הפרויקט מתואר נתמכה על ידי מספרים גרנט P01 AI055637 ו U54 AI057156 מ NIAID / NIH. תוכנו הם באחריות הבלעדית של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של תוכניות RCE Office, NIAID, או NIH.

יום 1: פ tularensis חיסון צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קפוא פלייט מניות תרבויות פ tularensis על אגר מולר-Hinton בתוספת 2.5% (כרך / כרך) התורם עגל בסרום, 2% (כרך / כרך) IsoVitaleX, 0.1% (wt / כרך) גלוקוז, ו 0.025% (wt / כרך) pyrophosphate ברזל. לגדול פ tularensis ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך כ 24 ח </li></ol> יום 2: פ tularensis התקשורת חיסון נוזלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן החיטוי 1 ליטר בינוני מותאם קטיון מולר-Hinton (המכיל 1.23 mM סידן כלוריד dihydrate ו 1.03 מגנזיום כלוריד hexahydrate mM). כאשר מקורר 37 ° C, תוספת בינוני נוסף עם גלוקוז 0.1% (wt / כרך), pyrophosphate ברזל 0.025% (wt / כרך), ו -2% (כרך / כרך) IsoVitaleX. סנן לעקר (0.22 μ) בינוני לתוך aliquots two-500 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 12 מ&quot;ל של מדיום מולר-Hinton בתוספת ולהעביר לתוך צינור סטרילי פלקון 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאה סטרילי 10-μl חיסון, לגרד loopful גדול של פ tularensis צמיחה של צלחות אגר (מיום 1) וחיידקים להעביר לתוך 12 מ&quot;ל של מולר-Hinton בינוני (ראו שלב 2). פעמים פיפטה פתרון מרובים התפרקות גושים ולהכין ההשעיה חיידקי הומוגנית. אל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סטרילית, לחסן כל כלי של 500 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של חיידקי השעיה מ שלב 3. לגדול תרבויות מרק ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14-18 שעות עם רעד עדין (190-200 סל&quot;ד על ניו ברונסוויק Innova 2300 סדרה שייקר). </li></ol> יום 3: תמוגה Spheroplasting, אוסמוטי, וצפיפות סוכרוז צנטריפוגה שיפוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג פ תרבויות tularensis מן האינקובטור רועד להסיר aliquot 1-ml מתרבות 500 מ&quot;ל כל אחת כדי לבדוק את צפיפות אופטית, בהתאמה. מצאנו מיצוי אופטימלי קרום תוצאות הבידוד בעת השימוש פ tularensis תאים בשלב מוקדם לוגריתמי של צמיחה, אשר תואמת OD 600 בין 0.2-0.4 (~ 10 יולי - 10 אוגוסט CFU / ml). תרבויות עם 600 OD פחות מ 0.2 לא תניב בכמות מספקת של חומר הממברנה הכולל הדרגתיים סוכרוז הבאים. לעומת זאת, תרבויות עם 600 OD יותר מ 0.4 (מתקרבים לשלב נייח) נמצאו תשואה מעורב קרום fusions. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תרבויות ב 7500 x ג&#39;למשך 30 דקות ב 15 ° C כדי לאסוף את התאים. אנו ממליצים צנטריפוגה של תרבויות בבקבוקים של 250 מ&quot;ל four צנטריפוגות, כי זה מאפשר הבאים ההשעיה גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant התקשורת מבקבוק כל צנטריפוגה ובתקיפות הברז בקבוקים על חומר סופג כדי להסיר בינוני צמיחה עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10 דקות לאחר סיום של צנטריפוגה, להשעות כל גלולה חיידקים מ&quot;ל של 8.75 M 0.75 סוכרוז (ב 5 מ&quot;מ טריס, pH 7.5). כל ארבעת כדורי חיידקי צריך להיות מושעה והועברו (35 מ&quot;ל סך של השעיה חיידקים) על בקבוק של 250 מ&quot;ל סטרילי (עם stirbar קטן) בתוך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ערבוב בעדינות את ההשעיה על תא stirplate, לאט להוסיף 70 מ&quot;ל (2 כרכים) של 10 mM EDTA disodium (ב 5 מ&quot;מ טריס, pH 7.8) במשך 10 דקות. מוסיפים את פתרון EDTA עם קצה פיפטה מתחת לרמת ההשעיה התא, כדי למנוע ריכוז מקומי גבוה של EDTA. Stirbar צריך להיות מסתובב בקצב מספיק כדי לערבב היטב את ההשעיה התא אך לא מהר מספיק כדי לגרום מקציף או היווצרות בועה. לאחר פתרון EDTA נוספה, דגירה הפתרון למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 30 דקות, לאט לאט להוסיף 11 מ&quot;ל (1 / 10 נפח ה) של פתרון ליזוזים 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל. ממשיכים לערבב את התא במהלך ההשעיה בנוסף הפתרון ליזוזים. כפי שצוין לעיל, להוסיף את הפתרון ליזוזים עם קצה פיפטה מתחת לרמת ההשעיה נוזל התא, כדי למנוע ריכוז מקומי גבוה של ליזוזים. מאגר פתרונות ליזוזים (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) אפשר להכין לשימוש יחיד aliquots ומאוחסנים ב -20 ° C במשך שלושה עד ארבעה חודשים. דגירה הפתרון שהתקבל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה 30 דקות, להכין בקבוק 1 ליטר סטרילי עם stirbar קטן 530 מ&quot;ל של בטמפרטורת החדר Cellgro מולקולרית כיתה DH 2 O (4.5 כרכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסמוטי lyse ההשעיה תא (משלב 6) על ידי דילול איטי (קצב זרימה של כ -11 מ&quot;ל / דקה) לתוך 530 מ&quot;ל מולקולרית כיתה DH 2 O (מ שלב 7) במשך 10-15 דקות עם ערבוב עדין. בגלל נפח גדול יותר הפתרון בשלב זה, להגדיל את המהירות stirbar כדי להבטיח ערבוב ראויה. Stirbar צריך להיות מסתובב בקצב מספיק ביסודיות לפזר את ההשעיה תא פעם הוסיפו 2 DH O, אך לא מהר מספיק כדי להוביל מקציף או היווצרות בועה. מוסיפים את ההשעיה תא עם קצה פיפטה מונח על החלק התחתון של הבקבוק, סמוך stirbar, כדי להקל על דילול אחיד של celאני ההשעיה. מצאנו כי 25 מ&quot;ל pipettes העבודה הטובה ביותר במהלך שלב זה. בזהירות לפקח על תהליך דילול לקטוע את קצב הזרימה על פי הצורך לפזר הצטברויות מקומיות של תאים, גושים התא, אניצי התא. דגירה הפתרון שהתקבל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שים לב כי בשלב זה נראה כי אחד מאתגר ביותר קריטי להצלחה הכוללת של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 30 דקות, להעביר aliquots 40 מ&quot;ל של התמיסה תמוגה אוסמוטי לתוך 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי ו צנטריפוגות XG ב 7500 למשך 30 דקות ב -10 ° C כדי להסיר תאים שלמים ופסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, להסיר בזהירות 27-30 מ&quot;ל של supernatant מהצינור כל חרוטי ו supernatants בריכה בבקבוק 1 ליטר סטרילית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 25 מ&quot;ל של supernatant ונקווה, כל אחד, תוך 16 צינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות ב 200.000 x g (44,400 סל&quot;ד הרוטור F50L ב-8x39 ultracentrifuge FiberLite) עבור 2 שעות על 4 ° C. שים לב כי הרוטור כל בעל 8 צינורות, ולכן שלב זה דורש שני הרוטורים ושני ultracentrifuges. לחלופין, להגדיר את השני של 8 צינורות צריך להיות שנערך 4 ° C עד centrifuged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10 דקות של השלמת בטווח ultracentrifuge, להכין שונה resuspension חוצץ קרום. העברת 8 מ&quot;ל של חיץ ההשעיה קרום (25% [wt / wt] סוכרוז, 5 מ&quot;מ טריס, 30 מ&quot;מ MgCl 2) אל צינור סטרילי להוסיף 1 טבלית של קוקטייל EDTA ללא מעכב פרוטאז ו 375 U של Benzonase. לערבב בעדינות פתרון לפזר מעכב פרוטאז הלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ultracentrifugation, יוצקים בזהירות את supernatants, להפוך צינורות ultracentrifuge על חומר סופג, ובתקיפות ברז צינורות להסיר supernatant עודף. סמן את מיקומו של כל גלולה קרום בטוש לסייע להדמיה. בעדינות resuspend eight כדורי קרום עם μl 600 כל אחד חוצץ שונה resuspension הממברנה. העברת כל resuspension קרום להגדיר הבא של שמונה שפופרות, בעדינות resuspend בשמונה כדורי, ואת הבריכה resuspensions קרום וכתוצאה מכך צינור סטרילי. ממברנות pelleted קשה resuspend, כך ממשיכים להעביר resuspension שונה חוצץ קרום על גלולה עד קליפות מהקיר של הצינור. זה לעתים קרובות יש צורך להשתמש קצה micropipette כדי לגרד את גלולה קרום מהקיר צינור וסיוע בתהליך resuspension. כאשר pipetting, להימנע מקציף או היווצרות בועה. שים לב כי בשלב זה נראה כי אחד מאתגר ביותר קריטי להצלחה הכוללת של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כדורי קרום כבר resuspended ומנותק מכל 16 צינורות, לשטוף כל ארבעה צינורות עם 600 μl של חיץ שונה resuspension הממברנה. לשטוף את צריכה להיות ממוקדת סביב האזור המסומן (קרום כדורית) של צינור אחד. העברת הכביסה לתוך הצינור resuspension הממברנה. חזור על השלב לשטוף את שלוש מערכות הנותרים של ארבעה צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה resuspension קרום עם נדנדה עדין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבזות DNA וסיוע לירידה של החומר הצמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת aliquot קטנה של ההשעיה קרום ולבצע כימות חלבון כדי לקבוע תשואה קרום מוחלט. אנחנו בדרך כלל להכין חי, מדולל 1:1 (ב -2.5% SDS), ו 01:03 מדולל (ב -2.5% SDS) בדגימות קרום, החום דגימות ב 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולהשתמש Assay חלבון BioRad DC לכמת resuspension קרום חלבון ריכוז. סה&quot;כ תשואה חלבון הוא בדרך כלל בין 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 1.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל. השימוש בחום SDS נדרשים לשחרר OMPs מן הקרומים חילוץ כך כימות מדויק יותר ערך חלבון ניתן להשיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הדרגתיים סוכרוז ליניארי על ידי 1.8 מ&quot;ל כל שכבות של פתרונות סוכרוז (wt / wt, שהוכנו 5 mM EDTA, pH 7.5) תוך 14 x 95 mm-Ultra Clear צינורות ultracentrifuge לפי הסדר הבא: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Layering של gradients סוכרוז היא הקלה ביותר לבצע בעת שימוש pipettor הנורה, לא pipettor אוטומטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוסס על כימות resuspension חלבון קרום (שלב 16), שכבה 1.5 מ&quot;ג resuspension קרום על גבי שיפוע כל אחד. לכל 14 x 95 מ&quot;מ ultracentrifuge צינור בעל קיבולת מקסימלית של 12.5 מ&quot;ל ו, בהתחשב בעובדה 10.8 מ&quot;ל היא מוסברת על ידי הפתרונות סוכרוז משלב 17, אתה לא צריך להעמיס יותר מ 1.7 מ&quot;ל של resuspension קרום לכל צבע. בנפרד לשקול בזהירות להתאים את המשקל הסופי של כל שפופרת צבע סוכרוז (על ידי הוספה או הסרה של resuspension קרום), כך כל צינורות לשקול אותו (± 0.01 גרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדרגתיים סוכרוז לתוך הרוטור SW-40Ti דלי נדנוד צנטריפוגות ב 256.000 x g (38,000 סל&quot;ד) למשך תקופה מינימלית של 17 שעות ב 4 ° C. </li></ol> יום 4: אוסף של שברים שיפוע סוכרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 17 שעות של צנטריפוגה, להפסיק להפעיל צנטריפוגות, ובזהירות להסיר הדרגתיים סוכרוז מן הרוטור SW-40Ti. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי בזהירות את החלק התחתון של צינור מפל סוכרוז עם אתנול 70%, לנקב אתהחלק התחתון של הצינור עם מחט 21g, ולאסוף שברים רציפים 500 μl של שיפוע לתוך צינורות microfuge סטרילית. חזור על הדרגתיים הבאים. שיפוע צריך להיות מותר לטפטף על ידי זרימת כוח הכבידה, כדי לא להפריע את שיפוע סוכרוז. עם זאת, אם נוטף חדל מהחלק התחתון של הצינור שיפוע, כמות קטנה של לחץ יכול להיות מיושם על החלק העליון של הצינור באמצעות אצבע אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את מקדם השבירה של כל חלק סוכרוז הדרגתי באמצעות refractometer ו לתאם את השבירה עם צפיפות מסוימת גרם / מ&quot;ל 1. הערכת לוקליזציה חלבון ידי הכנת נציג שיפוע סוכרוז שברים (במרווחים של צפיפות של 0.01, מ 1.11 גרם / מ&quot;ל ​​ל 1.26 גרם / מ&quot;ל) הפרדה SDS-PAGE, להעביר nitrocellulose ו immunoblotting. </li></ol> נציג תוצאות כאשר מבוצע כהלכה, הליך זה תוצאות הפרדה מוחלטת של צ&#39;אט שלפוחית ​​OM מן סוג הן סוג (למשל SchuS4) ו-B (לדוגמא: LVS) זנים של פ tularensis. כפי שמוצג באיור 1, פ &#39;ב immunoblots נציג OMPs tularensis בתרגום בין צפיפויות של 1.17 ו - 1.20 גרם / מ&quot;ל. לשם השוואה, שדונים בתרגום בין צפיפויות של 1.13 ו - 1.14 גרם / מ&quot;ל. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Immunoblotting פ סוכרוז tularensis צפיפות הדרגתיים. שברים סדרתית נאספו הדרגתיים וצפיפות (g / ml) חושבו בהתבסס על המדדים השבירה. החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE, הועבר nitrocellulose ו immunoblotted לזהות OMP ו חלוקה IMP. MW, prestained סטנדרטים משקל מולקולרי עם הגדלים (ב KDA) ציינה בצד שמאל של כל כתם. LVS, תא lysates שלם של פ tularensis LVS. שיפוע המתאים סוכרוז הצפיפויות הן חלק שצוין לעיל נתיבים בהתאמה. OMPs ו IMPS, כפי שמצוין לשוליים השמאליים, התגלו עם antisera, polyclonal monospecific. תוצאות דומות התקבלו עבור פ tularensis SchuS4.

<ol>
	<li>Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugation+in+density+gradients.">Centrifugation in density gradients.</a> , 335-335 (1982).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+outer+membranes.">Isolation of outer membranes.</a> Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).</li><li>Mizuno, T., Kageyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).</li><li>Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Francisella+tularensis+outer+membrane+proteins.">Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins.</a> J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).</li><li>Huntley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+outer+membrane+proteins+protect+mice+against+pulmonary+challenge+with+virulent+type+A+Francisella+tularensis.">Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis.</a> Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).</li><li>Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agglutinins+and+antibodies+to+Francisella+tularensis+outer+membrane+antigens+in+the+early+diagnosis+of+disease+during+an+outbreak+of+tularemia.">Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia.</a> J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).</li><li>Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+proteome+database+of+Francisella+tularensis.">Towards proteome database of Francisella tularensis.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).</li><li>Pavkova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+live+vaccine+strain:+proteomic+analysis+of+membrane+proteins+enriched+fraction.">Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction.</a> Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).</li><li>Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunospecific+T-lymphocyte+stimulation+by+membrane+proteins+from+Francisella+tularensis.">Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis.</a> J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).</li><li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein.">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li><li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+proteome:+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts.">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מתאר וריאציה של תמוגה, spheroplasting האוסמוטי, וצפיפות סוכרוז שיפוע צנטריפוגה &quot;תקן הזהב&quot; עבור ההפרדה הפיזית והעשרה של גראם שליליים OMS חיידקי מרכיבים תאיים אחרים 2, 3, 4. הואיל ואנו בעבר תיאר את היישום של שיטה זו לבידוד OMS מן סוג שני זני A ו-B סוג של פ tularensis 5, מצגת זה מציע נוהל מפורט יותר אופטימיזציה עבור בידוד OM. ואכן, זוהי מקדמה חשובה לזיהוי פוטנציאל משטח חשוף גורמים ארסיות משוערת של הפתוגן הקטלני הזה. המשמעות של הליך זה הודגם על ידי מחקרים במעבדה שלנו מראה כי החיסון של עכברים עם OMPs מטוהרים העניקה הגנה ניכרת נגד סוג ארסית פ tularensis אתגר ריאתי 6. כפי שצוין לעיל, שלב הצמיחה של תאים חיידקיים, למעקב קפדני במהלך תמוגה האוסמוטי, ואת resuspension עדין של כדורי הממברנה הם צעדים קריטיים שנראים לתאם עם להצלחה / כישלון של הליך זה הפרדה הממברנה. אמנם שיטה זו אופטימיזציה היא קפדני ובכפוף השתנות כמה ניסויים, OMS וכתוצאה מכך נראה טוהר משופר להפליא לעומת אלה צבר משימוש של דטרגנטים, ליתיום כלוריד, סודיום קרבונט או 7, 8, 9, 10, 11, 12.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Donor calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>35-022-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IsoVitaleX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellgro molecular grade dH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>46-000-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>38.5 ml polycarbonate bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>010-0514</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F50L-8x39 ultracentrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>096-087051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>04693132001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DC protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>500-0116</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>344060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>331301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Abbe benchtop refractometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-964-10 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for the isolation of francisella tularensis outer membranes

Francisella tularensis הוא coccobacillus גראם שליליים תאיים ואת סוכן סיבתי של tularemia המחלה zoonotic. כאשר בהשוואה לפתוגנים חיידקים אחרים, המינון זיהומיות נמוך מאוד (&lt;10 CFU), התקדמות המחלה מהירה, ותחלואה גבוהה ושיעורי תמותה מראים כי זנים אלימים של Francisella לקודד גורמים ארסיות רומן. משטח חשוף מולקולות, חלבונים בממברנה החיצונית כלומר (OMPs), הוכחו לקדם התא המארח חיידקי הכניסה מחייב, הישרדות תאיים, ארסיות והעלמת החיסונית. הרלוונטיות לחקר OMPs מודגשת עוד יותר על ידי העובדה כי הם יכולים לשמש מגן חיסונים נגד מספר מחלות חיידקים. בעוד OMPs ניתן להפיק חיידקים גראם שליליים דרך בתפזורת מיצוי טכניקות קרום, כולל sonication של תאים ואחריו צנטריפוגה ו / או מיצוי חומרי ניקוי, הכנות אלה מזוהמים לעיתים קרובות עם periplasmic ו / או cytoplasmic (פנימי) קרום (IM) מזהמים. במשך שנים, את &quot;תקן הזהב&quot; שיטה להפרדת ביוכימיות biophysical של IM גראם שליליים הקרומים החיצוניים (OM) כבר לחיידקים כפוף תמוגה spheroplasting ו האוסמוטי, ואחריו צנטריפוגה צפיפות סוכרוז הדרגתי. לאחר שכבתית על שיפוע סוכרוז, OMS ניתן להפריד IMS מבוסס על ההבדלים בצפיפות קליל, האמין להיות מבוססת במידה רבה על נוכחות של lipopolysaccharide (LPS) של OM. כאן אנו מתארים שיטה קפדני אופטימיזציה כדי לחלץ, להעשיר, ולבודד פ הקרומים החיצוניים ו tularensis OMPs הקשורים בהם.

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes at JoVE.com

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

פרוטוקול להפרדת הקרומים הפנימיים והחיצוניים של<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; על ידי תמוגה, spheroplasting האוסמוטי, וצפיפות סוכרוז ultracentrifugation הדרגתי.

שיטת בידוד של Francisella tularensis הקרומים החיצוניים

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

method-for-the-isolation-of-francisella-tularensis-outer-membranes

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

16.9K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. פרוטוקול להפרדת הקרומים הפנימיים והחיצוניים של Francisella tularensis על ידי תמוגה, spheroplasting האוסמוטי, וצפיפות סוכרוז ultracentrifugation הדרגתי.

Video: Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.