Die Autoren bedanken sich bei Dr. Birgit Werner für ihre Hilfe bestätigen Sie mit der Erstellung dieses Video Artikel. Diese Arbeit wurde durch einen NSF Career Award finanziert.

Teil 1: Experimentelle Vorbereitung Experimentelle Verfahren auf Pfeilschwanzkrebse durchgeführt wurden vom Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Boston University genehmigt worden. Die Tiere sind von der Marine Biological Labs (Woods Hole, MA) oder ein anderer Verkäufer erworben und befindet sich in einem belüfteten Salzwassertank in einem Raum ausgesetzt zu einem geregelten Hell-Dunkel-Zyklus. Die Beleuchtung Regime ist zum Mitführen der Krabbe circadianen Uhr und Radfahren das Auge täglich zwischen seiner Tages-und Nachtzeit Staaten wichtig. Unmittelbar vor Beginn einer invasiven Verfahren wird das Tier in einem Eiskübel für 10-15 Minuten gekühlt, bis seine Bewegung verlangsamt und dann auf einer hölzernen Plattform gesichert mit zwei Schrauben aus Edelstahl in der Prosoma eingesetzt und zwei in den Hinterleib. Die Plattform ist unter mit Granit gewichtet, so dass es im Wasser versinkt. Nach Anschluss Experimenten wird das Tier durch Eintauchen in Eis Gülle wieder und Rückenmarkzerstörung des Gehirns, die oberhalb der Mündung liegt, mit einem Skalpell eingeschläfert. Teil 2: Lösungen Limulus Ringer-Lösung ist von 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50 &amp;mgr; TES, 50 &amp;mgr; HEPES und 10 ml / L Pen-Strep-Mix (Penicillin-Streptomycin, 10000 Einheiten / ml) zusammen . Teil 3: Elektroretinogramm Recording Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt eine Schraubenzieher, Vaseline, Ringer-Lösung, einer Transferpipette, eine grüne LED, eine Aufnahme Kammer, Schrauben aus Edelstahl und einem Wattestäbchen. <ol><li> Eine handgefertigte Kammer wird die ERG (Abbildung 1A) aufnehmen. Die Kammer Körper ist entworfen, um eine Kochsalzlösung Reservoir in Kontakt mit dem Auge zu halten. Der Deckel enthält eine Silberchlorid Draht zur Kopplung der leitende Lösung mit einem Verstärker und einem kleinen Loch so bemessen, dass eine LED aufnehmen. Eine ultrahelle mit Peak Emission um 520nm LED am besten funktioniert. </li><li> Um zu beginnen, ist die Unterseite der Kammer mit Vaseline beschichtet und gesichert über das Auge mit zwei Schrauben. </li><li> Die Kammer wird dann mit Kochsalzlösung gefüllt und verschlossen mit dem Deckel. </li><li> Nach Kammer Befestigung der Krebs ist in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist. </li><li> Die LED-Kabel wird in die Kammer Deckel eingefügt. </li><li> Das Signal führen ist, die Chlorid-Draht abgeschnitten, und der Verweis führt zu einer der implantierten Schrauben abgeschnitten. </li><li> Beide Leitungen sind auf den Kopf Stufe eines hochohmigen Differenzverstärker (X-cell 3x4, FHC Inc.) zur Signalverstärkung und der Verstärker-Filter gesetzt, um Frequenzen unterhalb 10Hz pass verbunden. </li><li> Der Verstärkerausgang ist an ein Oszilloskop für die Anzeige und einer Messkarte für Computer-Analyse und Speicherung zugeführt. </li><li> Nach der Einrichtung des Käfigs Tür geschlossen ist, um Platz Licht vom Erreichen des Tieres zu blockieren. </li><li> Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabView geschrieben gesammelt. Das Programm blinkt die LED, Aufzeichnungen der evozierten ERG-Signal, und misst die peak-to-Peak-Ansprechen Amplitude. Die Wahl des Flash-Paradigma ist abhängig von der experimentellen Ziel. Zum Beispiel angewendet einer kurzen (100ms) Puls von 5V alle 10 Minuten, um die LED verhindert Wirkung von Licht Anpassung bei der Überwachung von circadianen Veränderungen in Augenempfindlichkeit. </li></ol> Teil 4: Sehnerv Aufnahme Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt eine Schraubendreher, Faden, ein Trepan, Ringer-Lösung, Rongeure, Vannas Schere, eine Aufnahme Kammer, gebogene Pinzette, feinen Nadel-Sonden, ein stumpfes Skalpell, chirurgische Scheren, und eine Saug-Elektrode. <ol><li> Eine handgefertigte Kammer wird benutzt, um Sehnerv Reaktionen (Abbildung 1B) aufnehmen. Das Innere der Kammer ist 2cm Durchmesser offene gut, dass eine dünne halbrunden Schlitzöffnung in der unteren Wand, um den Nerv unterzubringen und zu isolieren, sie aus den umliegenden Gewebe. </li><li> Bevor Kammer Befestigung einer 16-Gauge-Nadel wird zwischen dem Scharnier Muskeln in das Herz eingeführt und ~ 20ml Blut aus dem Tier abgelassen. Blutleere ist nicht notwendig, sondern macht Sehnerv Dissektion leichter. </li><li> Die Lage des Sehnervs ist, indem sie auf den Panzer einer leicht gebogenen Linie zwischen den seitlichen und mittleren Augen geschätzt. </li><li> Ein kreisrundes Loch wird dann in den Panzer mit einem Trepan geschnitten. Das Loch ist den gleichen Durchmesser wie die Kammer gut. Die Mitte des Loches ist 2-3 cm vor dem lateralen Auge und etwas dorsal der Linie, so dass der Nerv entlang der ventralen Teil der gut verläuft. </li><li> Das Bindegewebe wird gelöscht, bis der Nerv vollständig sichtbar und frei von umgebenden und darunter liegende Gewebe. </li><li> Ein Strang der Thread um den Nerv geschlungen und zog in die Kammer durch den Schlitz an der Unterseite. Durch diese gleiche Öffnung der Nerv vorsichtig in die Kammer durch Ziehen an der Schnur geführt. Zur gleichen Zeit der Kammer ist gut in das Loch gesteckt. Die Kammer wird dann auf dem Panzer angebrachtmit Schrauben und der Brunnen ist mit Ringer-Lösung gefüllt. </li><li> Nach Kammer Befestigung des Tieres wird in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist. </li><li> Der Brunnen ist unter einem Stereoskop (SMZ-168, Jed Pella Inc.) und Baumwolle ist rund um die Öffnung im Boden gepolstert, um das Auslaufen von Blut in und Kochsalzlösung aus der Kammer zu verhindern visualisiert. </li><li> Residual Bindegewebe um die Nerven mit einer feinen Schere und Pinzette entfernt und die Kammer wird mit frischem Ringer-Lösung aufgefüllt. </li><li> Ein nick ist in das Blutgefäß, dass der Nerv kapselt und durch diese Öffnung der Nerv sorgfältig entlang seiner Länge mit einer feinen Schere, Pinzette und Nadel-Sonden desheathed gemacht. </li><li> Ein winziges Faserbündel vom Nerv mit der Sonde und Schnitt am Ende am weitesten vom Auge für afferente Faser Aufnahme und am Ende am nächsten an das Auge für efferente Faser Aufnahme getrennt. In dem Video das Ende für afferente Faser-Aufnahmen geschnitten wird. </li><li> Ein microsuction Elektrode (AM Systems Inc) mit Ringer-Lösung gefüllt ist für Sehnerv Aufnahme verwendet. Die Elektrodenspitze ist es, die Nerven-Bündel von Feuerpolitur Ende einer 1mm Durchmesser Borosilikatglas Kapillare ausgestattet. </li><li> Die Elektrodenspitze wird in die Kammer auch mit einem manuellen Manipulator (WPI Inc) gesenkt, und der Schnitt Faserbündel in die Spitze gesaugt. Saug wird durch eine Gilmont Spritze verbunden mit der Elektrode über Schläuche zur Verfügung gestellt. </li><li> Ein BNC-Anschluss bietet die Signalleitung und eine Silberchlorid Draht um die Elektrode herum gewickelt, um Lärm zu reduzieren bietet die Referenz führen. Die beiden Leitungen sind an den Kopf der Bühne eines Differenzverstärkers zur Signalverstärkung und Rauschfilter (X-cell 3x4, FHC Inc.) verbunden. Der Verstärkerausgang ist an ein Oszilloskop für die Anzeige und eine Messkarte für Computer-Analyse und Speicherung an. </li><li> Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabView geschrieben gesammelt. Das Programm steuert Lichtreize über einen digitalen Video-Prozessor (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) und Schnittstellen mit einer digitalen spike Diskriminator (APM, FHC Inc.), die Spike-Datensätze. Das Licht kann auf einzelne Zellen in das Auge über ein Glasfaserkabel Lichtleiter oder das gesamte Auge geliefert über einen Computer-gesteuerten Video-Display. </li></ol> Teil 5: intraretinale Aufnahme Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt gehören ein Schraubenzieher, ein L-förmiges Lucite-Plattform mit Gewindebohrungen, einer Mikroelektrode Halter mit einer Glaspipette, Schrauben aus Edelstahl, eine Pinzette und eine feine Skalpell. <ol><li> Eine handgefertigte Lucite-Platte mit voreingestellten Schraubenlöcher wird verwendet, um intrazelluläre Reaktionen aufzuzeichnen. Die Löcher sind für die Montage eines motorisierten Mikromanipulator (PPM5000, WPI Inc) angeordnet. Die Platte wird das Tier mit zwei Schrauben an der Seite und einer auf der Oberseite angebracht. </li><li> Nach Plattenbefestigung das Tier ist in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist. </li><li> Die micropositioner ist in der Platte verschraubt, mit seinem beweglichen Arm über dem Auge ausgerichtet. </li><li> Eine Charge von Glasmikropipetten sind aus 1-mm OD Borosilikatglas gezogen und die Spitzen sind durch Kapillarwirkung, indem Sie die Mikropipetten in einem kleinen Fläschchen mit 3M KCl-Lösung aufgefüllt. </li><li> Der Rest der Pipetten werden dann manuell mit der Salzlösung gefüllt und in einen Elektrodenhalter. </li><li> Der Elektrodenhalter ist auf den Kopf Stufe eines intrazellulären Verstärker (IR-283, Cygnus Technology Inc) angebracht, die micropositioner Arm verbunden. </li><li> Ein winziger Teil der Netzhaut (~ 1mm2) wird durch Wegschneiden der Hornhaut-Schnittstelle mit einer Rasierklinge ausgesetzt. </li><li> Ein Tropfen Ringer-Lösung basiert auf der Netzhaut platziert ausgesetzt Trocknung zu verhindern und die Mikropipette Spitze ist durch die Öffnung in Netzhautgewebe fortgeschritten. </li><li> Wenn die Spitze der Lösung eintritt, wird die Stromeinspeisung Modus des intrazellulären Verstärker engagiert und Elektrodenimpedanz gemessen. Mikropipetten mit einer Impedanz außerhalb des Bereichs von 20-70 MW werden verworfen. Wer in diesem Bereich sind in Mikron Schritte fortschrittliche und spießte in Zellen durch Vibrieren der Pipettenspitze elektronisch oder mechanisch. </li><li> Drei Arten von Zellen im Auge auftreten. Retinular Zellen zeigen nur eine depolarisierende Reaktion auf Licht, zeigen exzentrischen Zellen ein Zug der Aktionspotentiale reitet auf einem depolarisierenden Antwort, und Pigmentzellen zeigen keine leichte Reaktion. </li><li> Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabVIEW geschrieben gesammelt. Das Programm steuert Lichtreize über einen digitalen Video-Prozessor (Bits + +, Cambridge Research Systems). Die Reize werden aufgespießt Zellen mit einem Glasfaser-Rohr-oder Video-Display ausgeliefert. Spannung Antworten sind auf dem Oszilloskop beobachtet und digitalisiert das Programm auf den Computer. </li></ol> Teil 6: Repräsentative Ergebnisse Ein Vertreter ERG ist in Abbildung 2a dargestellt. Die Wellenform stellt die summierten elektrischenReaktion auf Licht in erster Linie die photorezeptorischen retinular Zellen sind, wie sie wesentlich mehr Männer als die exzentrische Zellen und diesen elektrisch gekoppelt. Es gibt nicht mehrere Wellenform Komponenten aus verschiedenen retinalen Zelltypen wie bei den Säugetieren ERG. Circadian Feedback von einer Uhr in der Limulus Gehirn moduliert die physiologischen Eigenschaften der Zellen der Netzhaut auf einer täglichen Basis, wodurch die Amplitude und Zeitverlauf der ERG im Laufe der Zeit (1) variieren. Wie in Abbildung 2B gezeigt, ist ERG Amplitude am höchsten während des Tieres subjektiven Nacht und am niedrigsten bei der subjektiven Tag. Ein Vertreter Spur von einer einzigen optischen Nervenfasern Reaktion auf Licht ist in Abbildung 3 dargestellt. Exzentrische alle Zellen verhalten sich in etwa die gleichen, die eine vorübergehende Erhöhung der Spike-Fördermenge durch einen Zerfall zu einer nachhaltigen Niveau folgte. Die Rate Zerfall spiegelt die kombinierte Wirkung von Licht Anpassung und Spike-abhängige Selbst-Hemmung auf exzentrischen Zellen (2). Andere Spike-Muster, wie Licht-abhängige Abnahme der Geschwindigkeit, in der Limulus Gehirn gesehen, aber nicht das Auge (3). Vertreter Spuren der Spannung Reaktion eines Pigments Zelle, retinular Zelle und exzentrischen Zelle Licht sind in Abbildung 4 dargestellt. Nur die beiden letztgenannten retinalen Zelltypen sind visuell. Die Amplitude und Zeitverlauf der Reaktion hängt von der Qualität der Aufnahme und die Lage der Elektrode in der Zelle. Normalerweise dringt die Elektrode Pigmentzellen oder retinular Zellen aufgrund ihrer großen Anzahl und Größe. Wenn das letztere, eine vorübergehende Depolarisation, die zu einem nachhaltigen Niveau abfällt wird aufgezeichnet. Der Zerfall wird durch Helladaptation durch retinular Zellen (2). Wenn die Elektrode tritt eine exzentrische Zelle, sind groß Aktionspotentiale im Axon (40-70mV) und kleine Aktionspotentiale reitet auf einem depolarisierenden Wellenform (&lt;25mV) in der Nähe des Soma aufgezeichnet. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellungen der Kammern für Elektroretinogramm Aufnahme (A) und Sehnerv-Aufnahme (B) verwendet. Bar gleich 7mm in A und 5mm in B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiel Spur eines Limulus ERG durch ein 100ms evozierte LED-Puls von 5V im Dunkeln (A) und der Peak-to-peak Fluktuation in ERG Amplitude über die Zeit in konstanter Dunkelheit (B). Dunkel war die damals von den weißen Dreieck angezeigt eingeleitet. Das Wachstum in ERG Amplitude über die Zeit von der schwarzen Dreieck gekennzeichnet ist durch geringes Anpassung, die Augenempfindlichkeit steigt in der Dunkelheit. Die zyklischen Schwankungen in ERG Amplitude danach ist aufgrund des Tieres internen zirkadianen Uhr. Zeitpunkten in B sind alle 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Beispiel Spur eines Sehnervs Faser Antwort auf eine einzige ommatidial Rezeptor blitzte Licht. Waveform oberhalb der Kurve zeigt Reiz Timing. Exzentrische Zellen, deren Axone führen zu Nervenfasern, die alle zeigen ein ähnliches Muster von Feuern, wie dies unter den Lichtverhältnissen des Experiments (5sec Blitz in völliger Dunkelheit). Retinal-Codierung mit Spikes ist eine Eigenschaft Limulus hat gemeinsam mit Säugetieren, im Gegensatz zu anderen Wirbellosen. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4 Beispiel Spuren von der Spannung als Reaktion auf die drei Zelltypen im Limulus lateral Auge Licht:. Pigment-Zelle (A), retinular Zelle (B), und exzentrische Zelle (C). Die erste Zelle ist nicht-visuelle. Die beiden letzteren auf einen Lichtblitz depolarisieren. Die Depolarisation ist das größte für retinular Zellen, weil sie das Licht transduzieren und senden das Signal über Gap Junctions, um den exzentrischen Zelle, mit einem gewissen Verlust auf dem Weg. In der exzentrischen Zelle werden Aktionspotentiale durch das Axon abgefeuert gesehen Reiten auf die Depolarisation durch spike Backpropagation in den Soma. Die Amplitude der Aktionspotentiale wurde in der Abbildung gedämpft für eine bessere Anzeige des depolarisierenden Potential. Das Ruhepotential der Zellen-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Wir haben gezeigt, wie man ERG-Aufnahmen, Sehnerv-Aufnahmen und intraretinale Aufnahmen auf Pfeilschwanzkrebse in vivo durchzuführen. Die Aufnahme-Techniken bieten jeweils unterschiedliche Einblicke in die neuronalen Grundlagen des Sehens, und sie können alle verwendet werden, um die Funktion der Retina in lebenden Tieren durch die Krabbe große Augen und harten Panzer zu studieren. Sehnerv Aktivität kann auch von frei lebenden Tier in den Ozean mit der richtigen Konstruktion der Elektroden (4) aufgenommen werden. Di...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

Der amerikanische Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus ist eines der ältesten Lebewesen auf der Erde, und das Tier weiterhin eine unverzichtbare Rolle in der biomedizinischen Forschung spielen. Nicht nur, dass ihr Blut enthält spezielle Zellen, die Wissenschaftler nutzen, um bacteriotoxins in unserer Medikamente zu erkennen, aber ihre Augen auch ein neuronales Netz, das viele Einblicke in Ihre physiologische Prozesse, die in unser visuelles System, wie Licht Anpassung und laterale Inhibition zur Verfügung gestellt hat. Die Pfeilschwanzkrebses bleibt ein attraktives Modell für Vision Forschung, weil das Tier ist groß und robust für ein Wirbellosen, seine Netzhautneuronen groß und leicht zugänglich sind, ist seine visuelle System kompakt und umfassend untersucht, und seine visuelle Verhalten ist gut definiert. Darüber hinaus sind die Struktur und Funktion der Augen moduliert auf einer täglichen Basis von einem circadianen Uhr in der Tier-s Gehirn. Kurz gesagt, ist das visuelle System des Pfeilschwanzkrebse einfach genug, um noch verstanden werden komplex genug, um interessant sein. In diesem Video stellen wir Ihnen drei elektrophysiologischen Paradigmen zur Untersuchung der neuronalen Grundlagen der Vision, die in vivo mit Limulus durchgeführt werden kann. Sie sind Elektroretinogramm Aufnahme, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme. Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen Maßnahme mit einer Fläche Elektrode der summierten elektrischen Reaktion aller Zellen im Auge, um einen Lichtblitz. Sie können verwendet werden, um die allgemeine Empfindlichkeit des Auges für verlängern Zeiträume zu überwachen. Sehnerv Aufnahmen messen spiking Aktivität einzelner Nervenfasern mit einer extrazellulären microsuction Elektrode. Sie können zur visuellen Botschaften vermittelt vom Auge an das Gehirn sowie circadiane Uhr Nachrichten zurück aus dem Gehirn zum Auge geführt zu studieren. Intraretinale Aufnahmen Maßnahme mit einer intrazellulären Mikroelektrode die Spannungsschwankungen durch Licht in einzelne Zellen des Auges ausgelöst. Sie können verwendet werden, um zelluläre Mechanismen der retinalen Verarbeitung aufzuklären.

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Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

In diesem Video führen wir Elektroretinogramm Aufnahme, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme mit dem amerikanischen Pfeilschwanzkrebs<em&gt; Limulus Polyphemus</em&gt;. Diese elektrophysiologischen Paradigmen können für die Untersuchung der neuronalen Grundlagen des Sehens in der Forschung oder Lehre Labor verwendet werden.

Mit den Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, In Vision Research

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K Aufrufe.  Boston University. In diesem Video führen wir Elektroretinogramm Aufnahme, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme mit dem amerikanischen Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus. Diese elektrophysiologischen Paradigmen können für die Untersuchung der neuronalen Grundlagen des Sehens in der Forschung oder Lehre Labor verwendet werden.

Serie: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Blutentnahme aus der amerikanischen Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

TEM-Workflows, Ergebnisanalyse und Datenmanagement mit einem Machine-Vision-Ansatz

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Autor im Rampenlicht: Ein Machine-Vision-Ansatz für Arbeitsabläufe in der Transmissionselektronenmikroskopie, Ergebnisanalyse und Datenmanagement  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.

Ein Machine-Vision-Ansatz für Transmissionselektronenmikroskopie-Workflows, Ergebnisanalyse und Datenmanagement

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the protocol is to emphasize the correct techniques used in a research laboratory to prevent contamination from fungi and bacteria. Special emphasis is placed on avoiding mycoplasma contamination, a major concern in the cell culture room due to its small size and resistance to most antibiotics used for cell culture. These same techniques ensure continuous growth and maintain healthy cells. For new and experienced cell culture users alike, it&#8217;s important to consistently adhere to these best practices to mitigate the risk of contamination. Once a year, laboratories should review cell culture best practices and follow-up with a discussion or additional training if needed. Taking early action to prevent contamination in the first place will save time and money, as compared to cleaning up after contamination occurs. Universal best practices keep cell cultures healthy, thereby reducing the need to constantly thaw new cells, purchase expensive cell culture media, and reducing the amount of incubator decontamination and downtime.&#160;

This protocol presents essential cell culture techniques and practices to be used in the research cell culture laboratory to avoid contamination by fungi and bacteria. Within the category of bacteria, special emphasis will be placed on preventing mycoplasma contamination.&#160;&#160;

Zellkulturtechniken und -praktiken zur Vermeidung von Kontaminationen durch Pilze und Bakterien im Forschungszellkulturlabor

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...