Le projet décrit a été soutenu par un nombre Grant P01 AI055637 et AI057156 U54 du NIAID / NIH. Son contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Office RCE Programmes, NIAID, NIH ou d&#39;.

Jour 1: F. l&#39;inoculation plaque tularensis <ol><li> Cultures Plate stock congelé de F. tularensis sur gélose Mueller-Hinton complété avec 2,5% (vol / vol) de sérum de veau donateurs, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (poids / volume) de glucose, et 0,025% (poids / volume) de pyrophosphate de fer. Cultivez F. tularensis à 37 ° C avec 5% de CO 2 d&#39;environ 24 h. </li></ol> Jour 2: F. liquides tularensis média d&#39;inoculation <ol><li> Préparer et autoclave de 1 litre de cation ajusté milieu Mueller-Hinton (contenant 1,23 mM de chlorure de calcium dihydraté et 1,03 mM de chlorure de magnésium hexahydraté). Lorsqu&#39;il est refroidi à 37 ° C, moyennes autre supplément de glucose 0,1% (poids / volume), le pyrophosphate de fer 0,025% (poids / volume), et 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Stériliser par filtration (0,22 μ) moyenne en deux aliquotes de 500 ml. </li><li> Retirer 12 ml d&#39;complété milieu Mueller-Hinton et transférer dans une solution stérile de 50 ml tube Falcon. </li><li> En utilisant une boucle d&#39;inoculation stérile de 10 ul, gratter une anse large de F. la croissance tularensis à partir des plaques d&#39;agar (du jour 1) et les bactéries de transfert dans 12 ml de milieu Mueller-Hinton (voir étape 2). Reprises solution de pipette multiples pour briser les mottes, et préparer homogène suspension bactérienne. Ne pas vortex. </li><li> En utilisant une pipette stérile, inoculer chaque navire de 500 ml avec 5 ml de suspension bactérienne de l&#39;étape 3. Cultivez les bouillons de culture à 37 ° C pendant 14 à 18 h sous agitation douce (190-200 rpm sur un agitateur du Nouveau-Brunswick Innova série 2300). </li></ol> Jour 3: sphéroplastes, la lyse osmotique et centrifugation en gradient de densité de saccharose <ol><li> Obtenir F. tularensis cultures de l&#39;incubateur agitateur et de supprimer une partie aliquote de 1 ml de chaque culture de 500 ml pour vérifier les densités optiques respectifs. Nous avons trouvé extraction membranaire optimale et des résultats d&#39;isolation lors de l&#39;utilisation F. cellules tularensis dans la phase logarithmique début de croissance, ce qui corrèle avec une DO 600 de 0,2 à 0,4 (~ 10 juillet au 10 août UFC / ml). Cultures avec une DO 600 de moins de 0,2 ne donnera pas une quantité suffisante de matériau de la membrane total des gradients de sucrose ultérieures. Inversement, les cultures avec une DO 600 supérieur à 0,4 (en voie de phase stationnaire) ont été trouvés à céder mixte membrane fusions. </li><li> Centrifuger à 7500 x cultures g pendant 30 min à 15 ° C pour collecter les cellules. Nous vous recommandons de centrifugation des cultures dans quatre bouteilles à centrifuger de 250 ml, parce qu&#39;elle facilite la suspension subséquente à granulés. </li><li> Retirer délicatement le surnageant des médias de chaque bouteille centrifugeuse et taper fermement les bouteilles sur un matériau absorbant pour enlever l&#39;excès de croissance moyenne. </li><li> Dans les 10 minutes suivant la fin de la centrifugation, suspendre chaque culot bactérien dans 8,75 ml de 0,75 M de saccharose (dans 5 mM de Tris, pH 7,5). Tous les quatre culots bactériens devrait être suspendu et transféré (35 ml au total de la suspension bactérienne) pour une solution stérile de 250 ml flacon (avec un barreau d&#39;agitation petits) dans les 10 min. </li><li> Tout en mélangeant doucement la suspension cellulaire sur une stirplate, ajouter lentement 70 ml (2 volumes) de 10 mM d&#39;EDTA disodique (dans 5 mM de Tris, pH 7,8) au cours de 10 min. Ajouter la solution d&#39;EDTA à la pointe de la pipette en dessous du niveau de suspension cellulaire afin d&#39;éviter des concentrations élevées de locaux de l&#39;EDTA. Le barreau d&#39;agitation doit être tournant à une vitesse suffisante pour bien mélanger la suspension cellulaire, mais pas assez rapide pour provoquer de l&#39;écume ou la formation de bulles. Après la solution d&#39;EDTA a été ajouté, incuber la solution pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Après une incubation de 30 min, ajouter lentement 11 ml (volume e 1 / 10) d&#39;un à 2 mg / ml solution de lysozyme à une concentration finale de 200 pg / ml. Continuer à mélanger la suspension cellulaire pendant l&#39;addition solution de lysozyme. Comme indiqué ci-dessus, ajouter la solution de lysozyme à la pointe de la pipette en dessous du niveau du liquide de cellules en suspension pour éviter des concentrations élevées de locaux de lysozyme. Stock solutions de lysozyme (2 mg / ml) peuvent être préparés à usage unique aliquotes et conservés à -20 ° C pendant trois à quatre mois. Incuber la solution obtenue pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Durant l&#39;incubation de 30 min, de préparer un flacon stérile 1L avec un barreau d&#39;agitation petites et 530 ml de température ambiante Cellgro moléculaire grade dH O 2 (4,5 volumes). </li><li> Osmotiquement lyser les cellules en suspension (de l&#39;étape 6) par dilution lente (débit d&#39;environ 11 ml / min) dans 530 ml d&#39;année dH moléculaire O 2 (à partir de l&#39;étape 7) au cours des 10 à 15 min en mélangeant doucement. En raison du volume plus grande solution à cette étape, d&#39;augmenter la vitesse barreau d&#39;agitation pour assurer un mélange adéquat. Le barreau d&#39;agitation doit être tournant à une vitesse suffisante pour bien disperser la suspension cellulaire fois ajouté à l&#39;O DH 2, mais pas assez rapide pour conduire à mousser ou à la formation de bulles. Ajouter la suspension cellulaire avec la pointe de la pipette reposant sur le fond du flacon, à côté du barreau d&#39;agitation, pour faciliter la dilution uniforme du CELsuspension de l. Nous avons constaté que de 25 ml Pipettes meilleur travail au cours de cette étape. Surveiller attentivement le processus de dilution et d&#39;interrompre le débit nécessaire pour disperser des accumulations locales de cellules, des bouquets de cellules, et mèches cellule. Incuber la solution obtenue pendant 30 min à température ambiante. Notez que cette étape semble être l&#39;un des plus difficiles et critiques pour le succès global de l&#39;expérience. </li><li> Après une incubation de 30 min, le transfert aliquotes de 40 ml de la solution lyse osmotique dans les tubes de 50 ml conique et centrifuger à 7500 xg pendant 30 min à 10 ° C pour éliminer les cellules intactes et les débris. </li><li> Après la centrifugation, retirer soigneusement de 27 à 30 ml de surnageant de chaque tube conique et surnageants piscine dans un flacon stérile 1L </li><li> Prélever 25 ml de surnageant mis en commun, chacune, en 16 tubes d&#39;ultracentrifugation et centrifuger à 200 000 xg (44 400 rpm dans F50L-8x39 rotor ultracentrifugeuse Fiberlite) pendant 2 h à 4 ° C. Notez que chaque rotor détient 8 tubes, cette étape nécessite deux rotors et deux ultracentrifugeuses. Alternativement, la seconde série de 8 tubes doivent être conservés à 4 ° C jusqu&#39;à centrifugé. </li><li> Dans les 10 min de la fin de la course d&#39;ultracentrifugation, préparer modifiés tampon de resuspension membrane. Transfert 8 ml de tampon de suspension de membrane (25% [p / p] sucrose, 5 mM de Tris, 30 mM MgCl 2) dans un tube stérile et ajouter 1 comprimé de l&#39;EDTA-libres cocktail inhibiteur de la protéase et 375 U de Benzonase. Mélanger doucement la solution pour dissoudre le comprimé d&#39;inhibiteur de protéase. </li><li> Après ultracentrifugation, versez délicatement hors surnageants, inverser les tubes d&#39;ultracentrifugation sur un matériau absorbant, et taper fermement les tubes pour enlever l&#39;excès surnageant. Marquez l&#39;emplacement de chaque culot de membranes avec un marqueur à l&#39;aide de la visualisation. Resuspendre doucement Huit pastilles membrane avec 600 pi de tampon de chaque membrane resuspension modifié. Transfert à chaque remise en suspension de membrane à la prochaine série de huit tubes, doucement resuspendre ces huit boulettes, et la piscine de l&#39;remises en suspension de membrane résultant dans un tube stérile. Les membranes granulés sont difficiles à remettre en suspension, afin de continuer passant le tampon membrane modifiée resuspension plus le culot jusqu&#39;à ce qu&#39;il pèle de la paroi du tube. Il est souvent nécessaire d&#39;utiliser la pointe pour gratter la micropipette culot de membranes hors la paroi du tube et de l&#39;aide dans le processus de remise en suspension. Lorsque pipetage, éviter ou de faire mousser la formation de bulles. Notez que cette étape semble être l&#39;un des plus difficiles et critiques pour le succès global de l&#39;expérience. </li><li> Lorsque les pastilles de membrane ont été remis en suspension et retirés de tous les tubes 16, lavez tous les quatre tubes de 600 pi de tampon de resuspension membrane modifiée. Le lavage devrait être axée autour de la zone marquée (membrane granulés) de chaque tube. Transfert du lavage dans le tube resuspension membrane. Répéter l&#39;étape de lavage pour les trois autres séries de quatre tubes. </li><li> Incuber la membrane avec la remise en suspension doux balancement pendant 30 min à température ambiante pour dégrader l&#39;ADN et de l&#39;aide dans la réduction des matières floconneuses. </li><li> Supprimer une petite aliquote de la suspension membranaire et d&#39;effectuer une quantification des protéines membranaires pour déterminer le rendement total. Nous préparent habituellement non dilué, 01:01 dilué (de 2,5% de SDS), et 1:3 dilué (de 2,5% de SDS) échantillons de membrane, chauffer les échantillons à 90 ° C pendant 10 min, et utiliser le BioRad Protein Assay DC à quantifier la concentration des protéines membranaires resuspension. Rendement en protéines totales est généralement comprise entre 1,0 mg / ml et 1,6 mg / ml. L&#39;utilisation de la chaleur et de la SDD sont nécessaire pour libérer de l&#39;OMP membranes extraites de sorte qu&#39;une valeur plus précise la quantification des protéines peut être obtenue. </li><li> Préparer des gradients de sucrose linéaires par superposition de 1,8 ml de chacune des solutions de saccharose (poids / poids, préparé en 5 mM EDTA, pH 7,5) dans les tubes 14 x 95 mm ultracentrifugeuse Ultra-Clear dans l&#39;ordre suivant: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Superposition des gradients de sucrose est plus facile à effectuer lors de l&#39;utilisation d&#39;une pipette ampoule, pas un pipeteur automatisé. </li><li> Basé sur la quantification des protéines membranaires resuspension (étape 16), couche de 1,5 mg de remise en suspension de membrane sur le dessus de chaque gradient. Chaque 14 x 95 mm tube d&#39;ultracentrifugation a une capacité maximale de 12,5 ml et, étant donné que 10,8 ml est représenté par les solutions de saccharose de l&#39;étape 17, vous ne devriez pas charger plus de 1,7 ml de remise en suspension de membrane par gradient. Individuellement et soigneusement peser ajuster le poids final de chaque tube à gradient de saccharose (en ajoutant ou en enlevant la membrane resuspension) afin que tous les tubes le même poids (± 0,01 g). </li><li> Transfert des gradients de saccharose dans un rotor SW-40Ti baquet oscillant et centrifuger à 256 000 xg (38 000 tpm) pendant un minimum de 17 h à 4 ° C. </li></ol> Jour 4: Collecte des fractions du gradient de saccharose <ol><li> Après 17 h de centrifugation, arrêter la course centrifugeuse, et enlever soigneusement les gradients de saccharose par le rotor SW-40Ti. </li><li> Nettoyez soigneusement la partie inférieure du tube gradient de saccharose avec de l&#39;éthanol à 70%, la ponction de lafond du tube avec une aiguille 21G, et de recueillir des fractions de 500 ul séquentielle à partir du gradient dans des tubes de microcentrifugation stérile. Répétez l&#39;opération pour des gradients ultérieurs. Le gradient devraient être autorisés à goutte à goutte par gravité, afin de ne pas perturber le gradient de saccharose. Cependant, si la goutte cesse du fond du tube dégradé, une petite quantité de pression peut être appliquée à la partie supérieure du tube en utilisant un doigt. </li><li> Déterminer l&#39;indice de réfraction de chaque fraction du gradient de saccharose aide d&#39;un réfractomètre et de corréler l&#39;indice de réfraction avec une densité spécifique en g / ml 1. Évaluer la localisation des protéines par la préparation des fractions représentant un gradient de saccharose (par incréments de densité de 0,01; de 1,11 g / ml à 1,26 g / ml) pour SDS-PAGE de séparation, le transfert de la nitrocellulose, et immunoblot. </li></ol> Les résultats représentatifs Quand elle est réalisée correctement, cette procédure aboutit à la séparation complète de la messagerie instantanée et des vésicules OM à la fois de Type A (par exemple SchuS4) et B (par exemple, LVS) souches de F. tularensis. Comme indiqué dans immunoblots représentatifs de la figure 1, F. OMP tularensis localisent entre les densités de 1,17 et 1,20 g / ml. Par comparaison, IMP localisent entre les densités de 1,13 et 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Immunoblot de F. gradients de densité de saccharose tularensis. Fractions séquentielles ont été recueillis auprès des dégradés et des densités (g / ml) ont été calculés sur la base des indices de réfraction. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, transférées sur nitrocellulose, et de détecter les immuno OMP et le fractionnement IMP. mw, précolorés standards de poids moléculaire avec des tailles (en kDa) a noté sur le côté gauche de chaque tache. LVS, lysats de cellules entières de F. LVS tularensis. Les densités correspondantes de saccharose gradient fraction sont noté ci-dessus leurs couloirs respectifs. OMP et IMP, comme noté dans la marge gauche, ont été détectés avec des anticorps polyclonaux, antisérums monospécifiques. Des résultats similaires ont été obtenus pour F. tularensis SchuS4.

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	<li>Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugation+in+density+gradients.">Centrifugation in density gradients.</a> , 335-335 (1982).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+outer+membranes.">Isolation of outer membranes.</a> Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).</li><li>Mizuno, T., Kageyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).</li><li>Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Francisella+tularensis+outer+membrane+proteins.">Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins.</a> J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).</li><li>Huntley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+outer+membrane+proteins+protect+mice+against+pulmonary+challenge+with+virulent+type+A+Francisella+tularensis.">Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis.</a> Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).</li><li>Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agglutinins+and+antibodies+to+Francisella+tularensis+outer+membrane+antigens+in+the+early+diagnosis+of+disease+during+an+outbreak+of+tularemia.">Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia.</a> J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).</li><li>Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+proteome+database+of+Francisella+tularensis.">Towards proteome database of Francisella tularensis.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).</li><li>Pavkova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+live+vaccine+strain:+proteomic+analysis+of+membrane+proteins+enriched+fraction.">Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction.</a> Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).</li><li>Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunospecific+T-lymphocyte+stimulation+by+membrane+proteins+from+Francisella+tularensis.">Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis.</a> J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).</li><li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein.">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li><li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+proteome:+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts.">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li></ol>

Ce protocole décrit une variante de la sphéroplastes, la lyse osmotique, et la densité de gradient de saccharose centrifugation &quot;gold standard&quot; pour la séparation physique et l&#39;enrichissement des bactéries Gram-négatives OM à partir d&#39;autres composants cellulaires 2, 3, 4. Alors que nous avons précédemment décrit l&#39;application de cette méthode pour isoler OM des deux souches de type A et de type B de F. tularensis 5, cette présentation offre une procédure plus détaillée et optimisé pour l&#39;isolation l&#39;OM. En effet, il s&#39;agit d&#39;une avancée importante pour identifier potentiellement exposées à la surface et les facteurs de virulence présumée à partir de ce pathogène mortel. L&#39;importance de cette procédure a été démontrée dans des études de notre laboratoire montrant que l&#39;immunisation de souris avec OMP purifiée une protection substantielle contre le type virulent F. tularensis défi pulmonaire 6. Comme indiqué ci-dessus la phase de croissance, des cellules bactériennes, une surveillance attentive lors de la lyse osmotique, et remise en suspension des culots de membranes douces sont des étapes essentielles qui semblent être en corrélation avec succès / échec de cette procédure de séparation membranaire. Bien que cette méthode est rigoureuse et optimisée soumis à une certaine variabilité expérimentale, l&#39;OM résultant semblent être d&#39;une pureté remarquable amélioration par rapport à celles recueillies auprès de l&#39;utilisation de détergents, de chlorure de lithium, sodium ou le carbonate de 7, 8, 9, 10, 11, 12.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Donor calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>35-022-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IsoVitaleX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellgro molecular grade dH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>46-000-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>38.5 ml polycarbonate bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>010-0514</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F50L-8x39 ultracentrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>096-087051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>04693132001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DC protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>500-0116</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>344060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>331301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Abbe benchtop refractometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-964-10 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for the isolation of francisella tularensis outer membranes

Francisella tularensis est un coccobacille à Gram négatif intracellulaire et l&#39;agent causal de la maladie zoonotique la tularémie. En comparaison avec d&#39;autres pathogènes bactériens, la dose infectieuse extrêmement faible (&lt;10 UFC), la progression rapide de la maladie, et de la morbidité et de mortalité élevés suggèrent que les souches virulentes de Francisella codent pour des facteurs de virulence roman. Exposées à la surface des molécules, les protéines membranaires savoir externe (OMP), ont été montrés pour favoriser cellule hôte bactérienne contraignante, d&#39;entrée, la survie intracellulaire, la virulence et l&#39;évasion immunitaire. La pertinence pour l&#39;étude des OMP est encore souligné par le fait qu&#39;ils peuvent servir de vaccins protecteurs contre un certain nombre de maladies bactériennes. Alors OMP peut être extraite de bactéries gram-négatives grâce à des techniques d&#39;extraction en vrac membrane, y compris la sonication des cellules suivie d&#39;une centrifugation et / ou extraction par détergent, ces préparations sont souvent contaminés par périplasmique et / ou cytoplasmique (interne) membrane (GI) des contaminants. Pendant des années, le &quot;gold standard&quot; méthode pour la séparation biochimiques et biophysiques de bactéries gram-négatives et les membranes externes de messagerie instantanée (OM) a été de bactéries soumises à une lyse osmotique et de sphéroplastes, suivis par centrifugation en gradient de densité de saccharose. Une fois en couches sur un gradient de saccharose, l&#39;OMS peut être séparé de l&#39;IMS sur la base des différences dans les densités porteur, qu&#39;on croit être fondé essentiellement sur la présence de lipopolysaccharide (LPS) de l&#39;OM. Ici, nous décrivons une méthode rigoureuse et optimisée pour extraire, d&#39;enrichir et d&#39;isoler F. tularensis membranes extérieures et de leurs associés OMP.

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Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Un protocole de séparation des membranes interne et externe de<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Par sphéroplastes, la lyse osmotique et ultracentrifugation en gradient de densité de saccharose.

Méthode pour l&#39;isolement de Francisella tularensis Membranes externes

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

16.9K vues.  University of Texas Southwestern Medical Center. Un protocole de séparation des membranes interne et externe de Francisella tularensis Par sphéroplastes, la lyse osmotique et ultracentrifugation en gradient de densité de saccharose.

Vidéo: Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

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Recherche

Biologie

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Un rapide, méthode évolutive pour l&#39;isolement, l&#39;étude fonctionnelle, et l&#39;analyse de la matrice extracellulaire de cellules dérivées

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membranes lipidiques bicouches attachées pour surveiller le transfert de chaleur entre les nanoparticules d’or et les membranes lipidiques

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.