Établissement d’un modèle porcin pour étudier la préservation dynamique de l’utérus et la transplantation

Résumé

Un modèle détaillé et reproductible d’utérus porcin est décrit, de l’approvisionnement chirurgical à l’initiation de la perfusion en machine, permettant l’étude de la préservation de l’utérus lors de la transplantation.

Résumé

À ce jour, la transplantation d’utérus est la seule option pour les femmes atteintes d’infertilité utérine absolue, telles que celles atteintes du syndrome de Rokitansky, pour vivre une grossesse et accoucher. Malgré l’intérêt croissant pour la transplantation d’utérus ces dernières années, plusieurs questions nécessitent encore des recherches supplémentaires, notamment les lésions d’ischémie-reperfusion et leur impact sur la qualité et le rejet du greffon. La littérature récente a mis en évidence un taux de complications thrombotiques allant jusqu’à 20 % après une transplantation d’utérus. Ce type de complication peut résulter de lésions des cellules endothéliales induites par l’hypoxie, conduisant souvent au rejet du greffon utérin. L’hypoxie est induite lors de l’entreposage frigorifique statique, qui reste l’étalon-or pour la préservation des greffons dans la transplantation d’organes solides. Récemment, il a été démontré que la préservation dynamique à l’aide de la perfusion mécanique améliore le stockage à long terme des organes conventionnels et marginaux en réduisant les lésions ischémiques et hypoxiques. Dans ce protocole, nous visons à décrire chaque étape chirurgicale impliquée dans l’obtention de l’utérus porcin et la préservation dynamique, en fonction des deux pédicules utérins, afin de permettre la connexion et l’initiation du protocole de perfusion de la machine.

Introduction

La transplantation d’utérus (UTx) s’est considérablement développée au cours des dix dernières années, avec plusieurs équipes démarrant des programmes de recherche clinique. À ce jour, la principale indication de l’UTx est l’infertilité utérine absolue due à l’agénésie utérine, y compris le syndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH). Le syndrome MRKH est une maladie congénitale dont la prévalence est d’une naissance vivante chez 5 000 chez les femmes¹. UTx pourrait potentiellement traiter d’autres causes d’infertilité, notamment celles résultant d’une hystérectomie due à une maladie maligne, d’une hémorragie post-partum, de fibromes utérins, de séquelles infectieuses et de diverses malformations congénitales. Cela suggère qu’environ 1 femme sur 500 pourrait être éligible à l’UTx.

La toute première UTx clinique a eu lieu en 2000 en Arabie saoudite², mais des complications vasculaires ont conduit à une hystérectomie trois mois plus tard. Depuis lors, plusieurs cas d’UTx ont été réalisés, sur des donneurs vivants et décédés, entraînant plus de 80 naissances vivantes ^3,4. À l’instar de la transplantation d’organes solides et des allogreffes composites vascularisées (AVC), le rejet immunitaire est un défi important dans l’UTx. ⁵ Plusieurs facteurs peuvent conduire au rejet du greffon, notamment l’insuffisance microcirculatoire et la stase veineuse, qui peuvent toutes deux entraîner des complications thrombotiques. Dans une revue récente portant sur la vascularisation utérine lors de la transplantation, Kristek et al. ont signalé jusqu’à 15 % de thrombose artérielle et 5 % de thrombose veineuse⁶. De plus, l’ischémie froide et chaude sont des facteurs critiques qui doivent être pris en compte pour une transplantation réussie, car les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI) peuvent entraîner un dysfonctionnement du greffon et un rejet aigu ^7,8. Les myocytes réagissent au stress ischémique en produisant du lactate jusqu’à 6 h⁹, après quoi les dommages aux cellules musculaires sont irréversibles. L’impact de l’ischémie froide sur le myomètre a été documenté dans des études cliniques, et il a été démontré que l’utilisation d’une solution intracellulaire de l’Université du Wisconsin pendant le stockage à froid statique (SCS) améliore la conservation avec une meilleure réponse contractile à la prostaglandine et des concentrations d’ATP plus élevées par rapport à la solution d’acétate de Ringer¹⁰. Cependant, l’impact de l’ischémie chaude et froide reste peu exploré dans UTx.

La SCS reste la référence en matière de préservation de l’ACV, y compris l’utérus, et pour la plupart des greffes d’organes solides. Cependant, ces dernières années, des progrès significatifs dans les systèmes de perfusion mécanique et les solutions de conservation ont conduit à un changement de paradigme. Il existe maintenant des preuves solides soutenant que la perfusion mécanique dynamique peut améliorer et prolonger la préservation d’organes solides sains et marginaux 11,12,13,14,15. Cette technique est maintenant couramment utilisée dans la pratique clinique pour les transplantations pulmonaires, ^cardiaques, hépatiques et rénales 14,16,17,18. La préservation dynamique des organes a démontré de multiples avantages, notamment la minimisation des lésions d’ischémie par le froid et d’hypoxie en fournissant un apport continu en oxygène et en nutriments, l’élimination des métabolites toxiques et l’amélioration des paramètres de qualité et de viabilité des greffes^12,19. De multiples modalités ont été développées, allant de l’hypothermie à la perfusion machine normothermique (avec ou sans transporteurs d’oxygène), avec plusieurs perfusats disponibles, mais seuls quelques-uns ont été testés sur l’utérus²⁰. Pour garantir la contribution substantielle de telles perspectives de recherche, des modèles chirurgicaux précliniques pertinents sont d’une importance cruciale.

Dans ce travail, la perfusion machine subnormothermique (SNMP) est utilisée comme méthode de conservation dynamique d’organes oxygénés à température ambiante (environ 20 °C) en faisant circuler un perfusat à travers une pompe à rouleaux et un oxygénateur. Un modèle porcin est utilisé qui est pertinent pour les études sur l’UTx et la préservation en raison de ses similitudes avec le système reproducteur humain en termes d’anatomie, de physiologie et de taille des vaisseaux^21,22. L’utérus est obtenu après la mort circulatoire, ce qui rend pertinent le don après la mort cardiaque et suggère la possibilité d’un délai d’approvisionnement après tous les autres organes solides pertinents^23,24. De plus, ce modèle facilite le développement d’études de préservation de l’utérus au sein de laboratoires de transplantation établis en se concentrant sur d’autres organes, en appliquant les principes des « 3R »²⁵. L’objectif est d’établir un nouveau modèle de conservation basé sur les pédicules utérins et d’évaluer sa fiabilité pour une conservation dynamique. Toutes les étapes de la procédure sont détaillées, de l’hystérectomie à la conservation, en mettant en évidence les points clés de l’utilisation de SNMP.

Le protocole décrit ci-dessous a précédé une expérience préliminaire basée sur une seule pompe et un système d’entrée en « tube en Y » pour les deux artères utérines (figure supplémentaire 1). Après 4 h-SNMP, l’organe a repris plus de 50 % de son poids initial. Le débit, la pression, la résistance et la variation de poids sont illustrés à la figure supplémentaire 2. Un seul système de perfusion séparé en deux entrées ne permettait pas de moduler chaque débit à la pression de chaque côté. Dans ce cas, le SNMP a entraîné un œdème important dans la moitié de l’organe (figure supplémentaire 3). Ce système s’est avéré inadapté au modèle utérin, en partie parce qu’il ne devait pas être considéré comme un modèle parfaitement symétrique. Par conséquent, deux systèmes de perfusion machine ont été utilisés dans ce protocole, un pour chaque artère utérine.

Protocole

Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément au Guide du National Institute of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvés par le Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Au total, 6 miniporcs femelles du Yucatan pesant 30 à 40 kg ont été utilisés pour l’approvisionnement de l’utérus, et quatre utérus ont subi une SNMP. Tous les animaux ont été héparinisés avec une dose complète (100 UI/kg) avant l’euthanasie. Le prélèvement d’organes a eu lieu post-mortem avec moins de 60 minutes d’ischémie chaude. D’autres organes auraient pu être prélevés sur le même donneur pour des études différentes, selon les principes des « 3R »²⁵. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et équipements utilisés dans le protocole.

1. Préparation préopératoire (la veille de l’intervention)

1. Préparez la solution de perfusat. Pour la perfusion subnormothermique de la machine, une solution Steen+ optimisée pour le VCA a été utilisée^26,27. Un litre de solution par utérus a été utilisé, et la composition est détaillée dans le tableau 1.
   REMARQUE : Une grande quantité d’hydroxyde de sodium est ajoutée au perfusat dans le but d’atteindre un pH d’environ 7,5-7,6. Cette valeur est expressément élevée mais nécessaire car le pH aura tendance à baisser lorsque la machine circule et est oxygénée avec un mélange de carbogène (95 % d’oxygène ; 5 % de dioxyde de carbone).
2. Configurez le système de perfusion de l’appareil (Figure 1). Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites et de bulles lorsque le perfusat circule.

2. Prélèvement post-mortem de l’utérus

REMARQUE : Pour simuler le don après une mort cardiaque et/ou un prélèvement post-mortem, l’animal doit être euthanasié conformément aux directives locales de l’IACUC. L’exsanguination doit être préférée à l’injection intraveineuse de Pentobarbital afin d’éviter une toxicité qui pourrait interférer avec l’étude.

1. Placez l’animal euthanasié en position couchée. Frottez la région abdominale et placez des champs stériles.
2. Faites une incision infra-ombilicale médiane de 10 cm avec une lame #20.
3. Ouvrez le tissu sous-cutané et l’aponévrose avec un scalpel électrique monopolaire.
   REMARQUE : Il faut faire attention à ne pas endommager les intestins en ouvrant la cavité abdominale.
4. Écartez l’intestin grêle avec une gaze chirurgicale et exposez l’utérus.
   REMARQUE : L’anatomie utérine du modèle utilisé est illustrée à la figure 2A.
5. Procédez de la même manière pour les côtés gauche et droit comme suit :
   1. Identifiez les vaisseaux utérins.
      REMARQUE : La veine utérine est positionnée latéralement à l’artère utérine (Figure 3).
   2. Créez une ouverture dans le ligament large latéralement à la veine utérine avec une pince à angle droit.
   3. À travers cette ouverture, insérez des sutures en soie 2-0 pour ligaturer les vaisseaux ovariens et libérer l’utérus du tissu conjonctif environnant dans le ligament large à l’aide d’une cautérisation.
   4. Lister les vaisseaux utéro-ovariens avec des sutures en soie 2-0 et retirer l’ovaire et le tube.
   5. Squelettez les vaisseaux utérins et divisez-les aussi près que possible des vaisseaux iliaques internes.
      REMARQUE : Il faut veiller à ce que le pédicule soit conservé le plus longtemps possible afin de faciliter la canulation et d’anticiper la rétraction du pédicule après sa section.
   6. Répétez les étapes 2.5.1 à 2.5.5 du côté opposé.
6. Retirez l’utérus en coupant à travers le col de l’utérus avec un scalpel électrique monopolaire.
   REMARQUE : Utilisez un temps de contact long pour assurer une bonne coagulation des vaisseaux du col de l’utérus, évitant ainsi les fuites pendant la perfusion.

3. Préparation à la perfusion

1. Sur une table d’appoint, dilater les deux artères utérines à l’aide d’un dilatateur microchirurgical et insérer un angiocathéter. Fixez la canulation à l’aide de 3-0 liens en soie (Figure 2B).
   REMARQUE : Ici, un angiocathéter de 18 G a été utilisé pour toutes les artères. Il faut veiller à ne pas insérer le cathéter trop loin pour éviter la canulation sélective, car la bifurcation est relativement proche. Les veines utérines ne sont pas canulées, car l’écoulement veineux est suffisant pour maintenir la lumière de ces vaisseaux ouverte, ce qui permet une collecte facile. En plus de faire gagner du temps, la canulation traumatique peut entraîner des lésions vasculaires et potentiellement affecter le flux veineux.
2. Rincez lentement et manuellement les deux artères utérines avec 20 ml de solution d’héparine de chaque côté jusqu’à ce que tous les vaisseaux soient lavés et que les écoulements soient dégagés.
   REMARQUE : Attention à ne pas rincer à haute pression, ce qui peut entraîner des lésions microvasculaires et une défaillance de la perfusion.
3. Pesez l’utérus.

4. Perfusion de machine subnormothermique

REMARQUE : Pour l’utérus, deux systèmes indépendants de perfusion mécanique sont nécessaires. Chaque artère utérine est reliée à un système de perfusion composé d’une pompe à rouleau, d’un oxygénateur, d’un piège à bulles et d’un capteur de pression. Le perfusat dans un réservoir circule à travers des tubes en silicone reliés aux éléments énumérés ci-dessus avant de traverser l’organe via l’artère utérine jusqu’à la veine utérine de chaque côté, où le perfusat sort et est libéré dans le même réservoir.

1. Connectez l’utérus aux systèmes de perfusion de la machine en connectant les canules de l’artère utérine dans la tubulure d’entrée (Figure 1).
2. À l’aide de la pompe à rouleau, réglez le débit à faible (2,5-4,0 mL/min) pour maintenir une pression artérielle constante entre 25-35 mmHg.
3. Évaluer les paramètres de viabilité à chaque point temporel prédéfini dans l’entrée et la sortie à l’aide d’une seringue de 1 mL et en analysant les échantillons avec l’appareil du système des gaz du sang [p. ex., paramètres des gaz du sang (pH, pCO₂, pO₂, lactate, excès de bases, bicarbonate), glucose, sodium, potassium, calcium, chlorure].
   REMARQUE : Dans ce protocole, la perfusion dure 4 h et des échantillons de l’entrée et de la sortie sont prélevés toutes les 30 minutes.
4. Pesez l’utérus à la fin de la perfusion.

Résultats

Pendant la perfusion, le système a été connecté à un capteur de pression qui a enregistré la pression pendant l’expérience. La pression a d’abord été enregistrée pour un système sans utérus, qui a été soustrait des enregistrements de pression pendant la perfusion utérine pour obtenir la pression réelle de l’organe. Le débit a été adapté pour maintenir la pression dans la plage souhaitée et a été contrôlé par la pompe à rouleaux. La résistance a été calc...

Discussion

La transplantation d’utérus, souvent considérée comme faisant partie de l’AVC, s’est rapidement développée au cours des dernières années. En parallèle, la perfusion mécanique a commencé à être explorée dans le VCA car elle a démontré des preuves solides dans l’amélioration de la préservation des organes solides. La perfusion mécanique hypothermique et subnormothermique a permis jusqu’à 24 h de conservation chez les porcs de VCA myocutané et contenant des os ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affinity Pixie Oxygenation System	Medtronic	BBP241	Oxygenator
Bovin serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647	Perfusate component
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506	Perfusate component
Carbon Dioxide Oxygen	Airgas	UN3156	Carbon Dioxide Oxygen mix gas
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	49159	Perfusate component
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Perfusate component
Dextran	Thermo scientific	406271000	Perfusate component
Heparin sodium injection	Eugia Pharma	63739-953-25	Perfusate component
Humulin Regular Insulin human	Lilly	0002-8215-01	Perfusate component
Hydrocortisone sodium succinate	Pfizer	0009-0011-03	Perfusate component
Magnesium chloride hexa-hydrate	Sigma-Aldrich	M9272	Perfusate component
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	Roller pump
Polyethylene glycol 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	Perfusate component
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	Perfusate component
Pressure Monitor, Portable, PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	Pressure sensor
Radnoti Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149	Bubble trap
RAPIDPoint500	Siemens	500	Blood Gas System
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Perfusate component
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Perfusate component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	72068	Perfusate component
Sodium phosphate monobasique dihydrate	Sigma-Aldrich	71505	Perfusate component
Syringe 1 mL	BD	309659	Sample procurement
Vancomycine hydrochloride	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	Perfusate component