 관류는 4시간 동안 지속되며 유입 및 유출의 샘플은 30분마다 채취됩니다.
4. 관류가 끝날 때 자궁의 무게를 잰다.

결과

관류 중에 시스템은 실험 중 압력을 기록하는 압력 센서에 연결되었습니다. 압력은 처음에 자궁이 없는 시스템에 대해 기록되었으며, 실제 장기 압력을 얻기 위해 자궁 관류 중 압력 기록에서 빼냈습니다. 유량은 원하는 범위 내에서 압력을 유지하도록 조정되었으며 롤러 펌프에 의해 제어되었습니다. 저항은 공식 R = P / Q (R : 저항 (mmHg.mL.min-1); P: 압력(mmHg); Q: 유?...

토론

종종 VCA의 일부로 간주되는 자궁 이식은 지난 몇 년 동안 빠르게 발전했습니다. 이와 병행하여, 기계 관류는 고형 장기 보존을 개선하는 데 강력한 증거를 보여주었기 때문에 VCA에서 탐구되기 시작했습니다. 저체온 및 아 정상 보온 기계 관류는 근 피부 및 뼈 함유 VCA의 돼지 모델에서 최대 24 시간 보존을 허용했습니다^{26 , 27}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Pixie Oxygenation System	Medtronic	BBP241	Oxygenator
Bovin serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647	Perfusate component
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506	Perfusate component
Carbon Dioxide Oxygen	Airgas	UN3156	Carbon Dioxide Oxygen mix gas
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	49159	Perfusate component
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusate component
Dextran	Thermo scientific	406271000	Perfusate component
Heparin sodium injection	Eugia Pharma	63739-953-25	Perfusate component
Humulin Regular Insulin human	Lilly	0002-8215-01	Perfusate component
Hydrocortisone sodium succinate	Pfizer	0009-0011-03	Perfusate component
Magnesium chloride hexa-hydrate	Sigma-Aldrich	M9272	Perfusate component
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	Roller pump
Polyethylene glycol 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	Perfusate component
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Perfusate component
Pressure Monitor, Portable, PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	Pressure sensor
Radnoti Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149	Bubble trap
RAPIDPoint500	Siemens	500	Blood Gas System
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Perfusate component
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Perfusate component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	72068	Perfusate component
Sodium phosphate monobasique dihydrate	Sigma-Aldrich	71505	Perfusate component
Syringe 1 mL	BD	309659	Sample procurement
Vancomycine hydrochloride	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	Perfusate component