Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Werner Birgit per il suo aiuto con la produzione di questo articolo video. Questa ricerca è stata finanziata da un premio CARRIERA NSF.

Parte 1: Preparazione Sperimentale Procedure sperimentali eseguite su granchi a ferro di cavallo sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Boston University. Gli animali vengono acquistati dai laboratori di biologia marina (Woods Hole, MA) o altri fornitori e ospitato in una vasca con acqua di mare aerata in una stanza esposta a un mercato regolamentato ciclo luce-buio. Il regime di illuminazione è importante per inglobamento orologio circadiano del granchio e il ciclismo l&#39;occhio ogni giorno tra i suoi stati diurno e notturno. Immediatamente prima di iniziare qualsiasi procedura invasiva, l&#39;animale è raffreddata in un secchiello del ghiaccio per 10-15 minuti fino a quando il suo moto è rallentato e poi fissato a una piattaforma di legno con due viti in acciaio inox inserito nel Prosoma e due nella opisthosoma. La piattaforma è ponderata sotto con granito in modo che affonda in acqua. Dopo gli esperimenti terminale l&#39;animale è eutanasia mediante immersione in liquami ghiaccio di nuovo e enervazione il cervello, che si trova sopra la bocca, con un bisturi. Parte 2: Soluzioni Soluzione Limulus Ringer è composto di 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50 micron TES, HEPES 50 micron, e 10 ml / L Pen-Strep mix (penicillina-streptomicina, 10000 unità / ml) . Parte 3: Registrazione Elettroretinogramma Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, vaselina, soluzione di Ringer, una pipetta di trasferimento, un LED verde, una camera di registrazione, viti in acciaio inox, e un tampone di cotone. <ol><li> Una camera a mano è usato per registrare il GRE (Figura 1A). Il corpo camera è progettata per contenere un bacino salino in contatto con l&#39;occhio. Il coperchio contiene un filo di cloruro d&#39;argento per l&#39;accoppiamento la soluzione conduttiva ad un amplificatore e un foro di piccole dimensioni per ospitare un LED. Un LED ultraluminosi con picco di emissione intorno 520nm funziona meglio. </li><li> Per iniziare, la parte inferiore della camera è rivestita con vaselina e fissato sopra l&#39;occhio con due viti. </li><li> La camera viene poi riempito con soluzione fisiologica e sigillato con il coperchio. </li><li> Dopo l&#39;attaccamento camera il granchio è collocato in una tenuta di luce gabbia in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie. </li><li> Il cavo LED è inserito nel coperchio della camera. </li><li> Il cavo segnale viene troncato per il filo cloruro, e la guida di riferimento è ritagliato una delle viti impiantate. </li><li> Entrambi i cavi sono collegati alla fase a capo di un amplificatore ad alta impedenza differenziale (X-cell 3x4, FHC Inc) per l&#39;amplificazione del segnale e il filtro amplificatore è impostato per passare le frequenze inferiori a 10Hz. </li><li> L&#39;uscita dell&#39;amplificatore è inviato a un oscilloscopio per la visualizzazione e ad una scheda di acquisizione dati per l&#39;analisi del computer e lo stoccaggio. </li><li> Dopo l&#39;installazione la porta della gabbia è chiusa per bloccare la luce della stanza di raggiungere l&#39;animale. </li><li> I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in LabView. Il programma lampeggia il LED, registra il segnale evocato ERG, e misura il picco-picco di ampiezza di risposta. La scelta del paradigma flash dipende l&#39;obiettivo sperimentale. Ad esempio, un breve (100 ms) impulso di 5V applicata ogni 10 minuti per il LED di evitare effetti di adattamento alla luce quando il monitoraggio dei cambiamenti circadiano della sensibilità dell&#39;occhio. </li></ol> Parte 4: la registrazione del nervo ottico Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, filo, un trapano, soluzione di Ringer, Rongeurs, forbici Vännäs, una camera di registrazione, pinze curve, sonde con ago sottile, un sordo bisturi, forbici chirurgiche, e un elettrodo di aspirazione. <ol><li> Una camera a mano è usato per registrare le risposte del nervo ottico (Figura 1B). L&#39;interno della camera di due centimetri di diametro è ben aperta che ha una sottile apertura semicircolare fessura nella parete di fondo per accogliere il nervo e isolare dal tessuto circostante. </li><li> Prima di attaccamento camera di un 16-gauge viene inserito tra i muscoli cerniera nel cuore e ~ 20 cc di sangue drenato dal animale. Dissanguamento non è necessario ma rende più facile la dissezione del nervo ottico. </li><li> La posizione del nervo ottico è stimato da disegno sul carapace di una linea leggermente curva tra gli occhi laterali e mediana. </li><li> Un foro circolare viene poi tagliata nel carapace con un trapano. Il foro è lo stesso diametro della camera di bene. Il centro del buco si trova 2-3 cm anteriore dell&#39;occhio e leggermente laterale dorsale per la linea in modo che il nervo corre lungo la parte ventrale del bene. </li><li> Tessuto connettivo è cancellato fino a quando il nervo è completamente visibile e priva di tessuto circostante e sottostante. </li><li> Un filo di thread è passato intorno al nervo e tirò nella camera attraverso la fessura in basso. Attraverso questa stessa apertura il nervo viene delicatamente guidato nella camera tirando la corda. Allo stesso tempo, la camera è ben inserito nel foro. La camera è quindi fissata al carapacecon viti e il pozzo è riempito con soluzione di Ringer. </li><li> Dopo l&#39;attaccamento della camera l&#39;animale è posto in una gabbia a tenuta di luce in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie. </li><li> Il pozzo è visualizzato sotto uno stereoscopio (SMZ-168, Jed Pella Inc) ed è imbottita di cotone attorno l&#39;apertura sul fondo per evitare la fuoriuscita di sangue e soluzione salina dalla camera. </li><li> Residua del tessuto connettivo intorno al nervo viene rimosso con forbici e pinzette, e la camera è riempita con soluzione di Ringer fresco. </li><li> Un nick è presentata nel vaso sanguigno che incapsula il nervo e attraverso questa apertura il nervo viene attentamente desheathed tutta la sua lunghezza con le forbici fine, pinzette, aghi e sonde. </li><li> Un piccolo fascio di fibre è separata dal nervo utilizzando la sonda e tagliare alla fine più lontana dagli occhi per la registrazione delle fibre afferenti e alla fine più vicino agli occhi per la registrazione delle fibre efferenti. Nel video la fine per le registrazioni di fibre afferenti viene tagliato. </li><li> Un elettrodo microsuction (AM Systems Inc) riempita con una soluzione Ringers è utilizzato per la registrazione del nervo ottico. La punta dell&#39;elettrodo è montato il fascio nervo dal fuoco lucidatura alla fine di un vetro borosilicato 1 millimetro di diametro capillare. </li><li> La punta dell&#39;elettrodo si abbassa nella camera bene con un manipolatore manuale (WPI Inc), e il fascio di fibre taglio è risucchiato la punta. Aspiratore è dotato di una siringa Gilmont collegato all&#39;elettrodo attraverso tubi. </li><li> Una connessione BNC fornisce il cavo del segnale e un filo di cloruro d&#39;argento avvolto intorno all&#39;elettrodo per ridurre il rumore fornisce la guida di riferimento. I due cavi sono collegati alla fase a capo di un amplificatore differenziale per l&#39;amplificazione del segnale e rumore di filtraggio (X-cell 3x4, FHC Inc). L&#39;uscita dell&#39;amplificatore è inviato ad un oscilloscopio per la visualizzazione e una scheda di acquisizione dati per l&#39;analisi del computer e lo stoccaggio. </li><li> I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in LabView. Il programma controlla stimoli luminosi tramite un processore video digitale (bit + +, Cambridge Research Systems Inc) e le interfacce con un picco digitale discriminatore (APM, FHC Inc) che registra treni di impulsi. La luce può essere consegnato a singole cellule negli occhi attraverso un tubo di illuminazione a fibre ottiche o per l&#39;intero occhio attraverso un controllo computerizzato di visualizzazione video. </li></ol> Parte 5: registrazione intraretinica Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, una a forma di L piattaforma lucite con fori filettati, titolare di un microelettrodo con una pipetta di vetro, viti in acciaio inox, pinzette e un bisturi sottile. <ol><li> Un piatto a mano lucite con fori per le viti preset viene utilizzato per registrare le risposte intracellulari. I fori sono distanziati per il montaggio di un micromanipolatore motorizzato (PPM5000, WPI Inc). La piastra è fissata per l&#39;animale con due viti sul lato e uno sopra. </li><li> Dopo l&#39;attaccamento piastra l&#39;animale è posto in una gabbia a tenuta di luce in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie. </li><li> Il micropositioner è avvitato il piatto, con il suo braccio mobile allineati sopra l&#39;occhio. </li><li> Un lotto di micropipette di vetro sono tirati da 1-mm di diametro in vetro borosilicato e le punte sono riempito attraverso un&#39;azione capillare mettendo il micropipette in una fialetta di soluzione di KCl 3M. </li><li> Il resto del pipette vengono riempite manualmente con la soluzione salina e inserito in un supporto elettrodo. </li><li> Il titolare elettrodo viene collegato alla fase capo di un amplificatore intracellulare (IR-283, Cygnus Technology Inc) apposta sul braccio micropositioner. </li><li> Una sezione molto piccola di retina (~ 1mm2) è esposta tagliando via l&#39;interfaccia cornea con una lametta. </li><li> Una goccia di soluzione di Ringer è posto sulla retina esposto contro l&#39;essiccamento e la punta micropipetta è avanzato attraverso l&#39;apertura nel tessuto retinico. </li><li> Quando la punta entra nella soluzione, la modalità di iniezione di corrente dell&#39;amplificatore intracellulare è impegnato e l&#39;impedenza elettrodo viene misurato. Micropipette con impedenza di fuori del range di 20-70 MW vengono scartati. Quelli di questa gamma sono avanzati in passi micron e impalata in cellule facendo vibrare la punta della pipetta elettronica o meccanica. </li><li> Tre tipi di cellule si possono incontrare negli occhi. Retinular cellule mostrano solo una risposta depolarizzante alla luce, le cellule mostrano eccentrico un treno di potenziali d&#39;azione a cavallo su una risposta depolarizzante, e le cellule del pigmento non mostrano risposta di luce. </li><li> I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in Labview. Il programma controlla stimoli luminosi tramite un processore video digitale (bit + +, Cambridge Research Systems). Gli stimoli vengono consegnati alle cellule impalato con un tubo in fibra ottica o video. Risposte tensione si osservano sul oscilloscopio e digitalizzati dal programma per computer. </li></ol> Parte 6: Risultati Rappresentante Un rappresentante ERG è mostrata in figura 2A. La forma d&#39;onda rappresenta il riassunto elettricarisposta alla luce soprattutto delle cellule fotosensibile retinular, in quanto molto più numerosi delle cellule eccentrico e sono elettricamente accoppiate a loro. Non ci sono componenti delle forme d&#39;onda multiple da diversi tipi di cellule della retina dei mammiferi come con l&#39;ERG. Un feedback da un orologio circadiano nel cervello Limulus modula le proprietà fisiologiche delle cellule retiniche su base giornaliera, causando il corso ampiezza e l&#39;ora di ERG a variare nel tempo (1). Come mostrato nella Figura 2B, ERG ampiezza è più alto durante la notte soggettiva dell&#39;animale e più bassa durante il giorno soggettiva. Una traccia di rappresentante di una risposta ottica singola fibra nervosa alla luce è mostrata in Figura 3. Cellule eccentrico tutti si comportano o meno lo stesso, mostrando un aumento transitorio del tasso di scarico picco seguito da un decadimento di un livello sostenuto. Il tasso di decadimento riflette l&#39;azione combinata di adattamento alla luce e picco-dipendente di auto-inibizione sulle cellule eccentrico (2). Altri modelli di punta, come la luce-dipendenti della velocità, sono visti nel cervello Limulus, ma non l&#39;occhio (3). Tracce rappresentante della risposta di tensione di una cella cella di pigmento, cellula retinular, ed eccentrico alla luce sono mostrati in Figura 4. Solo gli ultimi due tipi di cellule della retina sono visive. Il corso ampiezza e l&#39;ora della loro risposta dipende dalla qualità della registrazione e la posizione degli elettrodi all&#39;interno della cellula. Di solito, l&#39;elettrodo penetra le cellule del pigmento o cellule retinular a causa delle loro grandi dimensioni e numero. In quest&#39;ultimo caso, una depolarizzazione transitoria che decade ad un livello sostenuto viene registrato. Il degrado è dovuto adattamento alla luce da parte delle cellule retinular (2). Se l&#39;elettrodo entra in una cellula eccentrico, potenziali d&#39;azione di grandi dimensioni sono registrati nel assone (40-70mV) e potenziali d&#39;azione piccola guida su una forma d&#39;onda depolarizzante (&lt;25 mV) in prossimità del soma. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Diagrammi di camere utilizzate per la registrazione di elettroretinogramma (A) e la registrazione del nervo ottico (B). Bar A è uguale a 7 mm e 5 mm in B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Traccia Esempio di ERG Limulus evocato da un impulso di 100ms LED 5V al buio (A) e il picco-picco fluttuazione in ampiezza ERG nel corso del tempo al buio costante (B). Tenebre è stato avviato al momento indicato dal triangolo bianco. La crescita in ERG ampiezza attraverso il tempo indicato dal triangolo nero è dovuta all&#39;adattamento luce, che aumenta la sensibilità degli occhi nel buio. La variazione ciclica in ERG ampiezza è successivamente a causa di orologio interno circadiano dell&#39;animale. Tempo punti in B sono ogni 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Traccia Esempio di una risposta delle fibre del nervo ottico a luce flash su un solo recettore ommatidial. Forma d&#39;onda al di sopra della traccia mostra tempismo stimolo. Cellule eccentrico, i cui assoni dare origine a fibre nervose, mostrano un modello simile di cottura in quanto alle condizioni di illuminazione dell&#39;esperimento (5sec lampo nel buio più totale). Codifica della retina con punte è una Limulus proprietà ha in comune con i mammiferi, a differenza di altri invertebrati. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="figura 4" /> Figura 4 tracce Esempio di risposta di tensione alla luce dei tre tipi di cellule presenti negli occhi Limulus laterale:. Cellule del pigmento (A), la cella retinular (B), e la cella eccentrico (C). La prima cella è non-visiva. Gli ultimi due depolarizzare su un lampo di luce. La depolarizzazione è il più grande per le cellule retinular perché trasdurre la luce e inviare il segnale attraverso giunzioni gap alla cella eccentrico, con qualche perdita lungo la strada. Nella cella eccentrico, potenziali d&#39;azione sparati da l&#39;assone si vedono a cavallo sulla depolarizzazione causa di backpropagation picco nel soma. L&#39;ampiezza dei potenziali d&#39;azione è stato attenuato in figura per una migliore visualizzazione del potenziale depolarizzante. Il potenziale di riposo delle cellule è-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Abbiamo mostrato come eseguire registrazioni ERG, registrazioni nervo ottico, e le registrazioni intraretinica di granchi a ferro di cavallo in vivo. Le tecniche di registrazione ogni fornire spunti diversi in base neurali della visione, e tutti possono essere utilizzati per studiare la funzione retinica in vivo gli animali grazie alle grandi occhi del granchio e carapace duro. L&#39;attività del nervo ottico può anche essere registrato dalle comportarsi liberamente gli animali in mare con la costruzione corretta degl...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

Il granchio americano a ferro di cavallo, Limulus Polifemo è una delle più antiche creature sulla terra, e l&#39;animale continua a svolgere un ruolo indispensabile nella ricerca biomedica. Non solo il loro sangue contiene cellule speciali che gli scienziati utilizzano per rilevare bacteriotoxins nei nostri farmaci, ma i loro occhi contengono anche una rete neurale che ha fornito informazioni molto di processi fisiologici che operano nel nostro sistema visivo, come ad esempio l&#39;adattamento alla luce e l&#39;inibizione laterale. Il granchio a ferro di cavallo rimane un modello interessante per la ricerca visione perché l&#39;animale è grande e resistente per un invertebrato, i suoi neuroni della retina sono grandi e facilmente accessibili, il suo sistema visivo è compatto e ampiamente studiato, e il suo comportamento visivo è ben definito. Inoltre, la struttura e la funzione degli occhi sono modulati su una base quotidiana da un orologio circadiano nel cervello l&#39;animale s. In breve, il sistema visivo dei granchi a ferro di cavallo è abbastanza semplice da essere capito ancora abbastanza complessa per essere interessante. In questo video vi presentiamo tre paradigmi elettrofisiologico per indagare le basi neurali della visione che possono essere eseguite in vivo con Limulus. Sono registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica. Elettroretinogramma (ERG) registrazioni misura con una superficie dell&#39;elettrodo la risposta elettrica riassunto di tutte le cellule negli occhi un lampo di luce. Possono essere utilizzati per monitorare la sensibilità complessiva del occhio per prolungare i periodi di tempo. Registrazioni nervo ottico misurare l&#39;attività incurvamento singole fibre nervose con un elettrodo extracellulare microsuction. Possono essere utilizzati per studiare messaggi visivi trasmessi dall&#39;occhio al cervello e-orologio circadiano messaggi reinserito dal cervello alla vista. Intraretinica misura registrazioni con microelettrodi intracellulari le fluttuazioni di tensione indotta dalla luce in singole cellule dell&#39;occhio. Possono essere usati per chiarire i meccanismi cellulari di elaborazione della retina.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research at JoVE.com

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

In questo video possiamo eseguire la registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica con il granchio americano a ferro di cavallo,<em&gt; Limulus Polifemo</em&gt;. Questi paradigmi elettrofisiologiche possono essere utilizzati per indagare le basi neurali della visione in un laboratorio di ricerca o insegnamento.

Utilizzando il Granchio Ferro di Cavallo, Limulus Polifemo, In Vision Research

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

using-the-horseshoe-crab-limulus-polyphemus-in-vision-research

Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K Views.  Boston University. In questo video possiamo eseguire la registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica con il granchio americano a ferro di cavallo, Limulus Polifemo. Questi paradigmi elettrofisiologiche possono essere utilizzati per indagare le basi neurali della visione in un laboratorio di ricerca o insegnamento.

Video: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Raccolta di sangue dal Granchio Ferro di Cavallo Americano, Limulus Polifemo

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Ricerca

Biologia

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

Cervello Banking: Utilizzare al meglio il vostro campioni di ricerca

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Misura di Smooth funzione muscolare nei isolato carta igienica-applicazioni Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...