Etablierung eines Schweinemodells zur Untersuchung der dynamischen Konservierung und Transplantation der Gebärmutter

Zusammenfassung

Es wird ein detailliertes und reproduzierbares Modell der Gebärmutter von Schweinen beschrieben, das von der chirurgischen Beschaffung bis zur Einleitung der maschinellen Perfusion reicht und die Untersuchung der Gebärmuttererhaltung bei der Transplantation ermöglicht.

Zusammenfassung

Bis heute ist die Gebärmuttertransplantation die einzige Möglichkeit für Frauen mit absoluter Gebärmutterunfruchtbarkeit, wie z. B. Frauen mit Rokitansky-Syndrom, eine Schwangerschaft zu erleben und zu gebären. Trotz des wachsenden Interesses an der Gebärmuttertransplantation in den letzten Jahren bedürfen mehrere Themen noch weiterer Forschung, darunter Ischämie-Reperfusionsschäden und ihre Auswirkungen auf die Qualität und Abstoßung des Transplantats. In der neueren Literatur wurde auf eine thrombotische Komplikationsrate von bis zu 20 % nach einer Gebärmuttertransplantation hingewiesen. Diese Art von Komplikation kann aus einer Hypoxie-induzierten Schädigung der Endothelzellen resultieren, die häufig zu einer Abstoßung des Uterustransplantats führt. Hypoxie wird während der statischen Kühllagerung induziert, was nach wie vor der Goldstandard für die Konservierung von Transplantaten bei der Transplantation solider Organe ist. In jüngster Zeit hat sich gezeigt, dass die dynamische Konservierung durch maschinelle Perfusion die Langzeitlagerung konventioneller und marginaler Organe verbessert, indem ischämische und hypoxische Verletzungen reduziert werden. In diesem Protokoll wollen wir jeden chirurgischen Schritt beschreiben, der an der Entnahme und dynamischen Konservierung der Gebärmutter von Schweinen beteiligt ist, basierend auf beiden Uterusstielen, um die Verbindung und Einleitung des maschinellen Perfusionsprotokolls zu ermöglichen.

Einleitung

Die Gebärmuttertransplantation (UTx) hat sich in den letzten zehn Jahren erheblich weiterentwickelt, wobei mehrere Teams klinische Forschungsprogramme gestartet haben. Bisher ist die Hauptindikation von UTx die absolute uterine Unfruchtbarkeit aufgrund einer Agenesie der Gebärmutter, zu der auch das Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser-Syndrom (MRKH) gehört. Das MRKH-Syndrom ist eine angeborene Störung mit einer Prävalenz von einer von 5.000 weiblichen Lebendgeburten¹. UTx könnte möglicherweise weitere Ursachen für Unfruchtbarkeit angehen, einschließlich solcher, die sich aus Hysterektomie aufgrund von bösartigen Erkrankungen, postpartalen Blutungen, Uterusmyomen, infektiösen Folgeerscheinungen und verschiedenen angeborenen Fehlbildungen ergeben. Dies deutet darauf hin, dass etwa 1 von 500 Frauen für UTx in Frage kommt.

Die erste klinische UTx fand im Jahr 2000 in Saudi-Arabien^{auf 2}, aber vaskuläre Komplikationen führten drei Monate später zu einer Hysterektomie. Seitdem wurden mehrere Fälle von UTx durchgeführt, die sowohl auf lebenden als auch auf verstorbenen Spendern basierten, was zu mehr als 80 Lebendgeburten führte ^3,4. Ähnlich wie bei der Transplantation solider Organe und der vaskularisierten Komposit-Allotransplantate (VCA) ist die Immunabstoßung bei UTx eine große Herausforderung. ⁵ Mehrere Faktoren können zu einer Abstoßung des Transplantats führen, darunter Mikrozirkulationsversagen und venöse Stauung, die beide zu thrombotischen Komplikationen führen können. In einer kürzlich erschienenen Übersichtsarbeit zur Untersuchung der Uterusvaskularisation bei der Transplantation berichteten Kristek et al. über bis zu 15 % arterielle Thrombosen und 5 % venöse Thrombosen⁶. Darüber hinaus sind kalte und warme Ischämie kritische Faktoren, die für eine erfolgreiche Transplantation berücksichtigt werden müssen, da Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) zu einer Transplantatdysfunktion und einer akuten Abstoßung führen können ^7,8. Myozyten reagieren auf ischämischen Stress, indem sie bis zu 6 h lang Laktat produzieren⁹, wonach die Schädigung der Muskelzellen irreversibel ist. Die Auswirkungen der kalten Ischämie auf das Myometrium wurden in klinischen Studien dokumentiert, und es wurde gezeigt, dass die Verwendung von intrazellulärer Lösung der University of Wisconsin während der statischen Kühllagerung (SCS) die Konservierung mit einer besseren kontraktilen Reaktion auf Prostaglandin und höheren ATP-Konzentrationen im Vergleich zu Ringer-Acetat-Lösung verbessert¹⁰. Die Auswirkungen von warmer und kalter Ischämie sind bei UTx jedoch noch wenig erforscht.

SCS ist nach wie vor der Goldstandard für die VCA-Konservierung, einschließlich der Gebärmutter, und für die meisten soliden Organtransplantationen. In den letzten Jahren haben jedoch bedeutende Fortschritte bei maschinellen Perfusionssystemen und Konservierungslösungen zu einem Paradigmenwechsel geführt. Es gibt inzwischen starke Beweise dafür, dass die dynamische maschinelle Perfusion die Erhaltung gesunder und marginaler solider Organe verbessern und verlängern kann 11,12,13,14,15. Diese Technik wird heute in der klinischen Praxis häufig für Lungen-, Herz-, Leber- und Nierentransplantationen eingesetzt 14,16,17,18. Die dynamische Organkonservierung zeigte mehrere Vorteile, darunter die Minimierung von Kälteischämie und Hypoxie-Verletzungen durch kontinuierliche Sauerstoff- und Nährstoffversorgung, die Beseitigung toxischer Metaboliten und die Verbesserung der Transplantatqualität und der Lebensfähigkeitsparameter^12,19. Es wurden mehrere Modalitäten entwickelt, die von hypothermer bis hin zu normothermer maschineller Perfusion (mit oder ohne Sauerstoffträger) reichen, wobei mehrere Perfusate zur Verfügung stehen, aber nur wenige wurden an der Gebärmutter getestet²⁰. Um den substanziellen Beitrag solcher Forschungsperspektiven zu gewährleisten, sind relevante präklinische Operationsmodelle von entscheidender Bedeutung.

In dieser Arbeit wird die subnormotherme maschinelle Perfusion (SNMP) als sauerstoffhaltige dynamische Organkonservierungsmethode bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) verwendet, indem ein Perfusat durch eine Rollenpumpe und einen Oxygenator zirkuliert wird. Es wird ein Schweinemodell verwendet, das aufgrund seiner Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Fortpflanzungssystem in Bezug auf Anatomie, Physiologie und Gefäßgröße für Studien zu UTx und Konservierung relevant ist^21,22. Die Beschaffung des Uterus erfolgt nach dem Kreislauftod, was die Relevanz für eine Spende nach dem Herztod erhöht und die Möglichkeit einer Beschaffungsverzögerung nach allen anderen relevanten soliden Organen nahelegt^23,24. Darüber hinaus erleichtert dieses Modell die Entwicklung von Studien zur Erhaltung der Gebärmutter in etablierten Transplantationslaboratorien, die sich auf andere Organe konzentrieren und die "3R"-Prinzipien anwenden²⁵. Ziel ist es, ein neues Konservierungsmodell auf Basis von Uterusstielen zu etablieren und seine Zuverlässigkeit für die dynamische Konservierung zu bewerten. Alle Verfahrensschritte werden detailliert beschrieben, von der Hysterektomie bis zur Konservierung, und umfassen die wichtigsten Punkte zur Verwendung von SNMP.

Dem unten beschriebenen Protokoll ging ein vorläufiges Experiment voraus, das auf einer einzigen Pumpe und einem "Y-Schlauch"-Zuflusssystem für beide Uterusarterien basierte (Ergänzende Abbildung 1). Nach 4 h-SNMP nahm das Organ über 50% seines Ausgangsgewichts zu. Durchfluss, Druck, Widerstand und Gewichtsschwankungen sind in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Ein einzelnes Perfusionssystem, das in zwei Zuflüsse unterteilt war, erlaubte es nicht, jede Durchflussrate an den Druck jeder Seite anzupassen. In diesem Fall führte SNMP zu erheblichen Ödemen in der Hälfte des Organs (Ergänzende Abbildung 3). Dieses System erwies sich als ungeeignet für das Uterusmodell, unter anderem, weil es nicht als perfekt symmetrisches Modell angesehen werden sollte. Daher wurden in diesem Protokoll zwei Systeme der maschinellen Perfusion verwendet, eines für jede Uterusarterie.

Protokoll

Alle Tiere erhielten eine humane Pflege gemäß dem National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, und die Protokolle wurden vom Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Insgesamt wurden 6 weibliche Yucatan-Minischweine mit einem Gewicht von 30-40 kg für die Uterusentnahme verwendet, wobei vier Uterus einer SNMP unterzogen wurden. Alle Tiere wurden vor der Euthanasie mit einer vollen Dosis (100 I.E./kg) heparinisiert. Die Organentnahme erfolgte post mortem mit weniger als 60 Minuten warmer Ischämie. Andere Organe könnten vom selben Spender für verschiedene Studien entnommen worden sein, gemäß den "3R"-Prinzipien²⁵. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Reagenzien und Geräten, die im Protokoll verwendet werden.

1. Präoperative Vorbereitung (Tag vor der Operation)

1. Bereiten Sie die Perfusatlösung vor. Für die subnormotherme Maschinenperfusion wurde eine für VCA optimierte Steen+-Lösung verwendet^26,27. Es wurde ein Liter Lösung pro Gebärmutter verwendet, und die Zusammensetzung ist in Tabelle 1 aufgeführt.
   HINWEIS: Dem Perfusat wird eine große Menge Natriumhydroxid zugesetzt, mit dem Ziel, einen pH-Wert von etwa 7,5 bis 7,6 zu erreichen. Dieser Wert ist ausdrücklich hoch, aber notwendig, da der pH-Wert tendenziell sinkt, wenn die Maschine umgewälzt und mit einem Carbogen-Gemisch (95 % Sauerstoff; 5 % Kohlendioxid) angereichert wird.
2. Richten Sie das Perfusionssystem der Maschine ein (Abbildung 1). Auf Undichtigkeiten und Blasen prüfen, wenn Perfusat zirkuliert.

2. Postmortale Entnahme der Gebärmutter

HINWEIS: Um eine Spende nach dem Herztod und/oder der postmortalen Entnahme zu simulieren, sollte das Tier gemäß den lokalen IACUC-Richtlinien eingeschläfert werden. Die Exsanguination sollte der intravenösen Pentobarbital-Injektion vorgezogen werden, um Toxizitäten zu vermeiden, die die Studie beeinträchtigen könnten.

1. Bringen Sie das eingeschläferte Tier in Rückenlage. Schrubben Sie den Bauchbereich und legen Sie sterile Tücher auf.
2. Machen Sie einen 10 cm langen mittleren Infrarotschnitt mit einer #20-Klinge.
3. Öffnen Sie das Unterhautgewebe und die Aponeurose mit einem monopolaren elektrischen Skalpell.
   HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass der Darm durch das Öffnen der Bauchhöhle nicht beschädigt wird.
4. Legen Sie den Dünndarm mit einer chirurgischen Gaze beiseite und legen Sie die Gebärmutter frei.
   HINWEIS: Die Uterusanatomie des verwendeten Modells ist in Abbildung 2A dargestellt.
5. Gehen Sie für die linke und rechte Seite ähnlich wie folgt vor:
   1. Identifiziere die Gebärmuttergefäße.
      HINWEIS: Die Gebärmuttervene befindet sich seitlich der Gebärmutterarterie (Abbildung 3).
   2. Mit einer rechtwinkligen Pinzette eine Öffnung in das breite Band seitlich zur Gebärmuttervene schaffen.
   3. Durch diese Öffnung führen Sie 2-0 Seidenbinder ein, um die Eierstockgefäße zu ligatisieren und die Gebärmutter mit Hilfe des Kauters vom umgebenden Bindegewebe im breiten Band zu befreien.
   4. Lilizieren Sie die utero-ovariellen Gefäße mit 2-0 Seidenbindernähten und entfernen Sie den Eierstock und die Eileiter.
   5. Skelettieren Sie die Gebärmuttergefäße und teilen Sie sie so nah wie möglich an den inneren Beckengefäßen.
      HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, den Stiel so lange wie möglich zu halten, um die Kanülierung zu erleichtern und eine Pedikelretraktion nach dem Durchtrennen zu antizipieren.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1-2.5.5 auf der gegenüberliegenden Seite.
6. Entfernen Sie die Gebärmutter, indem Sie den Gebärmutterhals mit einem monopolaren elektrischen Skalpell durchschneiden.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine lange Kontaktzeit, um eine ordnungsgemäße Koagulation der Gebärmutterhalsgefäße zu gewährleisten und ein Auslaufen während der Perfusion zu verhindern.

3. Vorbereitung für die Perfusion

1. Auf einem Beistelltisch beide Gebärmutterarterien mit einem mikrochirurgischen Dilatator erweitern und einen Angiokatheter einführen. Sichern Sie die Kanüle mit 3-0 Seidenbindern (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Hier wurde ein 18 G Angiokatheter für alle Arterien verwendet. Es muss darauf geachtet werden, den Katheter nicht zu weit einzuführen, um eine selektive Kanülierung zu vermeiden, da die Bifurkation relativ eng beieinander liegt. Die Gebärmuttervenen werden nicht kanüliert, da der venöse Abfluss ausreicht, um das Lumen dieser Gefäße offen zu halten, was eine einfache Entnahme ermöglicht. Eine traumatische Kanülierung kann nicht nur Zeit sparen, sondern auch zu Gefäßschäden führen und möglicherweise den venösen Fluss beeinträchtigen.
2. Spülen Sie beide Uterusarterien langsam manuell mit 20 ml Heparinlösung auf jeder Seite, bis alle Gefäße ausgewaschen und die Abflüsse klar sind.
   HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Spülung nicht mit hohem Druck erfolgt, da dies zu mikrovaskulären Verletzungen und Perfusionsstörungen führen kann.
3. Wiegen Sie die Gebärmutter.

4. Subnormotherme Maschinenperfusion

HINWEIS: Für die Gebärmutter sind zwei unabhängige Systeme der maschinellen Perfusion erforderlich. Jede Gebärmutterarterie ist mit einem Perfusionssystem verbunden, das aus einer Rollenpumpe, einem Oxygenator, einer Blasenfalle und einem Drucksensor besteht. Das Perfusat in einem Reservoir zirkuliert durch Silikonschläuche, die mit den oben aufgeführten Elementen verbunden sind, bevor es durch das Organ über die Gebärmutterarterie zur Gebärmuttervene auf jeder Seite fließt, wo das Perfusat austritt und in demselben Reservoir freigesetzt wird.

1. Verbinden Sie die Gebärmutter mit den maschinellen Perfusionssystemen, indem Sie die Kanülen der Gebärmutterarterie mit dem Zuflussschlauch verbinden (Abbildung 1).
2. Stellen Sie mit der Rollenpumpe die Durchflussrate auf niedrig (2,5-4,0 ml/min) ein, um einen konstanten arteriellen Druck zwischen 25-35 mmHg zu halten.
3. Bewerten Sie die Viabilitätsparameter zu jedem vordefinierten Zeitpunkt sowohl im Zu- als auch im Abfluss mit einer 1-ml-Spritze und analysieren Sie Proben mit dem Blutgassystemgerät [z. B. Blutgasmetriken (pH, pCO₂, pO₂, Laktat, Basenüberschuss, Bicarbonat), Glukose, Natrium, Kalium, Kalzium, Chlorid].
   HINWEIS: Bei diesem Protokoll dauert die Perfusion 4 Stunden, und alle 30 Minuten werden Proben aus dem Zu- und Abfluss entnommen.
4. Wiegen Sie die Gebärmutter am Ende der Perfusion.

Ergebnisse

Während der Perfusion wurde das System mit einem Drucksensor verbunden, der den Druck während des Experiments aufzeichnete. Für ein gebärmutterfreies System wurde zunächst der Druck aufgezeichnet, der von den Druckaufzeichnungen während der Gebärmutterperfusion abgezogen wurde, um den realen Organdruck zu erhalten. Die Fördermenge wurde angepasst, um den Druck im gewünschten Bereich zu halten und von der Rollenpumpe gesteuert. Der Widerstand wurde mit der Formel R = P / Q berech...

Diskussion

Die Gebärmuttertransplantation, die oft als Teil der VCA angesehen wird, hat sich in den letzten Jahren rasant entwickelt. Parallel dazu wurde die maschinelle Perfusion bei VCA untersucht, da sie robuste Beweise für die Verbesserung der Erhaltung solider Organe zeigte. Hypotherme und subnormotherme maschinelle Perfusion ermöglichte in Schweinemodellen eine Konservierung von myokutanem und knochenhaltigem VCA^{von bis} zu 24 Stunden ^26,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Pixie Oxygenation System	Medtronic	BBP241	Oxygenator
Bovin serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647	Perfusate component
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506	Perfusate component
Carbon Dioxide Oxygen	Airgas	UN3156	Carbon Dioxide Oxygen mix gas
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	49159	Perfusate component
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusate component
Dextran	Thermo scientific	406271000	Perfusate component
Heparin sodium injection	Eugia Pharma	63739-953-25	Perfusate component
Humulin Regular Insulin human	Lilly	0002-8215-01	Perfusate component
Hydrocortisone sodium succinate	Pfizer	0009-0011-03	Perfusate component
Magnesium chloride hexa-hydrate	Sigma-Aldrich	M9272	Perfusate component
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	Roller pump
Polyethylene glycol 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	Perfusate component
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Perfusate component
Pressure Monitor, Portable, PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	Pressure sensor
Radnoti Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149	Bubble trap
RAPIDPoint500	Siemens	500	Blood Gas System
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Perfusate component
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Perfusate component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	72068	Perfusate component
Sodium phosphate monobasique dihydrate	Sigma-Aldrich	71505	Perfusate component
Syringe 1 mL	BD	309659	Sample procurement
Vancomycine hydrochloride	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	Perfusate component