Das beschriebene Projekt wurde von Grant Numbers P01 AI055637 und U54 AI057156 von NIAID / NIH unterstützt. Sein Inhalt sind ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des RCE Programme Office, NIAID oder NIH.

Tag 1: F. tularensis Platte Impfung <ol><li> Platte eingefroren Stammkulturen von F. tularensis auf Mueller-Hinton-Agar mit 2,5% (vol / vol) Donor Kälberserum, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt / vol) Glucose und 0,025% (wt / vol) Eisenpyrophosphat ergänzt. Wachsen F. tularensis bei 37 ° C mit 5% CO 2 für ca. 24 h. </li></ol> Tag 2: F. tularensis flüssigen Medien Impfung <ol><li> Vorbereiten und Autoklaven 1 Liter Kationen-eingestellt Mueller-Hinton-Medium (mit 1,23 mm Calciumchloriddihydrat und 1,03 mM Magnesiumchlorid-Hexahydrat). Nach dem Abkühlen auf 37 ° C, weiter ergänzen Medium mit 0,1% (wt / vol) Glukose, 0,025% (wt / vol) Eisenpyrophosphat, und 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filter sterilisieren (0,22 μ)-Medium in zwei 500-ml-Portionen. </li><li> Nehmen Sie 12 ml ergänzt Mueller-Hinton-Medium und Überführung in eine sterile 50-ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Mit einer sterilen 10-ul Impföse, kratzen eine große Öse F. tularensis Wachstum von Agarplatten (ab Tag 1) und übertragen die Bakterien in 12 ml Mueller-Hinton-Medium (siehe Schritt 2). Pipettenlösung mehrfach den Break-up Klumpen und bereiten homogene Bakteriensuspension. Nicht vortexen. </li><li> Mit einer sterilen Pipette impfen jedes 500-ml-Gefäß mit 5 ml Bakteriensuspension aus Schritt 3. Wachsen Brühe Kulturen bei 37 ° C für 14 bis 18 h unter leichtem Schütteln (190-200 rpm auf einem New Brunswick Innova 2300 Serie Schüttler). </li></ol> Tag 3: Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation <ol><li> Erhalten F. tularensis Kulturen aus dem Schüttelinkubator und entfernen Sie eine 1-ml-Aliquot aus jedem 500-ml-Kultur in den jeweiligen optischen Dichten zu überprüfen. Wir haben eine optimale Membran-Extraktion und Isolierung Ergebnisse bei der Verwendung von F. tularensis Zellen in der frühen logarithmischen Phase des Wachstums, die mit einer OD 600 korreliert zwischen 0,2 bis 0,4 (~ 10 Juli - 10 August CFU / ml). Kulturen mit einer OD 600 von weniger als 0,2 wird nicht nachgeben ausreichende Menge von insgesamt Membranmaterial für nachfolgende Saccharosegradienten. Umgekehrt haben Kulturen mit einer OD 600 von mehr als 0,4 (kurz vor der stationären Phase) wurde festgestellt, mixed-Membran-Fusionen ergeben. </li><li> Centrifuge Kulturen bei 7.500 x g für 30 min bei 15 ° C zu sammeln der Zellen. Wir empfehlen Zentrifugation der Kulturen in vier 250-ml Zentrifugenbecher, weil es nachfolgenden Pellets Aufhängung erleichtert. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Medien Überstand aus jeder Zentrifugenflasche und fest tippen Sie auf die Flaschen auf saugfähigen Material, um überschüssige Wachstumsmedium zu entfernen. </li><li> Innerhalb von 10 min nach Beendigung der Zentrifugation auszusetzen jeder Bakterienpellet in 8,75 ml von 0,75 M Saccharose (in 5 mM Tris, pH 7,5). Alle vier Bakterienpellets ausgesetzt und übertragen werden (35 ml insgesamt Bakteriensuspension) in eine sterile 250-ml-Flasche (mit einem kleinen Rührerstab) innerhalb von 10 min. </li><li> Während sanft Mischen der Zellsuspension auf einer stirplate, langsam 70 ml (2 Bände) von 10 mM EDTA (in 5 mM Tris, pH 7,8) im Laufe von 10 min. Fügen Sie die EDTA-Lösung mit der Spitze der Pipette unter der Zellsuspension Ebene zu erhöhten lokalen Konzentrationen von EDTA zu vermeiden. Die Rührerstab sollte mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zu durchmischen die Zellsuspension, aber nicht schnell genug, um zu Schaumbildung führen oder Blasenbildung sein dreht. Nach der EDTA-Lösung hinzugefügt wurde, inkubieren Sie die Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der 30 min Inkubation langsam zugeben 11 ml (1 / 10 th Volumen) einer 2 mg / ml Lysozym-Lösung auf eine Endkonzentration von 200 ug / ml. Fahren Sie mit der Zellsuspension während der Lysozym-Lösung zusätzlich zu mischen. Wie oben erwähnt, fügen Sie den Lysozym-Lösung mit der Pipettenspitze unterhalb der Zellsuspension Flüssigkeitsstand zu erhöhten lokalen Konzentrationen von Lysozym zu vermeiden. Lager Lysozym-Lösungen (2 mg / ml) kann in Einzel-Portionen zubereitet werden und bei -20 ° C für drei Minuten vor vier Monaten. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Während der 30 min Inkubation Vorbereitung eines sterilen 1L Flasche mit einem kleinen Rührerstab und 530 ml Raumtemperatur CellGro Molecular Grade dH 2 O (4,5 Volumen). </li><li> Osmotisch lysiert die Zellsuspension (aus Schritt 6) durch langsame Verdünnung (Flussrate von ca. 11 ml / min) in 530 ml für Molekulare Grade dH 2 O (aus Schritt 7) im Laufe der 10 bis 15 min unter leichtem Mischen. Wegen der größeren Volumen der Lösung in diesem Schritt erhöhen Rührerstab Geschwindigkeit, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten. Die Rührerstab sollte mit einer ausreichenden Geschwindigkeit, um gründlich zu dispergieren die Zellsuspension einmal, um die dH 2 O hinzugefügt werden rotierende aber nicht schnell genug, um Schaumbildung oder Blasenbildung führen. Fügen Sie die Zellsuspension mit der Spitze der Pipette ruht auf dem Boden des Kolbens, angrenzend an die Rührerstab, um eine gleichmäßige Verdünnung der cel erleichternl Suspension. Wir haben festgestellt, dass 25-ml-Pipetten beste Arbeit in diesem Schritt. Sorgfältig überwachen die Verdünnung Prozess und unterbrechen den Durchfluss wie nötig, um lokale Ansammlungen von Zellen, Zellklumpen, und die Zelle Strähnen verteilen. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass dieser Schritt zu einer der anspruchsvollsten und entscheidend für den Gesamterfolg des Experiments zu sein scheint. </li><li> Nach der 30 min Inkubation Transfer 40 ml Aliquots der osmotische Lyse-Lösung in 50-ml konische Röhrchen und zentrifugieren bei 7500 xg für 30 min bei 10 ° C an intakte Zellen und Ablagerungen zu entfernen. </li><li> Nach der Zentrifugation vorsichtig von 27 bis 30 ml Überstand aus jeder konischen Rohr und Pool Überstände in einem sterilen 1L Flasche </li><li> Transfer 25 ml gepoolt Überstand, die jeweils in 16 Ultrazentrifuge-und Zentrifugenröhrchen bei 200.000 x g (44.400 rpm in F50L-8x39 Fiberlite Ultrazentrifuge Rotor) für 2 h bei 4 ° C. Beachten Sie, dass jeder Rotor 8 Röhrchen hält, so dass dieser Schritt erfordert zwei Rotoren und zwei Ultrazentrifugen. Alternativ sollte der zweite Satz von 8 Röhrchen bei 4 ° C aufbewahrt werden, bis zentrifugiert. </li><li> Innerhalb von 10 min nach Beendigung der Ultrazentrifuge laufen, bereiten Membran Resuspensionspuffer geändert. Transfer-8 ml Membransuspension Puffer (25% [w / w] Saccharose, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2), um ein steriles Röhrchen geben und 1 Tablette EDTA-freie Protease Inhibitor Cocktail und 375 U Benzonase. Vorsichtig mischen Lösung Protease-Inhibitor Tablette auflösen. </li><li> Nach Ultrazentrifugation, sorgfältig abgießen Überstände, Invertzucker Ultrazentrifuge Rohre auf saugfähigen Material, und fest Leitungswasser Röhren, um überschüssige Überstand zu entfernen. Markieren Sie die Position der einzelnen Membran-Pellet mit einem Marker, um die Visualisierung zu helfen. Vorsichtig resuspendieren acht Membran-Pellets mit 600 ul jeweils modifizierte Membran Resuspensionspuffer. Übertragen Sie jede Membran Resuspension auf den nächsten Satz von acht Röhren vorsichtig resuspendieren diese acht Pellets, und der Pool der resultierenden Membran resuspensions in einem sterilen Röhrchen. Die pelletierten Membranen sind schwer zu suspendieren, so auch weiterhin das Bestehen der modifizierten Membran Resuspensionspuffer über das Pellet bis es weg von der Wand des Rohres schält. Es ist oft notwendig, die Mikropipette Spitze verwenden, um die Membran Pellet aus der Rohrwand und Hilfe kratzen in der Resuspension Prozess. Beim Pipettieren vermeiden Aufschäumen oder Blasenbildung. Beachten Sie, dass dieser Schritt zu einer der anspruchsvollsten und entscheidend für den Gesamterfolg des Experiments zu sein scheint. </li><li> Wenn die Membran-Pellets wurden resuspendiert und aus allen 16 Röhren, waschen alle vier Röhren mit 600 ul der modifizierten Membran Resuspensionspuffer. Die Wäsche sollte um den markierten Bereich (Membran Pellet) jeder Röhre fokussiert werden. Übertragen Sie die Wäsche in die Membran Resuspension Röhre. Wiederholen Sie den Waschvorgang für die restlichen drei Sätze von vier Röhren. </li><li> Inkubieren Sie die Membran Resuspension unter leichtem Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur zu DNA und Hilfe bei der Reduktion von flockiges Material zersetzen. </li><li> Nehmen Sie eine kleine Teilmenge der Membransuspension und führen Protein Quantifizierung auf insgesamt Membran Ertrag. Wir bereiten in der Regel unverdünnt, verdünnt 1:1 (in 2,5% SDS), und 1:3 verdünnt (in 2,5% SDS)-Membran-Proben, Wärme die Proben bei 90 ° C für 10 min, und die Verwendung des BioRad DC Protein Assay zur Quantifizierung die Membran Resuspension Proteinkonzentration. Insgesamt Proteinausbeute ist in der Regel zwischen 1,0 mg / ml und 1,6 mg / ml. Die Nutzung von Wärme und SDS sind erforderlich, um OMPs aus dem extrahierten Membranen, so dass eine genauere Quantifizierung Protein-Wert erhalten werden kann loslassen. </li><li> Bereiten linear Saccharosegradienten durch Schichtung 1,8 ml jeder der Saccharose-Lösungen (wt / wt, bereitete in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear Ultrazentrifuge Rohre in der folgenden Reihenfolge: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Layering von Saccharosegradienten ist am einfachsten zu führen, wenn Sie eine Glühbirne Pipette und nicht ein automatisiertes Pipette. </li><li> Basierend auf der Membran Resuspension Protein Quantifizierung (Schritt 16), Layer 1,5 mg Membran Resuspension übereinander Gradienten. Jede 14 x 95 mm Ultrazentrifuge Rohr hat eine maximale Kapazität von 12,5 ml und, da die 10,8 ml für durch die Saccharose-Lösungen von Step 17 zu bilanzieren, sollten Sie nicht mehr als 1,7 ml Membran Resuspension pro Gradienten. Individuell abwägen und sorgfältig einstellen das Endgewicht der einzelnen Sucrosegradienten Rohr (durch Hinzufügen oder Entfernen Membran Resuspension), so dass alle Rohre gleich (± 0,01 g) wiegen. </li><li> Transfer Saccharosegradienten in eine SW-40Ti Ausschwingrotor und Zentrifuge bei 256.000 x g (38.000 rpm) für mindestens 17 h bei 4 ° C. </li></ol> Tag 4: Sammlung von Saccharose-Gradienten-Fraktionen <ol><li> Nach 17 h Zentrifugation, stoppen Sie die Zentrifuge laufen, und entfernen Sie vorsichtig Saccharosegradienten aus dem SW-40Ti Rotor. </li><li> Reinigen Sie die Unterseite des Saccharose-Gradienten Rohr mit 70% Ethanol, Punktion derBoden des Röhrchens mit einer 21g Nadel, und sammeln Sie sequenzielle 500 ul-Fraktionen aus dem Gradienten in sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für nachfolgende Gradienten. Die Steigung erlaubt sein sollte, durch die Schwerkraft fließen Tropf sein, um nicht zu stören, die Saccharose-Gradienten. Wenn jedoch das tropfenden hört aus dem Boden des Gradienten Rohr, kann eine kleine Menge von Druck auf das obere Ende des Rohres mit dem Finger aufgetragen werden. </li><li> Bestimmen Sie den Brechungsindex jeder Sucrosegradienten Bruchteil mit einem Refraktometer und korrelieren den Brechungsindex mit einer spezifischen Dichte in g / ml 1. Beurteilen Proteinlokalisierung durch die Vorbereitung Vertreter Sucrosegradienten Fraktionen (Dichte Schritten von 0,01; von 1,11 g / ml bis 1,26 g / ml) für die SDS-PAGE-Trennung, Transfer auf Nitrozellulose und Immunoblot. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wenn korrekt durchgeführt, die Ergebnisse dieses Verfahrens in der vollständigen Trennung von IM und OM Vesikel aus beiden Typ A (zB SchuS4) und Typ B (zB LVS) Stämme von F. tularensis. Wie in repräsentativen Immunoblots in Abbildung 1, F. gezeigt tularensis OMPs lokalisieren zwischen Dichten von 1,17 und 1,20 g / ml. Im Vergleich zu lokalisieren IMPs zwischen Dichten von 1,13 und 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Immunoblotting von F. tularensis Saccharose-Dichtegradienten. Sequential Fraktionen wurden aus Steigungen und Dichten (g / ml) wurden basierend auf Brechungsindizes berechnet gesammelt. Die Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und immunogeblottet zu OMP und IMP Fraktionierung zu erkennen. mw, prestained Molekulargewichtsstandards mit Größen (in kDa) stellte fest, auf der linken Seite eines jeden Fleck. LVS, Ganzzelllysaten von F. tularensis LVS. Die entsprechenden Sucrosegradienten Bruchteil Dichten sind über ihre jeweiligen Fahrspuren zur Kenntnis genommen. OMPs und IMPs, wie in den linken Rand vermerkt, wurden mit polyklonalen, monospezifischen Antiseren erkannt. Ähnliche Ergebnisse wurden für F. erhalten tularensis SchuS4.

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Dieses Protokoll beschreibt eine Variation des Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation &quot;Goldstandard&quot; für die physikalische Trennung und Anreicherung von Gram-negativen Bakterien OMs aus anderen zellulären Komponenten 2, 3, 4. Während wir zuvor beschrieben die Anwendung dieser Methode zur Isolierung von OMs aus beiden Typ A und Typ B-Stämme von F. tularensis 5, bietet diese Präsentation einen detaillierteren und optimierte Verfahren für OM Isolation. Tatsächlich ist dies ein wichtiger Fortschritt für die Identifizierung potenziell an der Oberfläche ausgesetzt und mutmaßlichen Virulenzfaktoren von dieser tödlichen Erreger. Die Bedeutung dieser Verfahren wurde in Studien, die von unserem Labor zeigen, dass die Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem OMPs gewährt wesentlichen Schutz gegen virulenten Typ A F. nachgewiesen tularensis pulmonalen Herausforderung 6. Wie oben erwähnt, Wachstumsphase der Bakterienzellen, die sorgfältige Überwachung während osmotischen Lyse und schonende Resuspension von Membran-Pellets sind wichtige Schritte, die mit Erfolg / Misserfolg dieser Membrantrennverfahren Verfahren korrelieren scheint. Während diese optimierte Methode ist streng und unterliegt einigen experimentellen Variabilität scheinen die daraus resultierenden OMs auf der bemerkenswert verbesserten Reinheit sein, dass diejenigen sammelte aus der Verwendung von Waschmitteln, Lithiumchlorid, oder Natriumcarbonat 7, 8, 9, 10, 11 verglichen, 12.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Donor calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>35-022-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IsoVitaleX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellgro molecular grade dH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>46-000-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>38.5 ml polycarbonate bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>010-0514</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F50L-8x39 ultracentrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>096-087051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>04693132001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DC protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>500-0116</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>344060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>331301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Abbe benchtop refractometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-964-10 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for the isolation of francisella tularensis outer membranes

Francisella tularensis ist ein Gram-negative intrazelluläre Coccobacillus und der Erreger der Zoonose Tularämie. Wenn mit anderen bakteriellen Erregern, die extrem niedrige infektiöse Dosis (&lt;10 CFU), schnelle Progression der Erkrankung und eine hohe Morbidität und Mortalität nahe, dass die Stämme von Francisella für neue Virulenzfaktoren kodieren verglichen. Oberflächen-exponierten Moleküle, nämlich Proteine ​​der äußeren Membran (OMPs), haben gezeigt, dass bakterielle Wirtszelle binden, eingang, intrazelluläre Überleben, Virulenz und Immunevasion fördern. Die Relevanz für das Studium OMPs wird durch die Tatsache, dass sie als schützende Impfstoffe gegen eine Reihe von bakteriellen Krankheiten dienen unterstrichen. Während OMPs aus gram-negative Bakterien durch Bulk-Membran-Extraktion Techniken, einschließlich Beschallung von Zellen durch Zentrifugation und / oder Detergensextraktion gefolgt extrahiert werden, sind diese Präparate oft mit periplasmatischen und / oder zytoplasmatische (innen)-Membran (IM) Verunreinigungen kontaminiert. Seit Jahren der &quot;Goldstandard&quot;-Methode für die biochemische und biophysikalische Trennung von gram-negative IM und äußeren Membranen (OM) hat vorbehaltlich Bakterien Spheroplasting und osmotische Lyse, gefolgt von Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Einmal auf einer Saccharose-Gradienten können OMs von IMs auf der Grundlage der Unterschiede in der lebhaften Dichten getrennt werden, die vermutlich größtenteils auf das Vorhandensein von Lipopolysaccharid (LPS) in der OM ausgesagt werden. Hier beschreiben wir eine strenge und optimierte Methode zu extrahieren, zu bereichern und zu isolieren F. tularensis äußeren Membranen und die damit verbundenen OMPs.

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Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Ein Protokoll für die Trennung von innerer und äußerer Membranen aus<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Durch Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation.

Methode zur Isolierung von Francisella tularensis Äußeren Membranen

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

16.9K Aufrufe.  University of Texas Southwestern Medical Center. Ein Protokoll für die Trennung von innerer und äußerer Membranen aus Francisella tularensis Durch Spheroplasting, osmotische Lyse und Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation.

Serie: Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Forschung

Biologie

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.