子宮の動的保存と移植を研究するためのブタモデルの確立

要約

外科的調達から機械灌流の開始まで、詳細で再現性のある豚の子宮モデルが説明されており、移植における子宮保存の研究が可能になります。

要約

今日まで、子宮移植は、ロキタンスキー症候群の女性など、絶対的な子宮不妊症の女性が妊娠を経験して出産するための唯一の選択肢です。近年、子宮移植への関心が高まっているにもかかわらず、虚血再灌流障害や移植片の品質や拒絶反応への影響など、いくつかの問題が依然としてさらなる研究を必要としています。最近の文献では、子宮移植後の血栓性合併症の発生率が最大 20% であることが強調されています。このタイプの合併症は、低酸素症による内皮細胞の損傷に起因する可能性があり、多くの場合、子宮移植片の拒絶反応につながります。低酸素症は静的な冷蔵中に誘発され、これは依然として固形臓器移植における移植片保存のゴールドスタンダードです。最近、機械灌流を使用した動的保存は、虚血性および低酸素性損傷を減らすことにより、従来の臓器および辺縁臓器の長期保存を改善することが示されています。このプロトコルでは、両方の子宮茎に基づいて、ブタの子宮調達と動的保存に関与するすべての外科的ステップを説明し、機械灌流プロトコルの接続と開始を可能にすることを目指しています。

概要

子宮移植(UTx)は過去10年間で大幅に発展し、いくつかのチームが臨床研究プログラムを開始しました。今日まで、UTxの主な適応症は、Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser(MRKH)症候群を含む子宮無形成による絶対的な子宮不妊症です。MRKH症候群は、女性の出生5,000人に1人が罹患している先天性疾患^です1。UTxは、悪性疾患による子宮摘出術、分娩後出血、子宮筋腫、感染性後遺症、およびさまざまな先天性奇形に起因するものを含む、不妊症のその他の原因に対処できる可能性があります。これは、約500人に1人の女性がUTxの資格がある可能性があることを示唆しています。

史上初の臨床UTxは2000年にサウジアラビアで行われ^{ましたが2、}血管合併症により3か月後に子宮摘出術が行われました。それ以来、生存しているドナーと死亡したドナーの両方に基づいて、UTxのいくつかのケースが行われ、80人以上の出生が行われています^3,4。固形臓器移植や血管新生複合同種移植(VCA)の領域と同様に、UTxでは免疫拒絶反応が大きな課題となっています。⁵ 移植片拒絶反応を引き起こす可能性のあるいくつかの要因には、微小循環不全や静脈うっ血などがあり、どちらも血栓性合併症を引き起こす可能性があります。移植における子宮血管新生を研究した最近のレビューで、Kristek et al. は最大 15% の動脈血栓症と 5% の静脈血栓症を報告しました⁶.さらに、虚血再灌流障害 (IRI) は移植片の機能不全と急性拒絶反応につながる可能性があるため、低温虚血と温性虚血は移植を成功させるために対処しなければならない重要な要素です ^7,8。筋細胞は、最大6時間⁹時間乳酸を生成することにより虚血性ストレスに応答し、その後、筋細胞の損傷は不可逆的になります。低温虚血が子宮筋層に与える影響は臨床研究で文書化されており、静的低温貯蔵 (SCS) 中にウィスコンシン大学の細胞内様溶液を使用すると、プロスタグランジンに対する収縮反応が良く、リンガーの酢酸溶液¹⁰ と比較して、より高い ATP 濃度で保存が改善されることが示されています。しかし、温冷虚血の影響は、UTxでは十分に調査されていません。

SCSは、子宮を含むVCAの保存、およびほとんどの固形臓器移植のゴールドスタンダードであり続けています。しかし、近年、機械灌流システムと保存ソリューションの大幅な進歩により、パラダイムシフトが起こっています。現在、動的機械灌流が健康で辺縁の固形臓器の保存を改善し、延長できることを裏付ける強力な証拠があります11,12,13,14,15。この技術は、現在、肺、心臓、肝臓、および腎臓の移植14,16,17,18の臨床診療で一般的に使用されています。動的臓器保存は、継続的な酸素と栄養素の供給を提供することによる寒冷虚血と低酸素症の損傷を最小限に抑え、有毒な代謝物を除去し、移植片の品質と生存率パラメータを改善するなど、複数の利点を示しました^12,19。低体温から常温性機械灌流(酸素キャリアの有無にかかわらず)に至るまで、複数のモダリティが開発されており、いくつかの灌流剤が利用可能であるが、子宮でテストされたのはごくわずかである²⁰。このような研究の視点の実質的な貢献を確保するためには、関連する前臨床手術モデルが非常に重要です。

この研究では、ローラーポンプと酸素化装置を介して灌流液を循環させることにより、室温(約20°C)で酸素化された動的臓器保存法として、非正常温機械灌流(SNMP)が使用されます。解剖学、生理学、および血管サイズの点でヒトの生殖器系との類似性により、UTxおよび保存に関する研究に関連するブタモデルが採用されている^21,22。子宮は循環器死後に調達され、心臓死後の提供との関連性を提供し、他のすべての関連する固形臓器^23,24の後に調達遅延の可能性を示唆している。さらに、このモデルは、「3R」の原則²⁵を適用して、他の臓器に焦点を当てた確立された移植研究所内での子宮保存研究の開発を促進します。子宮茎に基づく新しい保存モデルを確立し、動的保存のための信頼性を評価することを目的としています。子宮摘出術から保存まで、すべての手順手順が詳細に説明されており、SNMPの使用に関する強調表示された重要なポイントが含まれています。

以下に説明するプロトコルは、単一のポンプと両方の子宮動脈の「Yチューブ」流入システムに基づく予備実験に先行していました(補足図1)。4時間後のSNMPで、臓器は初期重量の50%以上増加しました。流量、圧力、抵抗、および重量の変動を 補足図2に示します。1つの灌流システムを2つの流入に分けると、各流量を各側の圧力に調整することはできませんでした。この場合、SNMPは臓器の半分にかなりの浮腫を引き起こしました(補足図3)。このシステムは、完全に対称的なモデルと見なすべきではないという理由もあり、子宮モデルには適していないことが証明されました。したがって、このプロトコルでは、各子宮動脈に1つずつ、2つの機械灌流システムが使用されました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

すべての動物は、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドに従って人道的なケアを受け、プロトコルはマサチューセッツ総合病院の施設用動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。全体として、体重30〜40 kgの6匹のユカタンの雌のミニブタが子宮調達に使用され、4匹の子宮がSNMPを受けました。すべての動物は、安楽死の前に1回の全用量(100 IU / kg)でヘパリン化されました。.臓器調達は、温性虚血が60分未満で死後に行われました。他の臓器は、「3R」の原則²⁵に従って、異なる研究のために同じドナーから摘出された可能性があります。プロトコールで使用されるすべての試薬と機器の詳細については、 Table of Materials を参照してください。

1. 術前準備(手術前日)

1. 灌流液を準備します。非正常温熱マシン灌流には、VCA用に最適化されたSteen+溶液が使用されました^26,27。子宮当たり1リットルの溶液を使用し、組成を表1に詳述する。
   注:灌流液には、pHが約7.5〜7.6になるように、大量の水酸化ナトリウムを添加します。この値は明示的に高いですが、機械がカルボゲン混合物(95%酸素、5%二酸化炭素)で循環および酸素化されるとpHが低下する傾向があるため、必要です。
2. 機械灌流システムを設定します(図1)。灌流液を循環させると、漏れや気泡がないか確認します。

2. 死後の子宮調達

注:心臓死後および/または死後の調達後の提供をシミュレートするには、動物は地元のIACUCガイドラインに従って安楽死させる必要があります。投与は、研究を妨げる可能性のある毒性を避けるために、静脈内ペントバルビタール注射よりも優先されるべきです。.

1. 安楽死させた動物を仰臥位に置きます。腹部をこすり洗いし、滅菌ドレープを置きます。
2. #20ブレードで10cmの中央下臍下切開を行います。
3. 皮下組織と腱膜を単極電気メスで開きます。
   注:腹腔を開けて腸を傷つけないように注意する必要があります。
4. 手術用ガーゼで小腸を脇に置き、子宮を露出させます。
   注:使用したモデルの子宮の解剖学的構造を 図2Aに示します。
5. 左側と右側についても、次のように同様に進めます。
   1. 子宮血管を特定します。
      注:子宮静脈は子宮動脈に対して横方向に配置されています(図3)。
   2. 直角鉗子を使用して、子宮静脈に対して横方向に広い靭帯に開口部を作ります。
   3. この開口部を通して、2-0シルクタイ縫合糸を挿入して卵巣血管を結紮し、焼灼を使用して広靭帯の周囲の結合組織から子宮を解放します。
   4. 子宮卵巣血管を2-0シルクタイ縫合糸で結紮し、卵巣とチューブを切除します。
   5. 子宮血管をスケルトン化し、それらを内部腸骨血管にできるだけ近づけて分割します。
      注:カニューレ挿入を容易にし、切断後の椎弓根の収縮を予測するために、椎弓根をできるだけ長く保持することに注意を払う必要があります。
   6. 反対側で手順2.5.1〜2.5.5を繰り返します。
6. モノポーラ電気メスで子宮頸部を切開して子宮を摘出します。
   注:接触時間を長くして、子宮頸部血管の適切な凝固を確保し、灌流中の漏れを防ぎます。

3.灌流の準備

1. サイドテーブルで、顕微手術用拡張器を使用して両方の子宮動脈を拡張し、血管カテーテルを挿入します。カニューレを3-0シルクタイで固定します(図2B)。
   注:ここでは、すべての動脈に18Gの血管カテーテルを使用しました。分岐部が比較的近いため、選択的カニューレ挿入を避けるために、カテーテルをあまり挿入しないように注意する必要があります。子宮静脈はカニューレ挿入されておらず、静脈の流出はこれらの血管の内腔を開いたままにするのに十分であり、簡単に収集できます。外傷性カニューレ挿入は、時間を節約するだけでなく、血管の損傷を引き起こし、静脈の流れに影響を与える可能性があります。
2. すべての血管が洗い流され、流出が明確になるまで、両側に20 mLのヘパリン溶液で両方の子宮動脈をゆっくりと手動で洗い流します。
   注:微小血管の損傷や灌流不全につながる可能性のある高圧で洗い流さないように注意する必要があります。
3. 子宮の重さを量ります。

4.サブノーマルサーミックマシン灌流

注:子宮には、2つの独立した機械灌流システムが必要です。各子宮動脈は、ローラーポンプ、酸素供給器、バブルトラップ、および圧力センサーで構成される灌流システムに接続されています。リザーバー内の灌流液は、上記の要素に接続されたシリコンチューブを通って循環し、子宮動脈を介して臓器を通って両側の子宮静脈に流れ込み、そこで灌流液は同じリザーバーに放出されます。

1. 子宮動脈カニューレを流入チューブに接続して、子宮を機械灌流システムに接続します(図1)。
2. ローラーポンプを使用して、流量を低(2.5〜4.0 mL / min)に調整し、動脈圧を25〜35 mmHgの間で一定に保ちます。
3. 1 mL シリンジを使用し、血液ガス システム マシンでサンプルを分析する [血液ガス メトリクス (pH、pCO₂、pO₂、乳酸、塩基過剰、重炭酸塩)、グルコース、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物] を使用して、流入と流出の両方の事前定義された各時点での生存率パラメーターを評価します。
   注:このプロトコルでは、灌流は4時間持続し、流入および流出からのサンプルは30分ごとに採取されます。
4. 灌流の終わりに子宮の重さを量ります。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

灌流中、システムは実験中の圧力を記録する圧力センサーに接続されました。圧力は当初、子宮のないシステムについて記録され、子宮灌流中の圧力記録から差し引かれて、実際の臓器圧が得られました。流量は、圧力を所望の範囲内に維持するように適合され、ローラーポンプによって制御されました。抵抗は、式R = P / Q(R:抵抗(mmHg.mL.min-1)を使用して計算?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

子宮移植は、VCAの一部と見なされることが多く、ここ数年で急速に発展しています。並行して、VCAでは、固形臓器の保存を改善する確固たる証拠が示されたため、機械灌流が検討され始めました。低体温および非正常体温機械灌流により、筋皮膚および骨含有VCA 26,27,28のブタモデルで最大24時間の保存が可能になりました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Pixie Oxygenation System	Medtronic	BBP241	Oxygenator
Bovin serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647	Perfusate component
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506	Perfusate component
Carbon Dioxide Oxygen	Airgas	UN3156	Carbon Dioxide Oxygen mix gas
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	49159	Perfusate component
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusate component
Dextran	Thermo scientific	406271000	Perfusate component
Heparin sodium injection	Eugia Pharma	63739-953-25	Perfusate component
Humulin Regular Insulin human	Lilly	0002-8215-01	Perfusate component
Hydrocortisone sodium succinate	Pfizer	0009-0011-03	Perfusate component
Magnesium chloride hexa-hydrate	Sigma-Aldrich	M9272	Perfusate component
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	Roller pump
Polyethylene glycol 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	Perfusate component
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Perfusate component
Pressure Monitor, Portable, PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	Pressure sensor
Radnoti Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149	Bubble trap
RAPIDPoint500	Siemens	500	Blood Gas System
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Perfusate component
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Perfusate component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	72068	Perfusate component
Sodium phosphate monobasique dihydrate	Sigma-Aldrich	71505	Perfusate component
Syringe 1 mL	BD	309659	Sample procurement
Vancomycine hydrochloride	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	Perfusate component