אנו בזכות אדל Murell ו וולף רייק מאוד לשיתוף פרוטוקול 3C שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת הביטחון של שירות המחקר של המחלקה לענייני יוצאי צבא.

1. פורמלדהיד קיבעון של ארוכי טווח אינטראקציות הכרומטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא האנושי והתרבות קו HL-60 במדיום RPMI1640 עם FBS 15% ו 1 x פניצילין / סטרפטומיצין כדי מפגש 80-90% באינקובטור מסופק עם 5% CO 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים לתוך צינור Nunc 50 מ&quot;ל, צנטריפוגה בסל&quot;ד 1200 למשך 15 דקות ולאחר מכן להסיר את המדיום על ידי שאיפה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות resuspend את כדורי תא, לספור את התאים בעזרת hemocytometer. קח כ 1 x 10 7 תאים בהיקף של 40 מ&quot;ל עם FBS RPMI1640 / 10%, ולאחר מכן להוסיף 1.7 מ&quot;ל של פורמלדהיד 37% כדי לתקן את הכרומטין לדלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם רעד עדין, ולאחר מכן להרוות עם 2.4 מ&quot;ל של גליצין 2M. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1200 סל&quot;ד ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant. שטפו את הכדור פעם אחת עם 40 מ&quot;ל קרח קר PBS, ואז לסובב את גלולה ולהסיר את PBS. </li></ol> 2. תא תמוגה לבודד גרעינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 40 מ&quot;ל של חיץ קרים תמוגה (10 mM טריס-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0.2% NP-40) עם מעכבי פרוטאז הוסיף טרי (1:500 דילול) ו 0.1 מ&quot;מ PMSF. דגירה בחדר קר עם סיבוב במשך 90 דקות, צנטריפוגה בסל&quot;ד 2500 למשך 15 דקות, ולהסיר את supernatant. </li></ol> 3. אנזים הגבלת העיכול עם Bgl II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הגרעינים ב 0.5 מ&quot;ל של 1 x 3 חוד חיץ, ולהוסיף 15 μlof SDS 10%. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם טלטולים, ולאחר מכן להוסיף 45 μl של 20% Triton X-100 כדי לעקל SDS. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquot של גרעינים 1 x 10 6 (כ -15 מיקרוגרם, 1 / 10 של התאים המקוריים) לעיכול אנזים הגבלה. קח את 55 μl של פתרון גרעינים משלב 3.1 ולעשות עד μl 500 עם 433 μl של חיץ 1 חוד x 3 ו 12 μl של Bgl II (50U/ul). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 4. קשירת מקטעי דנ&quot;א אינטראקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית את האנזים הגבלה על ידי הוספת 95 μl של 10% SDS, ו לפגל על ​​ידי חימום על 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ&quot;ל של קשירת חיץ x 1 (30 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) ו - 360 μl של טריטון 20% X-100 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הטמפרטורה ל 16 מעלות צלזיוס ומוסיפים 50 μl של U 400 / μl האנזים T4 DNA. דגירה המדגם על 16 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ואז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li></ol> 5. ה-DNA טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 מיקרוגרם של proteinase K, ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיקרוגרם של RNase A ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA על ידי מיצוי פנול / כלורופורם, ו-DNA המשקע ב isopropanol. ממיסים-DNA של 150 μl מים מזוקקים סטריליים. </li></ol> 6. עיכול עם MSP אני ואת קשירת עם linkers oligonucleotide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2μg מטוהרים DNA עם 5 יחידות של MSP אני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-6 שעות. להשבית MSP אני על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן להאיץ את ה-DNA של אתנול עם μl 1 של גליקוגן מ&quot;ג / 5 מ&quot;ל. ממיסים את גלולה דנ&quot;א 50 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 μl של ה-DNA אני שטופלו MSP עם 2 μl של L 20 oligonucleotide מקשר מיקרומטר (5&#39;-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 &quot;), 1 μl של 20 מיקרומטר oligonucleotide S (5&#39;-cggtgaatc-3&quot;), 1 μl של מים מזוקקים סטריליים 6 μl של 10 x למאגר דנ&quot;א האנזים T4. מכסים את התערובת עם שעווה נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotides לפגל על ​​50 מעלות צלזיוס למשך דקה 1 ולאפשר להתקרר בהדרגה עד 10 מעלות שיפוע 0.5 C / דקה · ב Cycler תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של 400 U / DNA μl האנזים T4 ו לדגור על 15 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לטהר את הדנ&quot;א מקשר-ligated בעזרת ערכת ה-PCR QIAquick טיהור, elute ב 50 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li></ol> 7. PCR הגברה רצף ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פריימר לאזור מסוים של הדנ&quot;א שאתם רוצים לבחון את יחסי הגומלין ארוכי הטווח (כלומר, &quot;פיתיון&quot;). בדוגמה זו, אנו משתמשים ABL-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של ה-DNA מטוהרים כדי לבצע סיבוב הראשון באמצעות PCR 1 μl של 20 מיקרומטר פריימר ABL -1 ספציפי # 4656 (5&#39;-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 &quot;), 1 μl של 20 מיקרומטר פריימר ספציפי מקשר # 2963 (5&#39;- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 &quot;), 3μl של 3 x Klen DNA פולימראז תקי אני קוקטייל 3 μl של מים מזוקקים סטריליים. שני μl של 32 P-dCTP מתווסף μl 100 של 3 x תקי DNA פולימראז Klen אני קוקטייל לפני הגברה PCR. מחזור תרמית התחלה PCR חם היא 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 ° Cfor 2 דקות, 18 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, 72 ° C למשך דקה 1: סיומת סופי מבוצע על 72 ° Cבמשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את המוצרים הראשונים בסיבוב PCR בעזרת ערכת ה-PCR QIAquick טיהור, ו-DNA elute ב 30 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של 100 x בדילול first מוצר PCR לבצע הסיבוב השני של ה-PCR בעזרת פריימרים מקוננים על ידי הוספת 1 ​​μl של 20 מיקרומטר ABL-1 פריימר ספציפי # 4626 (5&#39;-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 &quot;) (איור 1 א), 1 μl של 20 מיקרומטר של פריימר ספציפי מקשר # 2961 (5&#39;-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 &quot;), 3 μl של 3 x Klen DNA פולימראז תקי אני קוקטייל 3 μl של מים מזוקקים סטריליים. לוח הזמנים של רכיבה תרמית היא 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 67 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, 72 ° C עבור 1 דקה, ואחריו סיומת על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את מוצרי ה-PCR על ידי הפעלת 5% אוריאה-PAGE ג&#39;ל וסריקה המסך נחשף PhosphoImager (איור 1b). להקה כל PCR ניתן למחזר מן הג&#39;ל על ידי המסת את רצועות ג&#39;ל בשפופרת Eppendorf המכיל 60 μl של מים מזוקקים סטרילי, דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צנטריפוגה בקצרה בסל&quot;ד 10,000 עבור 10 שניות לאסוף את כל דגימות. הסר 1 μl להשתמש כתבנית ה-DNA כדי לבצע PCR עם 2961/4626 תחל זוג באמצעות באותם תנאים כפי שתואר לעיל. ניתוח רצף יכול להתבצע לאחר טיהור באמצעות ערכת ה-PCR QIAquick טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצפי DNA מנותחים באמצעות כלי מקוון כדי לקבוע את המיקום הכרומוזומלי שלהם באתר האינטרנט: http://genome.ucsc.edu (איור 1 ג&#39;). לחץ על &quot;בלאט&quot; להיכנס חלון חדש המאפשר להדביק רצף ה-DNA, חלון חדש מופיע לאחר לחיצה על &#39;שלח&#39;, ומראה את&#39; תוצאות חיפוש בלאט &quot;. לחץ על &#39;הדפדפן&#39; של פגע עם זהות 100% כדי להיכנס לחלון הבא כדי להראות את מיקומו של רצף ה-DNA. </li></ol> 8. נציג תוצאות 1. ACT assay באמצעות ABL-1 באזור כפיתיון כדי לקבוע את ה-DNA שלה אינטראקציות ארוכות טווח כמוצג באיור 1a, שני אתרי Bgl השנייה ואחד BamH אני באתר נבחרו assay את המעשה. בסיבוב השני של ה-PCR, תחל להגדיר 4626/2961 שימש להגביר ABL-M1, 4630/2961 שימש ABL-M2, ו 4636/2961 שימש ABL-M3. דפוס אופייני ג&#39;ל מראה אחת כמה להקות (איור 1b). כל קטע מן assay ACT מורכב משני חלקים DNA משולב: קטע אחד נגזר באזור DNA הפיתיון, ואילו במגזר השני נובע השותף הקשורים, אשר הצטרפו למגזר באזור הפיתיון על ידי רצף הגבלה first אנזים הכרה. רצף second הכרה אנזים יופיעו בסוף רצף שותף הקשורים (איור 1 ג). משובטים ABL-M1 שבר מכיל DNA מאזור ABL1 הממוקם בכרומוזום 9q32.4 מ +133,592,306-133,592,399, והשותף הקשורים ממוקם בכרומוזום 3p13 מ +71,869,882-71,870,107. זהותם של השותפים הקשורים מתגלים על ידי פיצוץ רצפים שלהם באמצעות דפדפן הגנום UCSC (GRCh7/hg19 שוחרר בפברואר, 2009). PROK2 זוהה כשותף הקשורים ב מוקד chr3p13. כמו כן, השותף ABL-M2 הקשורים היה מקומי כדי chr5q21.1, בעוד שיבוט ABL-M3 זוהה העמותה תוך כרומוזומלית ליד מוקד-1 ABL. 2. קביעת נפוצה פחות אינטראקציות ארוכות טווח באמצעות assay ACT מבחני אחרים המבוססים על 3C דיווחו שותפים רבים יותר אינטראקציה מאשר שיש לנו שמוצג באיור 1 ובבית Igf2 / H19 מוקד 12. המתודולוגיה שיש לנו התווה יבחר את יחסי הגומלין הנפוצה ביותר לטווח ארוך. עם זאת, על ידי הגדלת מספר מחזורי ה-PCR, ניתן לזהות נוספות, עמותות פחות תכופים, כמו גם (איור 2). 3. הבדלים אינטראקציות ארוכות טווח בתאי סרטן בהשוואה לרקמות. Assay ACT יכול לשמש גם כדי לזהות הבדלים בארכיטקטורה גרעיני אינטראקציות ארוכות טווח בין תאים נורמליים לתאים סרטניים (איור 3). הבדלים אלה עשויים לשקף שינויים בארכיטקטורה גרעיני המתרחשים במהלך שינוי התא, ובכך assay זה עשוי בסופו של דבר להיות ישימה למטרות אבחון. דפוסי ג&#39;ל דומים המתרחשים הן נורמליות רקמות סרטן ציינו כי assay ACT הוא אמין לשחזור. בעוד assay ACT ניתן לזהות DNA ארוך טווח שותפים, ניתוחים נוספים, כגון דגים מבחני CHIP, נדרשים לאמת את נוכחותם של עמותות זיהו בין לוקוסים הרחוק. מחקרים גנטיים, פיזיולוגיים ביוכימיים אז יכול להיות מבוצע על מנת להבהיר את ההשלכות הביולוגיות של עמותות אלה DNA ארוך טווח. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 ACT assay באמצעות ABL-1 אזור ה-DNA כמו פיתיון ב HL-60 תאים. א ה-DNA structיור באזור 1-ABL. אנזים ההגבלה הראשונה השתמשו בחוק assay היה Bgl השנייה. Primers לסיבוב השני של ה-PCR מסומנים גם על ידי חיצים ומספרים פריימר המקביל. ב ג&#39;ל דפוס של assay לפעול 5% אוריאה עמודים. זוג פריימר 4626/2961 שימש הגברה שיבוט ABL-M1 ב PCR מקוננות, 4630/2961 שימש שיבוט ABL-M2, ו 4636/2961 שימש שיבוט ABL-M3. ג רצף ה-DNA של שיבוט ABL-M1. קטע ה-DNA מ-DNA 1-ABL הפיתיון מסומן באדום, ואת שותף DNA הקשורים מסומן ב ציאן. Bgl השנייה באתר (AGACTC) היה מסומן ירוק, MSP אני באתר (CCGG) מסומן בסגול. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2 מחזורי PCR להשפיע על תוצאות ACT assay. שימוש בשלט החתמה האזור (ICR) בשעה מוקד Igf2/H19 כמו פיתיון DNA בתאים פיברובלסטים עכבר, תוכניות רכיבה שונים יושמו את הסיבוב הראשון והשני של ה-PCR ב assay את המעשה. 18-20 מחזורים בסיבוב הראשון של ה-PCR לא להגביר אות מספיק כדי להיות דמיינו. עשרים וחמישה מחזורים בתוצאות second-PCR בלהקות ברורה, תוך הגדלת מספר מחזורי לסיבוב השני של ה-PCR המושרה דפוס למרוח בנוסף להקות יותר. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3 איתור של הבדלים בארכיטקטורה גרעיני בין רקמת המעי הגס נורמלי סרטן רקמות המעי הגס assay ACT. A. מבנה ה-DNA של האזור ICR בבית מוקד IGF2/H19 ואת הגן IGF2. DPN אתרים II עבור assay ACT מסומנים. Primers בשימוש השני בסיבוב PCR מסומנים על ידי חצים ומספרים בצבעים שונים אשר מתאימות כל נתיב ב פאנל של הדמות. ב ג&#39;ל דפוס של assay לפעול 5% אוריאה עמודים. רקמת המעי הגס רגיל MAD03-1423 ו - סרטן המעי הגס רקמות MAD04-149 התקבל רשת שיתופית רקמה אנושית (CHTN) החטיבה המערבית. לאחר כל רקמת המעי הגס היה הומוגני, assay ACT בוצע בעקבות הליכים המתוארים להלן. ליין 1 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961and 4161 (5&#39;-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 &quot;) שכותרתו בוורוד בפאנל; מסלול 2 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961 ו - 4163 (5&#39;-3-gccgcgcggccacttccgattcc &#39;) מסומן בכתום בפאנל: מסלול 3 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961 ו - 5145 (5&#39;-gccatgcaggtaggatttgagctg-3 &quot;) שכותרתו בכחול בפאנל: מסלול 4 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # 2961 ו # 5151 (5&#39;-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 &quot;) שכותרתו בירוק בלוח א להקות ייחודיות שמופיעות רק ברקמות המעי הגס נורמלי מסומנים על ידי חצים צהובים, ואלה הלהקות שהופיעו רק ברקמת סרטן המעי הגס מסומנים ב החצים האדומים. ICR, שליטה באזור החתמה, DMR, אזור מפוגל שונים.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

דקר et al. פיתח את הקונפורמציה כרומוזום ללכוד (3C) הגישה לזהות את התדר של אינטראקציה בין שני לוקוסים הגנומי 1, 3C נעשה שימוש נרחב לחקור עמותות התוך כרומוזומליות וכן בין הכרומוזומים בין שני אזורים הידועים DNA בתאי יונקים 2 -9. למרות פיתח מתודולוגיה Hi-C יכול להיות מיושם על המחקר של הגנום כולו DNA העמותה, assay ACT עדיין טכניקה יעילה ללימוד האינטראקציה מוקד ספציפי DNA 10-11. אנחנו צריכים לשנות את הגישה הזאת כדי לזהות אזורים DNA ידוע המשויכים באזור DNA ידוע עכבר בתרבית תאים אנושיים (איור 1). קראנו בשיטה זו מלכודת כרומוזום קשור (ACT) assay, כפי שהוא סיפק לנו שיטה אמינה לשעתקו לזהות רומן שותפים DNA ידוע כי לקשר עם אזור הידוע היעד DNA 12. Assay 3C מוצלח עם פקדי המתאים מבוצעת לפני ביצוע ההיבטים הרומן של assay ACT 13. על מנת tofind כמה אזורים DNA הקשורים ככל האפשר, יש צורך להשתמש שילובים שונים של אנזימי הגבלה הראשון והשני. חשוב במיוחד להשתמש אנזימי הגבלה, כי הם רגישים מתילציה CPG לבצע את הצעד הראשון קשירת 3C. מחייב חלבון מתילציה בדנ&quot;א יכולים גם להשפיע על אנזים הגבלה יעילות העיכול עלולה להוביל לכישלון של קשירת האזורים DNA הקשורים עבור digestions אנזים מסוים הגבלה. הופעתם של קשירת פנים או בין כרומוזומליות תלוי-DNA חלבון cross-linking ומפות גופנית מתאימה של שני האזורים DNA הקשורים. לכן, כמה ניסויים ראשוניים חיוניים להקים ריכוז פורמאלדהיד מעשי יעיל בזמן הטיפול assay את המעשה. טווח של ריכוזי הסופי של פורמלדהיד (from1.5% עד 2%) היו בשימוש במעבדות רבות במהלך החלק 3C של assay 7,9. לחלופין, oligonucleotides לשמש linkers יכול להיות מתוכנן להתאים את סוף מלוכדת לחתוך על ידי אנזים ההגבלה השנייה. אמנם מצאנו כי 18-20 מחזורים בסיבוב הראשון של ה-PCR ו 20-25 מחזורים בסיבוב השני של ה-PCR יכולה לספק להקות ברור, יש צורך לקבוע את התנאים PCR הטוב ביותר עבור כל ניסוי (איור 2). תוך מולקולת חישול בין הרצף 5&#39;-end 3&#39;סוף מתאם משלימה של גדיל הדנ&quot;א עלולה להתרחש PCR, זה מעכב מתאם ספציפי פריימר חישול עם מולקולת ה-DNA, וכתוצאה מכך יעילות הגברה נמוכה בהרבה את מספר מחזורי הראשון. אחרי ה-DNA היעד היה מוגבר על מחזורים, סכום שלה עשוי להיות הרבה יותר גדול מאשר התגובות האלה ספציפי, ויכול להקל על התחרות של פריימר חישול את מולקולות ה-DNA היעד. זו גם הסיבה שאנו עשויים לראות הגברה רקע, ומדוע המוצר הראשון בסיבוב PCR צריך להיות מדולל כדי להקטין amplification.It רקע חשוב להסיר primers עודף מן התגובה PCR על מנת להקטין את הרקע בסיבוב השני של ה-PCR. כמו בכל PCR מבוססי ניסויים, חיוני לתכנון primers שלא נמצאים ברצף אזורים חוזרים, המהווים את רוב הדנ&quot;א האנושי ועכבר. למרות פיתח מתודולוגיה Hi-C יכול להיות מיושם על המחקר של הגנום כולו DNA העמותה, assay ACT עדיין טכניקה יעילה ללימוד האינטראקציה מוקד ספציפי DNA.

<table><tbody><tr><td>RPMI1640 medium</td><td>Invitrogen</td><td>22400-105</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>Invitrogen</td><td>15512-023</td><td></td></tr><tr><td>ATP solution, 10mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicillin-streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris pH8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091-039</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Invitrogen</td><td>15505-035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;BamH&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144M</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Dpn&lt;/em&gt; II</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Msp&lt;/em&gt; I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8102S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>proteinase inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche Group</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>KlenTaq1</td><td>Ab peptides</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>dCTP alpha P32</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU513H250UC</td><td></td></tr><tr><td>PTC-100 Thermal Cycler</td><td>MJ Research</td><td>mjptc100</td><td></td></tr><tr><td>Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td></td></tr><tr><td>OmniPAGE Maxi</td><td>Aurogene Life Science</td><td>VS20D</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr></tbody></table>

associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

מידע גנטי המקודד על ידי ה-DNA מאורגן במבנה הכרומטין מורכב פיקוח הדוק. כל כרומוזום תופסת שטח ספציפי, זה עלול להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחות או מחזור התא. התבטאות גנים יכולה להתרחש במפעלים תעתיק התמחה בו קטעים הכרומטין יכול לולאה החוצה מהשטחים כרומוזומים שונים, המוביל לוקליזציה שיתוף קטעי DNA אשר עשוי להתקיים על כרומוזומים שונים או רחוקים אחד מהשני על כרומוזום זהה. מלכודת Associated כרומוזום (ACT) assay מספק מתודולוגיה יעילה לזהות אלו לטווח ארוך עמותות DNA באופן בלתי משוחד על ידי הרחבת ושינוי קונפורמציה כרומוזום טכניקת לכידת. Assay ACT מאפשר לנו לחקור את מנגנוני הרגולציה תעתיק של טרנס, ויכול לעזור להסביר את היחס של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה נורמלי במצבי מחלה.

Watch this Scientific Journal Video about Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions at JoVE.com

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

המלכודת קשורה כרומוזום (ACT) assay היא שיטה חדשנית לזיהוי משוחדת ארוכי טווח אינטראקציות-DNA. אפיון האינטראקציות DNA ארוך טווח תאפשר לנו לקבוע את הקשר של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה הן נורמליות במדינות חולה.

כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

associated-chromosome-trap-for-identifying-long-range-dna-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Views.  Stanford University School of Medicine. המלכודת קשורה כרומוזום (ACT) assay היא שיטה חדשנית לזיהוי משוחדת ארוכי טווח אינטראקציות-DNA. אפיון האינטראקציות DNA ארוך טווח תאפשר לנו לקבוע את הקשר של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה הן נורמליות במדינות חולה.

Video: Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Genetics

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial patterns of gene expression. Embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells have been a popular model to study the differentiation of the main three germ layers and to define regulatory circuits during cell fate specification. Although it is well-known that tissue-specific enhancers play an important role in these networks by interacting with promoters, assigning them to their relevant target genes still remains challenging. To make this possible, quantitative approaches are needed to study enhancer-promoter contacts and their dynamics during development. Here, we adapted a 4C method to define enhancers and their contacts with cognate promoters in the EB differentiation model. The method uses frequently cutting restriction enzymes, sonication, and a nested-ligation-mediated PCR protocol compatible with commercial DNA library preparation kits. Subsequently, the 4C libraries are subjected to high-throughput sequencing and analyzed bioinformatically, allowing detection and quantification of all sequences that have contacts with a chosen promoter. The resulting sequencing data can also be used to gain information about the dynamics of enhancer-promoter contacts during differentiation. The technique described for the EB differentiation model is easy to implement.

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

We report the application of quantitative chromosome conformation capture followed by high-throughput sequencing in embryoid bodies generated from embryonic stem cells. This technique allows to identify and quantitate the contacts between putative enhancers and promoter regions of a given gene during embryonic stem cell differentiation.

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) is used to fix chromatin interactions. Then, chromatin digestion with a restriction enzyme and subsequent religation of fragment ends converts three-dimensional (3D) proximity into unique ligation products. Finally, after reversal of crosslinks, protein removal, and DNA isolation, DNA is sheared and prepared for high-throughput sequencing. The frequency of proximity ligation of pairs of loci is a measure of the frequency of their colocalization in three-dimensional space in a cell population.
A sequenced Hi-C library provides genome-wide information on interaction frequencies between all pairs of loci. The resolution and precision of Hi-C relies on efficient crosslinking that maintains chromatin contacts and frequent and uniform fragmentation of the chromatin. This paper describes an improved in situ Hi-C protocol, Hi-C 3.0, that increases the efficiency of crosslinking by combining two crosslinkers (formaldehyde [FA] and disuccinimidyl glutarate [DSG]), followed by finer digestion using two restriction enzymes (DpnII and DdeI). Hi-C 3.0 is a single protocol for the accurate quantification of genome folding features at smaller scales such as loops and topologically associating domains (TADs), as well as features at larger nucleus-wide scales such as compartments.

Hi-C 3.0 is an improved Hi-C protocol that combines formaldehyde and disuccinimidyl glutarate crosslinkers with a cocktail of DpnII and DdeI restriction enzymes to increase the signal-to-noise ratio and the resolution of chromatin interaction detection.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, known as enhancers, are thought to regulate the activity of distal promoters via interaction in 3D space. Genome-wide chromosome conformation capture (3C)-technologies, such as Hi-C, have transformed our understanding of how genomes are organized in cells. The current understanding of 3D genome organization is limited by the resolution with which the topological organization of chromosomes in 3D space can be resolved. Micro-C-XL measures chromosome folding with resolution at the level of the nucleosome, the basic unit of chromatin, by utilizing micrococcal nuclease (MNase) to fragment genomes during the chromosome conformation capture protocol. This results in an improved signal-to-noise ratio in the measurements, thus facilitating the better detection of insulation sites and chromosome loops compared to other genome-wide 3D technologies. A visually supported, detailed, step-by-step protocol for preparing high-quality Micro-C-XL samples from mammalian cells is presented in this article.

A protocol for mapping the three-dimensional genome organization with nucleosome resolution using the genome-wide chromosome conformation capture method Micro-C-XL is presented here.

מיפוי אינטראקציות גנום תלת-ממדי של יונקים עם Micro-C-XL

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Deciphering High-Resolution 3D Chromatin Organization via Capture Hi-C

The spatial organization of the genome contributes to its function and regulation in many contexts, including transcription, replication, recombination, and repair. Understanding the exact causality between genome topology and function is therefore crucial and increasingly the subject of intensive research. Chromosome conformation capture technologies (3C) allow inferring the 3D structure of chromatin by measuring the frequency of interactions between any region of the genome. Here we describe a fast and simple protocol to perform Capture Hi-C, a 3C-based target enrichment method that characterizes the allele-specific 3D organization of megabased-sized genomic targets at high-resolution. In Capture Hi-C, target regions are captured by an array of biotinylated probes before downstream high-throughput sequencing. Thus, higher resolution and allele-specificity are achieved while improving the time-effectiveness and affordability of the technology. To demonstrate its strengths, the Capture Hi-C protocol was applied to the mouse X-inactivation center (Xic), the master regulatory locus of X-chromosome inactivation (XCI).

Deciphering High-Resolution 3D Chromatin Organization via Capture Hi-C

This protocol describes the Capture Hi-C method used to characterize the 3D organization of megabased-sized targeted genomic regions at high-resolution, including boundaries of topologically associating domains (TADs) and long-range chromatin interactions between regulatory and other DNA sequence elements.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

The spatial organization of the genome contributes to its function and regulation in many contexts, including transcription, replication, recombination, ...