Les auteurs tiennent à remercier Dr. Birgit Werner pour son aide à la production de cet article vidéo. Cette recherche a été financée par une bourse de carrière NSF.

Partie 1: Préparation expérimentale Les procédures expérimentales réalisées sur les limules ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation à l&#39;Université de Boston. Les animaux sont achetés sur le Labs de biologie marine (Woods Hole, MA) ou d&#39;autres fournisseurs et logés dans un réservoir d&#39;eau salée dans une pièce aérée exposés à un marché réglementé cycle lumière-obscurité. Le schéma d&#39;éclairage est important pour entraîner l&#39;horloge circadienne du crabe et du vélo l&#39;oeil quotidiens entre ses Etats diurnes et nocturnes. Immédiatement avant de commencer toute procédure invasive, l&#39;animal est refroidie dans un seau à glace pendant 10-15 minutes jusqu&#39;à ce que son mouvement est ralenti et alors fixé à une plate-forme en bois avec deux vis en acier inoxydable inséré dans le prosoma et deux dans la opisthosome. La plateforme est pondérée en dessous avec le granit afin qu&#39;il s&#39;enfonce dans l&#39;eau. Après des expériences terminal de l&#39;animal est euthanasié en plongeant dans les coulis de glace à nouveau et jonchage le cerveau, qui se trouve au dessus de la bouche, avec un scalpel. Partie 2: Solutions Solution de Limulus Ringer est composé de 430 mM de NaCl, 9,56 mM de KCl, 9,52 mM de CaCl2, 9,97 mM de MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50 microns TES, HEPES 50 microns, et 10ml / L Pen-Strep mélange (pénicilline-streptomycine, 10000 unités / ml) . Partie 3: Enregistrement Électrorétinogramme Outils nécessaires pour cette procédure comprennent un tournevis, de la vaseline, la solution de Ringer, une pipette de transfert, une LED verte, une chambre d&#39;enregistrement, des vis en acier inoxydable, et un coton-tige. <ol><li> Une chambre de la main est utilisée pour enregistrer l&#39;ERG (figure 1A). Le corps de la chambre est conçue pour contenir un réservoir salin en contact avec les yeux. Le couvercle contient un fil de chlorure d&#39;argent pour le couplage de la solution conductrice à un amplificateur et un trou de petite taille pour accueillir une LED. Un ultrabrillant LED avec émission de pic autour 520nm fonctionne le mieux. </li><li> Pour commencer, la face inférieure de la chambre est recouvert avec de la vaseline et sécurisé sur l&#39;œil avec deux vis. </li><li> La chambre est alors remplie avec une solution saline et plafonné avec le couvercle. </li><li> Après fixation de chambre le crabe est placé dans une cage étanche à la lumière dans un réservoir rempli d&#39;eau de mer sur les branchies. </li><li> Le câble de LED est inséré dans le couvercle de la chambre. </li><li> Le câble de signal est coupé sur le fil du chlorure, et le plomb de référence est accroché à l&#39;un des vis implantées. </li><li> Les deux fils sont connectés à l&#39;étape de la tête d&#39;un amplificateur différentiel à haute impédance (X-cell 3x4, Inc FHC) pour l&#39;amplification du signal et le filtre amplificateur est réglé pour passer les fréquences inférieures à 10Hz. </li><li> La sortie de l&#39;amplificateur est alimenté à un oscilloscope pour la visualisation et à une carte d&#39;acquisition de données pour l&#39;analyse informatique et du stockage. </li><li> Après l&#39;installation de la porte de la cage est fermée pour bloquer la lumière ambiante d&#39;atteindre l&#39;animal. </li><li> Les données sont recueillies avec un programme personnalisé écrites dans LabVIEW. Le programme fait clignoter le voyant, les dossiers de l&#39;ERG a évoqué le signal, et les mesures de l&#39;amplitude de la réponse de crête à crête. Le choix du paradigme éclair dépend de l&#39;objectif expérimental. Par exemple, une brève description (100ms) impulsions de 5V appliquée toutes les 10 minutes à la LED évite les effets de l&#39;adaptation à la lumière lors de la surveillance des changements circadiens de la sensibilité des yeux. </li></ol> Partie 4: enregistrement du nerf optique Outils nécessaires pour cette procédure comprennent un tournevis, fil, un trépan, la solution de Ringer, rongeurs, des ciseaux Vannas, une chambre d&#39;enregistrement, des pinces courbes, des sondes aiguille fine, une sourde scalpel, ciseaux chirurgicaux, et une électrode de succion. <ol><li> Une chambre de la main est utilisée pour enregistrer les réponses du nerf optique (figure 1B). L&#39;intérieur de la chambre est de 2cm de diamètre et ouvert qui a une mince ouverture semi-circulaire à fente dans le mur en bas pour accueillir le nerf et l&#39;isoler du tissu environnant. </li><li> Avant l&#39;attachement de chambre d&#39;une aiguille de calibre 16 est inséré entre les muscles de charnière dans le cœur et ~ 20cc de sang est drainé par l&#39;animal. Exsanguination n&#39;est pas nécessaire, mais rend la dissection du nerf optique plus facile. </li><li> L&#39;emplacement du nerf optique est estimé, en s&#39;appuyant sur la carapace d&#39;une ligne légèrement courbée entre les yeux latéraux et médians. </li><li> Un trou circulaire est alors coupé de la carapace avec un trépan. Le trou est le même diamètre que la chambre bien. Le centre du trou est situé à 2-3 cm en avant de l&#39;œil latéral et légèrement dorsale à la ligne de sorte que le nerf longe la partie ventrale du puits. </li><li> Le tissu conjonctif est effacé jusqu&#39;à ce que le nerf est entièrement visible et libre de environnantes et qui sous-tendent le tissu. </li><li> Un brin de fil est bouclé autour du nerf et a tiré dans la chambre à travers la fente au fond. Grâce à cette même ouverture le nerf est doucement guidé dans la chambre en tirant sur la ficelle. Dans le même temps la chambre est bien insérée dans le trou. La chambre est alors apposée sur la carapaceavec des vis et le puits est rempli d&#39;une solution de Ringer. </li><li> Après fixation de chambre de l&#39;animal est placé dans une cage étanche à la lumière dans un réservoir rempli d&#39;eau de mer sur les branchies. </li><li> Le puits est visualisé sous un stéréoscope (SMZ-168, Jed Pella Inc) et le coton est rembourré autour de l&#39;ouverture dans le fond pour empêcher la fuite de sang dans une solution saline et hors de la chambre. </li><li> Résiduelle de tissu conjonctif autour du nerf est enlevé avec des ciseaux et des pinces fines, et la chambre est remplie avec une solution de Ringer fraîches. </li><li> Une incision est faite dans le vaisseau sanguin qui encapsule le nerf et par cette ouverture le nerf est soigneusement desheathed sur toute sa longueur à l&#39;aide de ciseaux fins, pince à épiler, et les sondes à aiguilles. </li><li> Un faisceau de fibres minuscules est séparé du nerf à l&#39;aide de la sonde et coupé à l&#39;extrémité opposée de l&#39;œil pour l&#39;enregistrement des fibres afférentes et à l&#39;extrémité la plus proche de l&#39;œil pour l&#39;enregistrement des fibres efférentes. Dans la vidéo à la fin des enregistrements fibre afférente est coupé. </li><li> Une électrode de micro-aspiration (AM Systems Inc), rempli de solution de Ringer est utilisé pour l&#39;enregistrement du nerf optique. L&#39;extrémité de l&#39;électrode est montée sur le faisceau nerveux par le feu polissage de l&#39;extrémité d&#39;un verre de borosilicate 1 mm de diamètre capillaire. </li><li> L&#39;extrémité de l&#39;électrode est descendue dans la chambre bien avec un manipulateur manuel (WPI Inc) et le faisceau de fibres coupées est aspiré dans l&#39;embout. L&#39;aspiration est fournie par une seringue Gilmont reliée à l&#39;électrode via un tube. </li><li> Une connexion BNC fournit le câble de signal et un fil de chlorure d&#39;argent enveloppé autour de l&#39;électrode pour réduire le bruit fournit le fil de référence. Les deux fils sont connectés à l&#39;étape de la tête d&#39;un amplificateur différentiel pour l&#39;amplification du signal et de filtrage du bruit (X-cell 3x4, FHC Inc.) La sortie de l&#39;amplificateur est envoyé à un oscilloscope pour la visualisation et une carte d&#39;acquisition de données pour l&#39;analyse de l&#39;ordinateur et le stockage. </li><li> Les données sont recueillies avec un programme personnalisé écrites dans LabVIEW. Le programme de contrôle des stimuli lumineux via un processeur vidéo numérique (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) et les interfaces avec un discriminateur numériques pic (APM, Inc FHC) qui enregistre les trains pic. La lumière peut être livré à des cellules individuelles dans l&#39;oeil via un conduit de lumière en fibre optique ou à l&#39;œil entier via un écran vidéo contrôlé par ordinateur. </li></ol> Partie 5: enregistrement intrarétiniennes Outils nécessaires pour cette procédure comprennent un tournevis, une forme de L avec la plate-forme de lucite trous filetés, un porte-microélectrode avec une pipette en verre, des vis en acier inoxydable, des pincettes et un scalpel bien. <ol><li> Une plaque à la main avec trous de vis lucite prédéfini est utilisé pour enregistrer les réponses intracellulaires. Les trous sont espacés pour le montage d&#39;un micromanipulateur motorisé (PPM5000, WPI Inc.) La plaque est fixée sur l&#39;animal avec deux vis sur le côté et une sur le dessus. </li><li> Après fixation de la plaque de l&#39;animal est placé dans une cage étanche à la lumière dans un réservoir rempli d&#39;eau de mer sur les branchies. </li><li> Le micropositionneur est vissé dans la plaque, avec son bras mobile alignée sur l&#39;œil. </li><li> Un lot de micropipettes de verre sont tirés de 1 mm OD verre borosilicate et les conseils sont remblayés par capillarité en plaçant les micropipettes dans un petit flacon de solution 3M KCl. </li><li> Le reste des pipettes sont ensuite remplies manuellement avec la solution de sel et inséré dans un porte-électrode. </li><li> Le porte-électrode est connectée à l&#39;étape de la tête d&#39;un amplificateur intracellulaire (IR-283, Cygnus Technology Inc) apposé sur le bras micropositionneur. </li><li> Une petite section de la rétine (~ 1mm2) est exposée en coupant l&#39;interface de la cornée avec une lame de rasoir. </li><li> Une goutte de solution de Ringer est placé sur la rétine exposée à prévenir le dessèchement et la pointe micropipette est avancé par l&#39;ouverture dans le tissu rétinien. </li><li> Lorsque la pointe pénètre dans la solution, le mode d&#39;injection de courant de l&#39;amplificateur intracellulaire est engagé et l&#39;impédance de l&#39;électrode est mesuré. Micropipettes avec une impédance de l&#39;extérieur de la gamme de 20-70 MW sont jetés. Ceux de cette gamme sont avancés dans les étapes micron et empalé dans les cellules en vibrant la pipette électronique ou mécanique. </li><li> Trois types de cellules peuvent être rencontrés dans l&#39;œil. Cellules Retinular montrent seulement une réponse à la dépolarisation de lumière, les cellules excentriques montrent un train de potentiels d&#39;action à cheval sur une réponse dépolarisant, et des cellules pigmentaires ne montrent pas de réponse à la lumière du tout. </li><li> Les données sont recueillies avec un programme personnalisé écrit en Labview. Le programme de contrôle des stimuli lumineux via un processeur vidéo numérique (Bits + +, Cambridge Research Systems). Les stimuli sont livrés à des cellules empalé avec un tuyau en fibre optique ou écran vidéo. Tension réponses sont observées sur l&#39;oscilloscope et numérisées par le programme d&#39;ordinateur. </li></ol> Partie 6: Résultats Représentant Un représentant du GRE est montré dans la figure 2A. La forme d&#39;onde représente la résumer électriquesréponse à la lumière des cellules photoréceptrices principalement retinular, car ils sont beaucoup plus nombreux les cellules excentrique et sont couplés électriquement pour eux. Il n&#39;ya pas de forme d&#39;onde multiples composants de différents types de cellules rétiniennes comme avec les mammifères ERG. Rétroaction circadien d&#39;une horloge dans le cerveau Limulus module les propriétés physiologiques des cellules de la rétine sur une base quotidienne, ce qui provoque le cours amplitude et de temps de l&#39;ERG à varier au fil du temps (1). Comme le montre la figure 2B, l&#39;ERG d&#39;amplitude est plus élevée pendant la nuit subjective de l&#39;animal le plus faible et pendant la journée subjectif. Une trace représentant d&#39;une réponse unique nerf optique de fibre à la lumière est montré dans la figure 3. Excentrique cellules se comportent tous sensiblement la même, montrant une augmentation transitoire de débit pic suivi d&#39;une décroissance à un niveau soutenu. La décroissance taux reflète l&#39;action combinée de la lumière et l&#39;adaptation pic-dépendante auto-inhibition sur les cellules excentrique (2). Autres modèles de pointe, tels que dépendant de la lumière diminue dans les taux, sont observées dans le cerveau Limulus mais pas l&#39;œil (3). Représentant des traces de la réponse en tension d&#39;une cellule de la cellule pigmentaire, cellules retinular, excentrique et à la lumière sont présentés dans la figure 4. Seuls les deux derniers types de cellules rétiniennes sont visuelles. Le cours d&#39;amplitude et le temps de leur réponse dépend de la qualité de l&#39;enregistrement et l&#39;emplacement de l&#39;électrode dans la cellule. Habituellement, l&#39;électrode pénètre dans les cellules pigmentaires ou les cellules retinular raison de leur grande taille et en nombre. Si celle-ci, une dépolarisation transitoire qui se désintègre à un niveau soutenu est enregistrée. La décroissance est due à l&#39;adaptation de lumière par les cellules retinular (2). Si l&#39;électrode rentre dans une cellule excentriques, des potentiels d&#39;action grandes sont enregistrées dans l&#39;axone (40-70mV) et les potentiels d&#39;action de petites cheval sur une forme d&#39;onde de dépolarisation (&lt;25mV), près du soma. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schémas des chambres utilisées pour l&#39;enregistrement de l&#39;électrorétinogramme (A) et l&#39;enregistrement du nerf optique (B). Bar équivaut à 7mm en A et en B. 5mm <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Exemple d&#39;un oligo-ERG Limulus évoquée par une LED 100ms pouls de 5V dans le noir (A) et la fluctuation de pic à pic dans l&#39;ERG d&#39;amplitude au fil du temps dans l&#39;obscurité constante (B). L&#39;obscurité a été initié à l&#39;heure indiquée par le triangle blanc. La croissance de l&#39;ERG d&#39;amplitude à travers le temps indiqué par le triangle noir est due à l&#39;adaptation de lumière, ce qui augmente la sensibilité des yeux dans l&#39;obscurité. La variation cyclique dans l&#39;ERG amplitude est par la suite, en raison d&#39;interne de l&#39;animal horloge circadienne. Temps de points dans B sont toutes les 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Oligo Exemple d&#39;une réponse des fibres du nerf optique à la lumière flashé sur un seul récepteur ommatidial. Waveform-dessus de la trace montre le calendrier de relance. Cellules excentrique, dont les axones donner lieu à des fibres nerveuses, tous montrent une tendance similaire de la cuisson car cela sous les conditions d&#39;illumination de l&#39;expérience (5sec flash dans l&#39;obscurité totale). Codage de la rétine avec des pointes est une limule propriété a en commun avec les mammifères, contrairement à d&#39;autres invertébrés. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4 Exemple de traces de la réponse en tension à la lumière des trois types de cellules présentes dans l&#39;œil de Limulus latéraux:. Cellule pigmentaire (A), la cellule retinular (B), et la cellule excentrique (C). La première cellule est non-visuels. Les deux derniers dépolariser sur un flash de lumière. La dépolarisation est plus important pour les cellules retinular parce qu&#39;ils transduire la lumière et d&#39;envoyer le signal à travers des jonctions communicantes dans la cellule excentrique, avec une certaine perte le long du chemin. Dans la cellule excentriques, des potentiels d&#39;action tiré par l&#39;axone sont vus à cheval sur la dépolarisation due à rétropropagation pointe dans le soma. L&#39;amplitude des potentiels d&#39;action a été atténuée dans la figure pour une meilleure visualisation du potentiel dépolarisants. Le potentiel de repos des cellules est-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Nous avons illustré comment effectuer des enregistrements ERG, les enregistrements du nerf optique, et les enregistrements sur les limules intrarétinienne in vivo. Les techniques d&#39;enregistrement de chaque fournir des indications différentes dans les bases neurales de la vision, et elles peuvent toutes être utilisées pour étudier la fonction rétinienne chez les animaux vivants grâce aux grands yeux du crabe et de la carapace dure. L&#39;activité du nerf optique peuvent même être enregistrés à partir lib...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

Le crabe fer à cheval, américains, Limulus Polyphemus est l&#39;une des plus anciennes créatures sur terre, et l&#39;animal continue à jouer un rôle indispensable dans la recherche biomédicale. Non seulement leur sang contient des cellules spéciales que les scientifiques utilisent pour détecter bacteriotoxins dans nos médicaments, mais leurs yeux contiennent également un réseau de neurones qui a donné un aperçu beaucoup plus sur les processus physiologiques de fonctionnement de notre système visuel, tels que l&#39;adaptation de lumière et de l&#39;inhibition latérale. La limule reste un modèle attractif pour la recherche de vision parce que l&#39;animal est grand et robuste pour un invertébré, ses neurones rétiniens sont grandes et facilement accessible, son système visuel est compact et largement étudié, et son comportement visuel est bien définie. Par ailleurs, la structure et la fonction des yeux sont modulés sur une base quotidienne par une horloge circadienne dans le cerveau de l&#39;animal s. En bref, le système visuel des limules est assez simple pour être compris encore suffisamment complexe pour être intéressant. Dans cette vidéo, nous présentons trois paradigmes électrophysiologique pour étudier les bases neurales de la vision qui peut être effectuée in vivo avec limule. Ils sont l&#39;enregistrement électrorétinogramme, l&#39;enregistrement du nerf optique, et l&#39;enregistrement intrarétinienne. Électrorétinogramme (ERG) des enregistrements de mesurer avec une surface de l&#39;électrode de la réponse électrique de résumer toutes les cellules de l&#39;œil à un flash de lumière. Ils peuvent être utilisés pour contrôler la sensibilité globale de l&#39;oeil pour prolonger les périodes de temps. Enregistrements du nerf optique de mesurer l&#39;activité de dopage de fibres nerveuses unique avec une électrode extracellulaire micro-aspiration. Ils peuvent être utilisés pour étudier des messages visuels transmis de l&#39;oeil au cerveau ainsi que l&#39;horloge circadienne-messages renvoyés par le cerveau à l&#39;œil. Intrarétinienne mesure des enregistrements avec une microélectrode intracellulaire des fluctuations de la tension induite par la lumière dans des cellules individuelles de l&#39;œil. Ils peuvent être utilisés pour élucider les mécanismes cellulaires de la rétine de traitement.

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Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Dans cette vidéo, nous effectuons l&#39;enregistrement électrorétinogramme, l&#39;enregistrement du nerf optique, et l&#39;enregistrement intrarétinienne avec le crabe fer à cheval, américains,<em&gt; Limulus Polyphemus</em&gt;. Ces paradigmes électrophysiologiques peuvent être utilisées pour étudier les bases neurales de la vision dans un laboratoire de recherche ou d&#39;enseignement.

Utilisation de la limule, Limulus Polyphemus, En recherche sur la vision

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K vues.  Boston University. Dans cette vidéo, nous effectuons l'enregistrement électrorétinogramme, l'enregistrement du nerf optique, et l'enregistrement intrarétinienne avec le crabe fer à cheval, américains, Limulus Polyphemus. Ces paradigmes électrophysiologiques peuvent être utilisées pour étudier les bases neurales de la vision dans un laboratoire de recherche ou d'enseignement.

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Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Collecte de sang du crabe américaine Horseshoe, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Recherche

Biologie

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Préparation d’échantillons pour le profilage métabolique à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Détermination de la toxicité du rayonnement UV et des produits chimiques sur les cellules épithéliales cornéennes humaines primaires et immortalisées

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Flux de travail TEM, analyse des résultats et gestion des données à l’aide d’une approche de vision industrielle

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Pleins feux sur l’auteur : Une approche de vision industrielle pour les flux de travail de microscopie électronique à transmission, l’analyse des résultats et la gestion des données  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.

Une approche de vision industrielle pour les flux de travail de microscopie électronique à transmission, l’analyse des résultats et la gestion des données

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the protocol is to emphasize the correct techniques used in a research laboratory to prevent contamination from fungi and bacteria. Special emphasis is placed on avoiding mycoplasma contamination, a major concern in the cell culture room due to its small size and resistance to most antibiotics used for cell culture. These same techniques ensure continuous growth and maintain healthy cells. For new and experienced cell culture users alike, it&#8217;s important to consistently adhere to these best practices to mitigate the risk of contamination. Once a year, laboratories should review cell culture best practices and follow-up with a discussion or additional training if needed. Taking early action to prevent contamination in the first place will save time and money, as compared to cleaning up after contamination occurs. Universal best practices keep cell cultures healthy, thereby reducing the need to constantly thaw new cells, purchase expensive cell culture media, and reducing the amount of incubator decontamination and downtime.&#160;

This protocol presents essential cell culture techniques and practices to be used in the research cell culture laboratory to avoid contamination by fungi and bacteria. Within the category of bacteria, special emphasis will be placed on preventing mycoplasma contamination.&#160;&#160;

Techniques et pratiques de culture cellulaire pour éviter la contamination par des champignons et des bactéries dans le laboratoire de culture cellulaire de recherche

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...