Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Werner Birgit per il suo aiuto con la produzione di questo articolo video. Questa ricerca è stata finanziata da un premio CARRIERA NSF.

Parte 1: Preparazione Sperimentale Procedure sperimentali eseguite su granchi a ferro di cavallo sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Boston University. Gli animali vengono acquistati dai laboratori di biologia marina (Woods Hole, MA) o altri fornitori e ospitato in una vasca con acqua di mare aerata in una stanza esposta a un mercato regolamentato ciclo luce-buio. Il regime di illuminazione è importante per inglobamento orologio circadiano del granchio e il ciclismo l&#39;occhio ogni giorno tra i suoi stati diurno e notturno. Immediatamente prima di iniziare qualsiasi procedura invasiva, l&#39;animale è raffreddata in un secchiello del ghiaccio per 10-15 minuti fino a quando il suo moto è rallentato e poi fissato a una piattaforma di legno con due viti in acciaio inox inserito nel Prosoma e due nella opisthosoma. La piattaforma è ponderata sotto con granito in modo che affonda in acqua. Dopo gli esperimenti terminale l&#39;animale è eutanasia mediante immersione in liquami ghiaccio di nuovo e enervazione il cervello, che si trova sopra la bocca, con un bisturi. Parte 2: Soluzioni Soluzione Limulus Ringer è composto di 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50 micron TES, HEPES 50 micron, e 10 ml / L Pen-Strep mix (penicillina-streptomicina, 10000 unità / ml) . Parte 3: Registrazione Elettroretinogramma Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, vaselina, soluzione di Ringer, una pipetta di trasferimento, un LED verde, una camera di registrazione, viti in acciaio inox, e un tampone di cotone. <ol><li> Una camera a mano è usato per registrare il GRE (Figura 1A). Il corpo camera è progettata per contenere un bacino salino in contatto con l&#39;occhio. Il coperchio contiene un filo di cloruro d&#39;argento per l&#39;accoppiamento la soluzione conduttiva ad un amplificatore e un foro di piccole dimensioni per ospitare un LED. Un LED ultraluminosi con picco di emissione intorno 520nm funziona meglio. </li><li> Per iniziare, la parte inferiore della camera è rivestita con vaselina e fissato sopra l&#39;occhio con due viti. </li><li> La camera viene poi riempito con soluzione fisiologica e sigillato con il coperchio. </li><li> Dopo l&#39;attaccamento camera il granchio è collocato in una tenuta di luce gabbia in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie. </li><li> Il cavo LED è inserito nel coperchio della camera. </li><li> Il cavo segnale viene troncato per il filo cloruro, e la guida di riferimento è ritagliato una delle viti impiantate. </li><li> Entrambi i cavi sono collegati alla fase a capo di un amplificatore ad alta impedenza differenziale (X-cell 3x4, FHC Inc) per l&#39;amplificazione del segnale e il filtro amplificatore è impostato per passare le frequenze inferiori a 10Hz. </li><li> L&#39;uscita dell&#39;amplificatore è inviato a un oscilloscopio per la visualizzazione e ad una scheda di acquisizione dati per l&#39;analisi del computer e lo stoccaggio. </li><li> Dopo l&#39;installazione la porta della gabbia è chiusa per bloccare la luce della stanza di raggiungere l&#39;animale. </li><li> I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in LabView. Il programma lampeggia il LED, registra il segnale evocato ERG, e misura il picco-picco di ampiezza di risposta. La scelta del paradigma flash dipende l&#39;obiettivo sperimentale. Ad esempio, un breve (100 ms) impulso di 5V applicata ogni 10 minuti per il LED di evitare effetti di adattamento alla luce quando il monitoraggio dei cambiamenti circadiano della sensibilità dell&#39;occhio. </li></ol> Parte 4: la registrazione del nervo ottico Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, filo, un trapano, soluzione di Ringer, Rongeurs, forbici Vännäs, una camera di registrazione, pinze curve, sonde con ago sottile, un sordo bisturi, forbici chirurgiche, e un elettrodo di aspirazione. <ol><li> Una camera a mano è usato per registrare le risposte del nervo ottico (Figura 1B). L&#39;interno della camera di due centimetri di diametro è ben aperta che ha una sottile apertura semicircolare fessura nella parete di fondo per accogliere il nervo e isolare dal tessuto circostante. </li><li> Prima di attaccamento camera di un 16-gauge viene inserito tra i muscoli cerniera nel cuore e ~ 20 cc di sangue drenato dal animale. Dissanguamento non è necessario ma rende più facile la dissezione del nervo ottico. </li><li> La posizione del nervo ottico è stimato da disegno sul carapace di una linea leggermente curva tra gli occhi laterali e mediana. </li><li> Un foro circolare viene poi tagliata nel carapace con un trapano. Il foro è lo stesso diametro della camera di bene. Il centro del buco si trova 2-3 cm anteriore dell&#39;occhio e leggermente laterale dorsale per la linea in modo che il nervo corre lungo la parte ventrale del bene. </li><li> Tessuto connettivo è cancellato fino a quando il nervo è completamente visibile e priva di tessuto circostante e sottostante. </li><li> Un filo di thread è passato intorno al nervo e tirò nella camera attraverso la fessura in basso. Attraverso questa stessa apertura il nervo viene delicatamente guidato nella camera tirando la corda. Allo stesso tempo, la camera è ben inserito nel foro. La camera è quindi fissata al carapacecon viti e il pozzo è riempito con soluzione di Ringer. </li><li> Dopo l&#39;attaccamento della camera l&#39;animale è posto in una gabbia a tenuta di luce in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie. </li><li> Il pozzo è visualizzato sotto uno stereoscopio (SMZ-168, Jed Pella Inc) ed è imbottita di cotone attorno l&#39;apertura sul fondo per evitare la fuoriuscita di sangue e soluzione salina dalla camera. </li><li> Residua del tessuto connettivo intorno al nervo viene rimosso con forbici e pinzette, e la camera è riempita con soluzione di Ringer fresco. </li><li> Un nick è presentata nel vaso sanguigno che incapsula il nervo e attraverso questa apertura il nervo viene attentamente desheathed tutta la sua lunghezza con le forbici fine, pinzette, aghi e sonde. </li><li> Un piccolo fascio di fibre è separata dal nervo utilizzando la sonda e tagliare alla fine più lontana dagli occhi per la registrazione delle fibre afferenti e alla fine più vicino agli occhi per la registrazione delle fibre efferenti. Nel video la fine per le registrazioni di fibre afferenti viene tagliato. </li><li> Un elettrodo microsuction (AM Systems Inc) riempita con una soluzione Ringers è utilizzato per la registrazione del nervo ottico. La punta dell&#39;elettrodo è montato il fascio nervo dal fuoco lucidatura alla fine di un vetro borosilicato 1 millimetro di diametro capillare. </li><li> La punta dell&#39;elettrodo si abbassa nella camera bene con un manipolatore manuale (WPI Inc), e il fascio di fibre taglio è risucchiato la punta. Aspiratore è dotato di una siringa Gilmont collegato all&#39;elettrodo attraverso tubi. </li><li> Una connessione BNC fornisce il cavo del segnale e un filo di cloruro d&#39;argento avvolto intorno all&#39;elettrodo per ridurre il rumore fornisce la guida di riferimento. I due cavi sono collegati alla fase a capo di un amplificatore differenziale per l&#39;amplificazione del segnale e rumore di filtraggio (X-cell 3x4, FHC Inc). L&#39;uscita dell&#39;amplificatore è inviato ad un oscilloscopio per la visualizzazione e una scheda di acquisizione dati per l&#39;analisi del computer e lo stoccaggio. </li><li> I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in LabView. Il programma controlla stimoli luminosi tramite un processore video digitale (bit + +, Cambridge Research Systems Inc) e le interfacce con un picco digitale discriminatore (APM, FHC Inc) che registra treni di impulsi. La luce può essere consegnato a singole cellule negli occhi attraverso un tubo di illuminazione a fibre ottiche o per l&#39;intero occhio attraverso un controllo computerizzato di visualizzazione video. </li></ol> Parte 5: registrazione intraretinica Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, una a forma di L piattaforma lucite con fori filettati, titolare di un microelettrodo con una pipetta di vetro, viti in acciaio inox, pinzette e un bisturi sottile. <ol><li> Un piatto a mano lucite con fori per le viti preset viene utilizzato per registrare le risposte intracellulari. I fori sono distanziati per il montaggio di un micromanipolatore motorizzato (PPM5000, WPI Inc). La piastra è fissata per l&#39;animale con due viti sul lato e uno sopra. </li><li> Dopo l&#39;attaccamento piastra l&#39;animale è posto in una gabbia a tenuta di luce in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie. </li><li> Il micropositioner è avvitato il piatto, con il suo braccio mobile allineati sopra l&#39;occhio. </li><li> Un lotto di micropipette di vetro sono tirati da 1-mm di diametro in vetro borosilicato e le punte sono riempito attraverso un&#39;azione capillare mettendo il micropipette in una fialetta di soluzione di KCl 3M. </li><li> Il resto del pipette vengono riempite manualmente con la soluzione salina e inserito in un supporto elettrodo. </li><li> Il titolare elettrodo viene collegato alla fase capo di un amplificatore intracellulare (IR-283, Cygnus Technology Inc) apposta sul braccio micropositioner. </li><li> Una sezione molto piccola di retina (~ 1mm2) è esposta tagliando via l&#39;interfaccia cornea con una lametta. </li><li> Una goccia di soluzione di Ringer è posto sulla retina esposto contro l&#39;essiccamento e la punta micropipetta è avanzato attraverso l&#39;apertura nel tessuto retinico. </li><li> Quando la punta entra nella soluzione, la modalità di iniezione di corrente dell&#39;amplificatore intracellulare è impegnato e l&#39;impedenza elettrodo viene misurato. Micropipette con impedenza di fuori del range di 20-70 MW vengono scartati. Quelli di questa gamma sono avanzati in passi micron e impalata in cellule facendo vibrare la punta della pipetta elettronica o meccanica. </li><li> Tre tipi di cellule si possono incontrare negli occhi. Retinular cellule mostrano solo una risposta depolarizzante alla luce, le cellule mostrano eccentrico un treno di potenziali d&#39;azione a cavallo su una risposta depolarizzante, e le cellule del pigmento non mostrano risposta di luce. </li><li> I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in Labview. Il programma controlla stimoli luminosi tramite un processore video digitale (bit + +, Cambridge Research Systems). Gli stimoli vengono consegnati alle cellule impalato con un tubo in fibra ottica o video. Risposte tensione si osservano sul oscilloscopio e digitalizzati dal programma per computer. </li></ol> Parte 6: Risultati Rappresentante Un rappresentante ERG è mostrata in figura 2A. La forma d&#39;onda rappresenta il riassunto elettricarisposta alla luce soprattutto delle cellule fotosensibile retinular, in quanto molto più numerosi delle cellule eccentrico e sono elettricamente accoppiate a loro. Non ci sono componenti delle forme d&#39;onda multiple da diversi tipi di cellule della retina dei mammiferi come con l&#39;ERG. Un feedback da un orologio circadiano nel cervello Limulus modula le proprietà fisiologiche delle cellule retiniche su base giornaliera, causando il corso ampiezza e l&#39;ora di ERG a variare nel tempo (1). Come mostrato nella Figura 2B, ERG ampiezza è più alto durante la notte soggettiva dell&#39;animale e più bassa durante il giorno soggettiva. Una traccia di rappresentante di una risposta ottica singola fibra nervosa alla luce è mostrata in Figura 3. Cellule eccentrico tutti si comportano o meno lo stesso, mostrando un aumento transitorio del tasso di scarico picco seguito da un decadimento di un livello sostenuto. Il tasso di decadimento riflette l&#39;azione combinata di adattamento alla luce e picco-dipendente di auto-inibizione sulle cellule eccentrico (2). Altri modelli di punta, come la luce-dipendenti della velocità, sono visti nel cervello Limulus, ma non l&#39;occhio (3). Tracce rappresentante della risposta di tensione di una cella cella di pigmento, cellula retinular, ed eccentrico alla luce sono mostrati in Figura 4. Solo gli ultimi due tipi di cellule della retina sono visive. Il corso ampiezza e l&#39;ora della loro risposta dipende dalla qualità della registrazione e la posizione degli elettrodi all&#39;interno della cellula. Di solito, l&#39;elettrodo penetra le cellule del pigmento o cellule retinular a causa delle loro grandi dimensioni e numero. In quest&#39;ultimo caso, una depolarizzazione transitoria che decade ad un livello sostenuto viene registrato. Il degrado è dovuto adattamento alla luce da parte delle cellule retinular (2). Se l&#39;elettrodo entra in una cellula eccentrico, potenziali d&#39;azione di grandi dimensioni sono registrati nel assone (40-70mV) e potenziali d&#39;azione piccola guida su una forma d&#39;onda depolarizzante (&lt;25 mV) in prossimità del soma. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Diagrammi di camere utilizzate per la registrazione di elettroretinogramma (A) e la registrazione del nervo ottico (B). Bar A è uguale a 7 mm e 5 mm in B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Traccia Esempio di ERG Limulus evocato da un impulso di 100ms LED 5V al buio (A) e il picco-picco fluttuazione in ampiezza ERG nel corso del tempo al buio costante (B). Tenebre è stato avviato al momento indicato dal triangolo bianco. La crescita in ERG ampiezza attraverso il tempo indicato dal triangolo nero è dovuta all&#39;adattamento luce, che aumenta la sensibilità degli occhi nel buio. La variazione ciclica in ERG ampiezza è successivamente a causa di orologio interno circadiano dell&#39;animale. Tempo punti in B sono ogni 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Traccia Esempio di una risposta delle fibre del nervo ottico a luce flash su un solo recettore ommatidial. Forma d&#39;onda al di sopra della traccia mostra tempismo stimolo. Cellule eccentrico, i cui assoni dare origine a fibre nervose, mostrano un modello simile di cottura in quanto alle condizioni di illuminazione dell&#39;esperimento (5sec lampo nel buio più totale). Codifica della retina con punte è una Limulus proprietà ha in comune con i mammiferi, a differenza di altri invertebrati. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="figura 4" /> Figura 4 tracce Esempio di risposta di tensione alla luce dei tre tipi di cellule presenti negli occhi Limulus laterale:. Cellule del pigmento (A), la cella retinular (B), e la cella eccentrico (C). La prima cella è non-visiva. Gli ultimi due depolarizzare su un lampo di luce. La depolarizzazione è il più grande per le cellule retinular perché trasdurre la luce e inviare il segnale attraverso giunzioni gap alla cella eccentrico, con qualche perdita lungo la strada. Nella cella eccentrico, potenziali d&#39;azione sparati da l&#39;assone si vedono a cavallo sulla depolarizzazione causa di backpropagation picco nel soma. L&#39;ampiezza dei potenziali d&#39;azione è stato attenuato in figura per una migliore visualizzazione del potenziale depolarizzante. Il potenziale di riposo delle cellule è-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Abbiamo mostrato come eseguire registrazioni ERG, registrazioni nervo ottico, e le registrazioni intraretinica di granchi a ferro di cavallo in vivo. Le tecniche di registrazione ogni fornire spunti diversi in base neurali della visione, e tutti possono essere utilizzati per studiare la funzione retinica in vivo gli animali grazie alle grandi occhi del granchio e carapace duro. L&#39;attività del nervo ottico può anche essere registrato dalle comportarsi liberamente gli animali in mare con la costruzione corretta degl...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

Il granchio americano a ferro di cavallo, Limulus Polifemo è una delle più antiche creature sulla terra, e l&#39;animale continua a svolgere un ruolo indispensabile nella ricerca biomedica. Non solo il loro sangue contiene cellule speciali che gli scienziati utilizzano per rilevare bacteriotoxins nei nostri farmaci, ma i loro occhi contengono anche una rete neurale che ha fornito informazioni molto di processi fisiologici che operano nel nostro sistema visivo, come ad esempio l&#39;adattamento alla luce e l&#39;inibizione laterale. Il granchio a ferro di cavallo rimane un modello interessante per la ricerca visione perché l&#39;animale è grande e resistente per un invertebrato, i suoi neuroni della retina sono grandi e facilmente accessibili, il suo sistema visivo è compatto e ampiamente studiato, e il suo comportamento visivo è ben definito. Inoltre, la struttura e la funzione degli occhi sono modulati su una base quotidiana da un orologio circadiano nel cervello l&#39;animale s. In breve, il sistema visivo dei granchi a ferro di cavallo è abbastanza semplice da essere capito ancora abbastanza complessa per essere interessante. In questo video vi presentiamo tre paradigmi elettrofisiologico per indagare le basi neurali della visione che possono essere eseguite in vivo con Limulus. Sono registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica. Elettroretinogramma (ERG) registrazioni misura con una superficie dell&#39;elettrodo la risposta elettrica riassunto di tutte le cellule negli occhi un lampo di luce. Possono essere utilizzati per monitorare la sensibilità complessiva del occhio per prolungare i periodi di tempo. Registrazioni nervo ottico misurare l&#39;attività incurvamento singole fibre nervose con un elettrodo extracellulare microsuction. Possono essere utilizzati per studiare messaggi visivi trasmessi dall&#39;occhio al cervello e-orologio circadiano messaggi reinserito dal cervello alla vista. Intraretinica misura registrazioni con microelettrodi intracellulari le fluttuazioni di tensione indotta dalla luce in singole cellule dell&#39;occhio. Possono essere usati per chiarire i meccanismi cellulari di elaborazione della retina.

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Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

In questo video possiamo eseguire la registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica con il granchio americano a ferro di cavallo,<em&gt; Limulus Polifemo</em&gt;. Questi paradigmi elettrofisiologiche possono essere utilizzati per indagare le basi neurali della visione in un laboratorio di ricerca o insegnamento.

Utilizzando il Granchio Ferro di Cavallo, Limulus Polifemo, In Vision Research

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K Views.  Boston University. In questo video possiamo eseguire la registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica con il granchio americano a ferro di cavallo, Limulus Polifemo. Questi paradigmi elettrofisiologiche possono essere utilizzati per indagare le basi neurali della visione in un laboratorio di ricerca o insegnamento.

Video: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Raccolta di sangue dal Granchio Ferro di Cavallo Americano, Limulus Polifemo

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Ricerca

Biologia

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Flussi di lavoro GST, analisi dei risultati e gestione dei dati con un approccio di visione artificiale

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Autore in primo piano: Un approccio basato sulla visione artificiale ai flussi di lavoro della microscopia elettronica a trasmissione, all'analisi dei risultati e alla gestione dei dati  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.

Un approccio di visione artificiale ai flussi di lavoro di microscopia elettronica a trasmissione, all'analisi dei risultati e alla gestione dei dati

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the protocol is to emphasize the correct techniques used in a research laboratory to prevent contamination from fungi and bacteria. Special emphasis is placed on avoiding mycoplasma contamination, a major concern in the cell culture room due to its small size and resistance to most antibiotics used for cell culture. These same techniques ensure continuous growth and maintain healthy cells. For new and experienced cell culture users alike, it&#8217;s important to consistently adhere to these best practices to mitigate the risk of contamination. Once a year, laboratories should review cell culture best practices and follow-up with a discussion or additional training if needed. Taking early action to prevent contamination in the first place will save time and money, as compared to cleaning up after contamination occurs. Universal best practices keep cell cultures healthy, thereby reducing the need to constantly thaw new cells, purchase expensive cell culture media, and reducing the amount of incubator decontamination and downtime.&#160;

This protocol presents essential cell culture techniques and practices to be used in the research cell culture laboratory to avoid contamination by fungi and bacteria. Within the category of bacteria, special emphasis will be placed on preventing mycoplasma contamination.&#160;&#160;

Tecniche e pratiche di coltura cellulare per evitare la contaminazione da funghi e batteri nel laboratorio di coltura cellulare di ricerca

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...