Stabilire un modello suino per studiare la conservazione dinamica dell'utero e il trapianto

Riepilogo

Viene descritto un modello dettagliato e riproducibile di utero suino, dall'approvvigionamento chirurgico all'inizio della perfusione meccanica, consentendo lo studio della conservazione dell'utero nel trapianto.

Abstract

Ad oggi, il trapianto di utero è l'unica opzione per le donne con infertilità uterina assoluta, come quelle con sindrome di Rokitansky, per vivere la gravidanza e partorire. Nonostante il crescente interesse per il trapianto di utero negli ultimi anni, diverse questioni richiedono ancora ulteriori ricerche, tra cui il danno da ischemia-riperfusione e il suo impatto sulla qualità del trapianto e sul rigetto. La letteratura recente ha evidenziato un tasso di complicanze trombotiche fino al 20% dopo il trapianto di utero. Questo tipo di complicanza può derivare da un danno alle cellule endoteliali indotto dall'ipossia, che spesso porta al rigetto del trapianto uterino. L'ipossia viene indotta durante la conservazione a freddo statica, che rimane il gold standard per la conservazione del trapianto nel trapianto di organi solidi. Recentemente, è stato dimostrato che la conservazione dinamica mediante perfusione meccanica migliora la conservazione a lungo termine degli organi convenzionali e marginali riducendo il danno ischemico e ipossico. In questo protocollo, miriamo a descrivere ogni fase chirurgica coinvolta nell'approvvigionamento dell'utero suino e nella conservazione dinamica, sulla base di entrambi i peduncoli uterini, per consentire la connessione e l'avvio del protocollo di perfusione della macchina.

Introduzione

Il trapianto di utero (UTx) si è sviluppato in modo significativo negli ultimi dieci anni, con diversi team che hanno avviato programmi di ricerca clinica. Ad oggi, l'indicazione principale di UTx è l'infertilità uterina assoluta dovuta all'agenesia uterina, inclusa la sindrome di Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH). La sindrome MRKH è una malattia congenita con una prevalenza di una su 5.000 femmine nate vive¹. UTx potrebbe potenzialmente affrontare ulteriori cause di infertilità, comprese quelle derivanti da isterectomia dovuta a malattia maligna, emorragia postpartum, fibromi uterini, sequele infettive e varie malformazioni congenite. Ciò suggerisce che circa 1 donna su 500 potrebbe essere idonea per UTx.

La prima UTx clinica si è verificata nel 2000 in Arabia Saudita², ma le complicanze vascolari hanno portato a un'isterectomia tre mesi dopo. Da allora, sono stati eseguiti diversi casi di UTx, basati sia su donatori viventi che deceduti, con il risultato di oltre 80 nati vivi ^3,4. Analogamente al regno del trapianto di organi solidi e degli allotrapianti compositi vascolarizzati (VCA), il rigetto immunitario è una sfida significativa nell'UTx. ⁵ Diversi fattori possono portare al rigetto del trapianto, tra cui l'insufficienza microcircolatoria e la stasi venosa, che possono portare a complicanze trombotiche. In una recente revisione che studia la vascolarizzazione uterina nei trapianti, Kristek et al. hanno riportato fino al 15% di trombosi arteriosa e fino al 5% di trombosi venosa⁶. Inoltre, l'ischemia fredda e calda sono fattori critici che devono essere affrontati per il successo del trapianto, poiché il danno da ischemia-riperfusione (IRI) può portare a disfunzione del trapianto e rigetto acuto ^7,8. I miociti rispondono allo stress ischemico producendo lattato per un massimo di 6 ore⁹, dopodiché il danno alle cellule muscolari è irreversibile. L'impatto dell'ischemia fredda sul miometrio è stato documentato in studi clinici e l'uso di una soluzione intracellulare dell'Università del Wisconsin durante la conservazione a freddo statica (SCS) ha dimostrato di migliorare la conservazione con una migliore risposta contrattile alle prostaglandine e concentrazioni di ATP più elevate rispetto alla soluzione di acetato¹⁰ di Ringer. Tuttavia, l'impatto dell'ischemia calda e fredda rimane poco esplorato nell'UTx.

L'SCS rimane il gold standard per la conservazione del VCA, compreso l'utero, e per la maggior parte dei trapianti di organi solidi. Tuttavia, negli ultimi anni, i progressi significativi nei sistemi di perfusione delle macchine e nelle soluzioni di conservazione hanno portato a un cambiamento di paradigma. Ci sono ora forti prove a sostegno del fatto che la perfusione meccanica dinamica può migliorare e prolungare la conservazione degli organi solidi sani e marginali 11,12,13,14,15. Questa tecnica è ora comunemente utilizzata nella pratica clinica per il trapianto di polmone, cuore, fegato e rene 14,16,17,18. La conservazione dinamica degli organi ha dimostrato molteplici vantaggi, tra cui la riduzione al minimo delle lesioni da ischemia fredda e ipossia fornendo un apporto continuo di ossigeno e nutrienti, eliminando i metaboliti tossici e migliorando la qualità dell'innesto e i parametri di vitalità^12,19. Sono state sviluppate diverse modalità, che vanno dalla perfusione meccanica ipotermica a quella normotermica (con o senza vettori di ossigeno), con diversi perfusi disponibili, ma solo pochi sono stati testati sull'utero²⁰. Per garantire il contributo sostanziale di tali prospettive di ricerca, i modelli chirurgici preclinici pertinenti sono di cruciale importanza.

In questo lavoro, la perfusione meccanica subnormotermica (SNMP) viene utilizzata come metodo di conservazione dinamica ossigenata degli organi a temperatura ambiente (circa 20 °C) facendo circolare un perfusato attraverso una pompa a rulli e un ossigenatore. Viene utilizzato un modello suino che è rilevante per gli studi sull'UTx e sulla conservazione grazie alle sue somiglianze con il sistema riproduttivo umano in termini di anatomia, fisiologia e dimensioni dei vasi^21,22. L'utero viene prelevato dopo la morte circolatoria, fornendo rilevanza per la donazione dopo la morte cardiaca e suggerendo la possibilità di un ritardo nell'approvvigionamento dopo tutti gli altri organi solidi rilevanti^23,24. Inoltre, questo modello facilita lo sviluppo di studi di conservazione dell'utero all'interno di laboratori di trapianto consolidati che si concentrano su altri organi, applicando i principi delle "3R"²⁵. L'obiettivo è quello di stabilire un nuovo modello di conservazione basato sui peduncoli uterini e valutarne l'affidabilità per la conservazione dinamica. Tutte le fasi della procedura sono dettagliate, dall'isterectomia alla conservazione, comprendendo i punti chiave evidenziati sull'utilizzo di SNMP.

Il protocollo descritto di seguito ha preceduto un esperimento preliminare basato su una singola pompa e un sistema di afflusso "Y-tubing" per entrambe le arterie uterine (Figura 1 supplementare). Dopo 4 h-SNMP, l'organo ha guadagnato oltre il 50% del suo peso iniziale. Il flusso, la pressione, la resistenza e la variazione di peso sono mostrati nella Figura 2 supplementare. Un singolo sistema di perfusione separato in due afflussi non consentiva la modulazione di ciascuna portata alla pressione di ciascun lato. In questo caso, la SNMP ha portato a un edema sostanziale in metà dell'organo (Figura supplementare 3). Questo sistema si è rivelato inadatto al modello uterino, anche perché non deve essere considerato un modello perfettamente simmetrico. Pertanto, in questo protocollo sono stati utilizzati due sistemi di perfusione meccanica, uno per ciascuna arteria uterina.

Protocollo

Tutti gli animali hanno ricevuto cure umanitarie seguendo la Guida del National Institute of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e i protocolli sono stati approvati dal Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Complessivamente, 6 femmine di maialino dello Yucatan del peso di 30-40 kg sono state utilizzate per l'approvvigionamento dell'utero, con quattro uteri sottoposti a SNMP. Tutti gli animali sono stati eparinizzati con una dose completa (100 UI/kg) prima dell'eutanasia. L'approvvigionamento degli organi è avvenuto post-mortem con meno di 60 minuti di ischemia calda. Altri organi potrebbero essere stati prelevati dallo stesso donatore per studi diversi, secondo i principi delle "3R"²⁵. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i reagenti e le apparecchiature utilizzate nel protocollo.

1. Preparazione preoperatoria (giorno prima dell'intervento)

1. Preparare la soluzione di perfusato. Per la perfusione subnormotermica della macchina, è stata utilizzata una soluzione Steen+ ottimizzata per VCA^26,27. È stato utilizzato un litro di soluzione per utero e la composizione è dettagliata nella Tabella 1.
   NOTA: Al perfusato viene aggiunta una grande quantità di idrossido di sodio con l'obiettivo di raggiungere un pH di circa 7,5-7,6. Questo valore è espressamente elevato ma necessario in quanto il pH tenderà a scendere man mano che la macchina viene fatta circolare e ossigenata con una miscela di carboidrati (95% di ossigeno; 5% di anidride carbonica).
2. Impostare il sistema di perfusione della macchina (Figura 1). Verificare la presenza di perdite e bolle quando il perfusato viene fatto circolare.

2. Approvvigionamento dell'utero post mortem

NOTA: Per simulare la donazione dopo la morte cardiaca e/o l'approvvigionamento post mortem, l'animale deve essere soppresso secondo le linee guida IACUC locali. Il dissanguamento deve essere preferito all'iniezione endovenosa di Pentobarbital al fine di evitare tossicità che potrebbero interferire con lo studio.

1. Posizionare l'animale soppresso in posizione supina. Strofina la zona addominale e posiziona teli sterili.
2. Praticare un'incisione ombelicale mediana di 10 cm con una lama #20.
3. Aprire il tessuto sottocutaneo e l'aponeurosi con un bisturi elettrico monopolare.
   NOTA: Bisogna prestare attenzione a non danneggiare l'intestino aprendo la cavità addominale.
4. Mettere da parte l'intestino tenue con una garza chirurgica ed esporre l'utero.
   NOTA: L'anatomia uterina del modello utilizzato è mostrata nella Figura 2A.
5. Procedere in modo simile per i lati sinistro e destro come segue:
   1. Identificare i vasi uterini.
      NOTA: La vena uterina è posizionata lateralmente all'arteria uterina (Figura 3).
   2. Crea un'apertura nel legamento largo lateralmente alla vena uterina con una pinza ad angolo retto.
   3. Attraverso questa apertura, inserire 2-0 punti di sutura di seta per legare i vasi ovarici e rilasciare l'utero dal tessuto connettivo circostante nel legamento largo usando la cauterizzazione.
   4. Legare i vasi utero-ovarici con 2-0 punti di sutura di seta e rimuovere l'ovaio e il tubo.
   5. Scheletrizzare i vasi uterini e dividerli il più vicino possibile ai vasi iliaci interni.
      NOTA: È necessario prestare attenzione a mantenere il peduncolo il più a lungo possibile per facilitare l'incannulamento e anticipare la retrazione del peduncolo dopo che è stato reciso.
   6. Ripetere i passaggi 2.5.1-2.5.5 sul lato opposto.
6. Rimuovere l'utero tagliando la cervice con un bisturi elettrico monopolare.
   NOTA: Utilizzare un lungo tempo di contatto per garantire una corretta coagulazione del vaso cervicale, prevenendo perdite durante la perfusione.

3. Preparazione per perfusione

1. Su un tavolino, dilatare entrambe le arterie uterine utilizzando un dilatatore microchirurgico e inserire un antinfortunio. Fissare l'incannulamento con lacci di seta 3-0 (Figura 2B).
   NOTA: In questo caso, è stato utilizzato un angiocateter da 18 G per tutte le arterie. È necessario prestare attenzione a non inserire il catetere troppo in profondità per evitare l'incannulamento selettivo, poiché la biforcazione è relativamente vicina. Le vene uterine non sono incannulate, in quanto il deflusso venoso è sufficiente a mantenere aperto il lume di questi vasi, consentendo una facile raccolta. Oltre a far risparmiare tempo, l'incannulamento traumatico può portare a danni vascolari e potenzialmente influenzare il flusso venoso.
2. Sciacquare lentamente e manualmente entrambe le arterie uterine con 20 ml di soluzione di eparina su ciascun lato fino a quando tutti i vasi sono stati lavati via e i deflussi sono chiari.
   NOTA: È necessario prestare attenzione a non lavare con alta pressione, che può portare a lesioni microvascolari e fallimento della perfusione.
3. Pesare l'utero.

4. Perfusione meccanica subnormotermica

NOTA: Per l'utero sono necessari due sistemi indipendenti di perfusione meccanica. Ogni arteria uterina è collegata a un sistema di perfusione composto da una pompa a rulli, un ossigenatore, una trappola per bolle e un sensore di pressione. Il perfusato in un serbatoio circola attraverso tubi di silicone collegati agli elementi sopra elencati prima di passare attraverso l'organo attraverso l'arteria uterina fino alla vena uterina su ciascun lato, dove il perfusato esce e viene rilasciato nello stesso serbatoio.

1. Collegare l'utero ai sistemi di perfusione della macchina collegando le cannule dell'arteria uterina al tubo di afflusso (Figura 1).
2. Utilizzando la pompa a rulli, regolare la portata su un valore basso (2,5-4,0 mL/min) per mantenere una pressione arteriosa costante tra 25-35 mmHg.
3. Valutare i parametri di vitalità in ogni punto temporale predefinito sia in entrata che in uscita utilizzando una siringa da 1 ml e analizzando i campioni con la macchina del sistema di gasanalisi ematica [ad esempio, metriche dei gas ematici (pH, pCO₂, pO₂, lattato, eccesso di basi, bicarbonato), glucosio, sodio, potassio, calcio, cloruro].
   NOTA: In questo protocollo, la perfusione dura 4 ore e i campioni dall'afflusso e dal deflusso vengono prelevati ogni 30 minuti.
4. Pesare l'utero alla fine della perfusione.

Risultati

Durante la perfusione, il sistema è stato collegato a un sensore di pressione che ha registrato la pressione durante l'esperimento. La pressione è stata inizialmente registrata per un sistema privo di utero, che è stata sottratta dalle registrazioni della pressione durante la perfusione uterina per ottenere la pressione reale dell'organo. La portata è stata adattata per mantenere la pressione all'interno dell'intervallo desiderato ed è stata controllata dalla pompa a rulli. La resis...

Discussione

Il trapianto di utero, spesso considerato parte della VCA, si è sviluppato rapidamente negli ultimi anni. Parallelamente, la perfusione meccanica ha iniziato ad essere esplorata nel VCA poiché ha dimostrato prove solide nel migliorare la conservazione degli organi solidi. La perfusione meccanica ipotermica e subnormotermica ha permesso una conservazione fino a 24 ore in modelli suini di VCA ^26,27,28 miocutaneo e contenente osso...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Pixie Oxygenation System	Medtronic	BBP241	Oxygenator
Bovin serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647	Perfusate component
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506	Perfusate component
Carbon Dioxide Oxygen	Airgas	UN3156	Carbon Dioxide Oxygen mix gas
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	49159	Perfusate component
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusate component
Dextran	Thermo scientific	406271000	Perfusate component
Heparin sodium injection	Eugia Pharma	63739-953-25	Perfusate component
Humulin Regular Insulin human	Lilly	0002-8215-01	Perfusate component
Hydrocortisone sodium succinate	Pfizer	0009-0011-03	Perfusate component
Magnesium chloride hexa-hydrate	Sigma-Aldrich	M9272	Perfusate component
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	Roller pump
Polyethylene glycol 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	Perfusate component
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Perfusate component
Pressure Monitor, Portable, PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	Pressure sensor
Radnoti Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149	Bubble trap
RAPIDPoint500	Siemens	500	Blood Gas System
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Perfusate component
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Perfusate component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	72068	Perfusate component
Sodium phosphate monobasique dihydrate	Sigma-Aldrich	71505	Perfusate component
Syringe 1 mL	BD	309659	Sample procurement
Vancomycine hydrochloride	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	Perfusate component