אנו בזכות אדל Murell ו וולף רייק מאוד לשיתוף פרוטוקול 3C שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת הביטחון של שירות המחקר של המחלקה לענייני יוצאי צבא.

1. פורמלדהיד קיבעון של ארוכי טווח אינטראקציות הכרומטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא האנושי והתרבות קו HL-60 במדיום RPMI1640 עם FBS 15% ו 1 x פניצילין / סטרפטומיצין כדי מפגש 80-90% באינקובטור מסופק עם 5% CO 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים לתוך צינור Nunc 50 מ&quot;ל, צנטריפוגה בסל&quot;ד 1200 למשך 15 דקות ולאחר מכן להסיר את המדיום על ידי שאיפה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות resuspend את כדורי תא, לספור את התאים בעזרת hemocytometer. קח כ 1 x 10 7 תאים בהיקף של 40 מ&quot;ל עם FBS RPMI1640 / 10%, ולאחר מכן להוסיף 1.7 מ&quot;ל של פורמלדהיד 37% כדי לתקן את הכרומטין לדלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם רעד עדין, ולאחר מכן להרוות עם 2.4 מ&quot;ל של גליצין 2M. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1200 סל&quot;ד ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant. שטפו את הכדור פעם אחת עם 40 מ&quot;ל קרח קר PBS, ואז לסובב את גלולה ולהסיר את PBS. </li></ol> 2. תא תמוגה לבודד גרעינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 40 מ&quot;ל של חיץ קרים תמוגה (10 mM טריס-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0.2% NP-40) עם מעכבי פרוטאז הוסיף טרי (1:500 דילול) ו 0.1 מ&quot;מ PMSF. דגירה בחדר קר עם סיבוב במשך 90 דקות, צנטריפוגה בסל&quot;ד 2500 למשך 15 דקות, ולהסיר את supernatant. </li></ol> 3. אנזים הגבלת העיכול עם Bgl II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הגרעינים ב 0.5 מ&quot;ל של 1 x 3 חוד חיץ, ולהוסיף 15 μlof SDS 10%. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם טלטולים, ולאחר מכן להוסיף 45 μl של 20% Triton X-100 כדי לעקל SDS. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquot של גרעינים 1 x 10 6 (כ -15 מיקרוגרם, 1 / 10 של התאים המקוריים) לעיכול אנזים הגבלה. קח את 55 μl של פתרון גרעינים משלב 3.1 ולעשות עד μl 500 עם 433 μl של חיץ 1 חוד x 3 ו 12 μl של Bgl II (50U/ul). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 4. קשירת מקטעי דנ&quot;א אינטראקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית את האנזים הגבלה על ידי הוספת 95 μl של 10% SDS, ו לפגל על ​​ידי חימום על 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ&quot;ל של קשירת חיץ x 1 (30 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) ו - 360 μl של טריטון 20% X-100 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הטמפרטורה ל 16 מעלות צלזיוס ומוסיפים 50 μl של U 400 / μl האנזים T4 DNA. דגירה המדגם על 16 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ואז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li></ol> 5. ה-DNA טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 מיקרוגרם של proteinase K, ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיקרוגרם של RNase A ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA על ידי מיצוי פנול / כלורופורם, ו-DNA המשקע ב isopropanol. ממיסים-DNA של 150 μl מים מזוקקים סטריליים. </li></ol> 6. עיכול עם MSP אני ואת קשירת עם linkers oligonucleotide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2μg מטוהרים DNA עם 5 יחידות של MSP אני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-6 שעות. להשבית MSP אני על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן להאיץ את ה-DNA של אתנול עם μl 1 של גליקוגן מ&quot;ג / 5 מ&quot;ל. ממיסים את גלולה דנ&quot;א 50 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 μl של ה-DNA אני שטופלו MSP עם 2 μl של L 20 oligonucleotide מקשר מיקרומטר (5&#39;-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 &quot;), 1 μl של 20 מיקרומטר oligonucleotide S (5&#39;-cggtgaatc-3&quot;), 1 μl של מים מזוקקים סטריליים 6 μl של 10 x למאגר דנ&quot;א האנזים T4. מכסים את התערובת עם שעווה נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotides לפגל על ​​50 מעלות צלזיוס למשך דקה 1 ולאפשר להתקרר בהדרגה עד 10 מעלות שיפוע 0.5 C / דקה · ב Cycler תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של 400 U / DNA μl האנזים T4 ו לדגור על 15 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לטהר את הדנ&quot;א מקשר-ligated בעזרת ערכת ה-PCR QIAquick טיהור, elute ב 50 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li></ol> 7. PCR הגברה רצף ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פריימר לאזור מסוים של הדנ&quot;א שאתם רוצים לבחון את יחסי הגומלין ארוכי הטווח (כלומר, &quot;פיתיון&quot;). בדוגמה זו, אנו משתמשים ABL-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של ה-DNA מטוהרים כדי לבצע סיבוב הראשון באמצעות PCR 1 μl של 20 מיקרומטר פריימר ABL -1 ספציפי # 4656 (5&#39;-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 &quot;), 1 μl של 20 מיקרומטר פריימר ספציפי מקשר # 2963 (5&#39;- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 &quot;), 3μl של 3 x Klen DNA פולימראז תקי אני קוקטייל 3 μl של מים מזוקקים סטריליים. שני μl של 32 P-dCTP מתווסף μl 100 של 3 x תקי DNA פולימראז Klen אני קוקטייל לפני הגברה PCR. מחזור תרמית התחלה PCR חם היא 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 ° Cfor 2 דקות, 18 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, 72 ° C למשך דקה 1: סיומת סופי מבוצע על 72 ° Cבמשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את המוצרים הראשונים בסיבוב PCR בעזרת ערכת ה-PCR QIAquick טיהור, ו-DNA elute ב 30 μl של מים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של 100 x בדילול first מוצר PCR לבצע הסיבוב השני של ה-PCR בעזרת פריימרים מקוננים על ידי הוספת 1 ​​μl של 20 מיקרומטר ABL-1 פריימר ספציפי # 4626 (5&#39;-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 &quot;) (איור 1 א), 1 μl של 20 מיקרומטר של פריימר ספציפי מקשר # 2961 (5&#39;-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 &quot;), 3 μl של 3 x Klen DNA פולימראז תקי אני קוקטייל 3 μl של מים מזוקקים סטריליים. לוח הזמנים של רכיבה תרמית היא 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 67 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות, 72 ° C עבור 1 דקה, ואחריו סיומת על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את מוצרי ה-PCR על ידי הפעלת 5% אוריאה-PAGE ג&#39;ל וסריקה המסך נחשף PhosphoImager (איור 1b). להקה כל PCR ניתן למחזר מן הג&#39;ל על ידי המסת את רצועות ג&#39;ל בשפופרת Eppendorf המכיל 60 μl של מים מזוקקים סטרילי, דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צנטריפוגה בקצרה בסל&quot;ד 10,000 עבור 10 שניות לאסוף את כל דגימות. הסר 1 μl להשתמש כתבנית ה-DNA כדי לבצע PCR עם 2961/4626 תחל זוג באמצעות באותם תנאים כפי שתואר לעיל. ניתוח רצף יכול להתבצע לאחר טיהור באמצעות ערכת ה-PCR QIAquick טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצפי DNA מנותחים באמצעות כלי מקוון כדי לקבוע את המיקום הכרומוזומלי שלהם באתר האינטרנט: http://genome.ucsc.edu (איור 1 ג&#39;). לחץ על &quot;בלאט&quot; להיכנס חלון חדש המאפשר להדביק רצף ה-DNA, חלון חדש מופיע לאחר לחיצה על &#39;שלח&#39;, ומראה את&#39; תוצאות חיפוש בלאט &quot;. לחץ על &#39;הדפדפן&#39; של פגע עם זהות 100% כדי להיכנס לחלון הבא כדי להראות את מיקומו של רצף ה-DNA. </li></ol> 8. נציג תוצאות 1. ACT assay באמצעות ABL-1 באזור כפיתיון כדי לקבוע את ה-DNA שלה אינטראקציות ארוכות טווח כמוצג באיור 1a, שני אתרי Bgl השנייה ואחד BamH אני באתר נבחרו assay את המעשה. בסיבוב השני של ה-PCR, תחל להגדיר 4626/2961 שימש להגביר ABL-M1, 4630/2961 שימש ABL-M2, ו 4636/2961 שימש ABL-M3. דפוס אופייני ג&#39;ל מראה אחת כמה להקות (איור 1b). כל קטע מן assay ACT מורכב משני חלקים DNA משולב: קטע אחד נגזר באזור DNA הפיתיון, ואילו במגזר השני נובע השותף הקשורים, אשר הצטרפו למגזר באזור הפיתיון על ידי רצף הגבלה first אנזים הכרה. רצף second הכרה אנזים יופיעו בסוף רצף שותף הקשורים (איור 1 ג). משובטים ABL-M1 שבר מכיל DNA מאזור ABL1 הממוקם בכרומוזום 9q32.4 מ +133,592,306-133,592,399, והשותף הקשורים ממוקם בכרומוזום 3p13 מ +71,869,882-71,870,107. זהותם של השותפים הקשורים מתגלים על ידי פיצוץ רצפים שלהם באמצעות דפדפן הגנום UCSC (GRCh7/hg19 שוחרר בפברואר, 2009). PROK2 זוהה כשותף הקשורים ב מוקד chr3p13. כמו כן, השותף ABL-M2 הקשורים היה מקומי כדי chr5q21.1, בעוד שיבוט ABL-M3 זוהה העמותה תוך כרומוזומלית ליד מוקד-1 ABL. 2. קביעת נפוצה פחות אינטראקציות ארוכות טווח באמצעות assay ACT מבחני אחרים המבוססים על 3C דיווחו שותפים רבים יותר אינטראקציה מאשר שיש לנו שמוצג באיור 1 ובבית Igf2 / H19 מוקד 12. המתודולוגיה שיש לנו התווה יבחר את יחסי הגומלין הנפוצה ביותר לטווח ארוך. עם זאת, על ידי הגדלת מספר מחזורי ה-PCR, ניתן לזהות נוספות, עמותות פחות תכופים, כמו גם (איור 2). 3. הבדלים אינטראקציות ארוכות טווח בתאי סרטן בהשוואה לרקמות. Assay ACT יכול לשמש גם כדי לזהות הבדלים בארכיטקטורה גרעיני אינטראקציות ארוכות טווח בין תאים נורמליים לתאים סרטניים (איור 3). הבדלים אלה עשויים לשקף שינויים בארכיטקטורה גרעיני המתרחשים במהלך שינוי התא, ובכך assay זה עשוי בסופו של דבר להיות ישימה למטרות אבחון. דפוסי ג&#39;ל דומים המתרחשים הן נורמליות רקמות סרטן ציינו כי assay ACT הוא אמין לשחזור. בעוד assay ACT ניתן לזהות DNA ארוך טווח שותפים, ניתוחים נוספים, כגון דגים מבחני CHIP, נדרשים לאמת את נוכחותם של עמותות זיהו בין לוקוסים הרחוק. מחקרים גנטיים, פיזיולוגיים ביוכימיים אז יכול להיות מבוצע על מנת להבהיר את ההשלכות הביולוגיות של עמותות אלה DNA ארוך טווח. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 ACT assay באמצעות ABL-1 אזור ה-DNA כמו פיתיון ב HL-60 תאים. א ה-DNA structיור באזור 1-ABL. אנזים ההגבלה הראשונה השתמשו בחוק assay היה Bgl השנייה. Primers לסיבוב השני של ה-PCR מסומנים גם על ידי חיצים ומספרים פריימר המקביל. ב ג&#39;ל דפוס של assay לפעול 5% אוריאה עמודים. זוג פריימר 4626/2961 שימש הגברה שיבוט ABL-M1 ב PCR מקוננות, 4630/2961 שימש שיבוט ABL-M2, ו 4636/2961 שימש שיבוט ABL-M3. ג רצף ה-DNA של שיבוט ABL-M1. קטע ה-DNA מ-DNA 1-ABL הפיתיון מסומן באדום, ואת שותף DNA הקשורים מסומן ב ציאן. Bgl השנייה באתר (AGACTC) היה מסומן ירוק, MSP אני באתר (CCGG) מסומן בסגול. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2 מחזורי PCR להשפיע על תוצאות ACT assay. שימוש בשלט החתמה האזור (ICR) בשעה מוקד Igf2/H19 כמו פיתיון DNA בתאים פיברובלסטים עכבר, תוכניות רכיבה שונים יושמו את הסיבוב הראשון והשני של ה-PCR ב assay את המעשה. 18-20 מחזורים בסיבוב הראשון של ה-PCR לא להגביר אות מספיק כדי להיות דמיינו. עשרים וחמישה מחזורים בתוצאות second-PCR בלהקות ברורה, תוך הגדלת מספר מחזורי לסיבוב השני של ה-PCR המושרה דפוס למרוח בנוסף להקות יותר. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3 איתור של הבדלים בארכיטקטורה גרעיני בין רקמת המעי הגס נורמלי סרטן רקמות המעי הגס assay ACT. A. מבנה ה-DNA של האזור ICR בבית מוקד IGF2/H19 ואת הגן IGF2. DPN אתרים II עבור assay ACT מסומנים. Primers בשימוש השני בסיבוב PCR מסומנים על ידי חצים ומספרים בצבעים שונים אשר מתאימות כל נתיב ב פאנל של הדמות. ב ג&#39;ל דפוס של assay לפעול 5% אוריאה עמודים. רקמת המעי הגס רגיל MAD03-1423 ו - סרטן המעי הגס רקמות MAD04-149 התקבל רשת שיתופית רקמה אנושית (CHTN) החטיבה המערבית. לאחר כל רקמת המעי הגס היה הומוגני, assay ACT בוצע בעקבות הליכים המתוארים להלן. ליין 1 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961and 4161 (5&#39;-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 &quot;) שכותרתו בוורוד בפאנל; מסלול 2 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961 ו - 4163 (5&#39;-3-gccgcgcggccacttccgattcc &#39;) מסומן בכתום בפאנל: מסלול 3 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # # 2961 ו - 5145 (5&#39;-gccatgcaggtaggatttgagctg-3 &quot;) שכותרתו בכחול בפאנל: מסלול 4 מייצג את תוצאות ה-PCR באמצעות זוג פריימר # 2961 ו # 5151 (5&#39;-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 &quot;) שכותרתו בירוק בלוח א להקות ייחודיות שמופיעות רק ברקמות המעי הגס נורמלי מסומנים על ידי חצים צהובים, ואלה הלהקות שהופיעו רק ברקמת סרטן המעי הגס מסומנים ב החצים האדומים. ICR, שליטה באזור החתמה, DMR, אזור מפוגל שונים.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

דקר et al. פיתח את הקונפורמציה כרומוזום ללכוד (3C) הגישה לזהות את התדר של אינטראקציה בין שני לוקוסים הגנומי 1, 3C נעשה שימוש נרחב לחקור עמותות התוך כרומוזומליות וכן בין הכרומוזומים בין שני אזורים הידועים DNA בתאי יונקים 2 -9. למרות פיתח מתודולוגיה Hi-C יכול להיות מיושם על המחקר של הגנום כולו DNA העמותה, assay ACT עדיין טכניקה יעילה ללימוד האינטראקציה מוקד ספציפי DNA 10-11. אנחנו צריכים לשנות את הגישה הזאת כדי לזהות אזורים DNA ידוע המשויכים באזור DNA ידוע עכבר בתרבית תאים אנושיים (איור 1). קראנו בשיטה זו מלכודת כרומוזום קשור (ACT) assay, כפי שהוא סיפק לנו שיטה אמינה לשעתקו לזהות רומן שותפים DNA ידוע כי לקשר עם אזור הידוע היעד DNA 12. Assay 3C מוצלח עם פקדי המתאים מבוצעת לפני ביצוע ההיבטים הרומן של assay ACT 13. על מנת tofind כמה אזורים DNA הקשורים ככל האפשר, יש צורך להשתמש שילובים שונים של אנזימי הגבלה הראשון והשני. חשוב במיוחד להשתמש אנזימי הגבלה, כי הם רגישים מתילציה CPG לבצע את הצעד הראשון קשירת 3C. מחייב חלבון מתילציה בדנ&quot;א יכולים גם להשפיע על אנזים הגבלה יעילות העיכול עלולה להוביל לכישלון של קשירת האזורים DNA הקשורים עבור digestions אנזים מסוים הגבלה. הופעתם של קשירת פנים או בין כרומוזומליות תלוי-DNA חלבון cross-linking ומפות גופנית מתאימה של שני האזורים DNA הקשורים. לכן, כמה ניסויים ראשוניים חיוניים להקים ריכוז פורמאלדהיד מעשי יעיל בזמן הטיפול assay את המעשה. טווח של ריכוזי הסופי של פורמלדהיד (from1.5% עד 2%) היו בשימוש במעבדות רבות במהלך החלק 3C של assay 7,9. לחלופין, oligonucleotides לשמש linkers יכול להיות מתוכנן להתאים את סוף מלוכדת לחתוך על ידי אנזים ההגבלה השנייה. אמנם מצאנו כי 18-20 מחזורים בסיבוב הראשון של ה-PCR ו 20-25 מחזורים בסיבוב השני של ה-PCR יכולה לספק להקות ברור, יש צורך לקבוע את התנאים PCR הטוב ביותר עבור כל ניסוי (איור 2). תוך מולקולת חישול בין הרצף 5&#39;-end 3&#39;סוף מתאם משלימה של גדיל הדנ&quot;א עלולה להתרחש PCR, זה מעכב מתאם ספציפי פריימר חישול עם מולקולת ה-DNA, וכתוצאה מכך יעילות הגברה נמוכה בהרבה את מספר מחזורי הראשון. אחרי ה-DNA היעד היה מוגבר על מחזורים, סכום שלה עשוי להיות הרבה יותר גדול מאשר התגובות האלה ספציפי, ויכול להקל על התחרות של פריימר חישול את מולקולות ה-DNA היעד. זו גם הסיבה שאנו עשויים לראות הגברה רקע, ומדוע המוצר הראשון בסיבוב PCR צריך להיות מדולל כדי להקטין amplification.It רקע חשוב להסיר primers עודף מן התגובה PCR על מנת להקטין את הרקע בסיבוב השני של ה-PCR. כמו בכל PCR מבוססי ניסויים, חיוני לתכנון primers שלא נמצאים ברצף אזורים חוזרים, המהווים את רוב הדנ&quot;א האנושי ועכבר. למרות פיתח מתודולוגיה Hi-C יכול להיות מיושם על המחקר של הגנום כולו DNA העמותה, assay ACT עדיין טכניקה יעילה ללימוד האינטראקציה מוקד ספציפי DNA.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI1640 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400-105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15512-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP solution, 10mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM8110G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Tris pH8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM9856</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12091-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15525-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15505-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BamH I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0136T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bgl II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0144M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dpn II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0543T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Msp I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0106S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>N0447L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>P8102S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>M0202T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37% formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F8775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>146072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>50046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>93482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11754599001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KlenTaq1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ab peptides</td>
<td>1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dCTP alpha P32</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>BLU513H250UC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTC-100 Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MJ Research</td>
<td>mjptc100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>164-5056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OmniPAGE Maxi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aurogene Life Science</td>
<td>VS20D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Typhoon 9400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare </td>
<td>63-0055-78</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

מידע גנטי המקודד על ידי ה-DNA מאורגן במבנה הכרומטין מורכב פיקוח הדוק. כל כרומוזום תופסת שטח ספציפי, זה עלול להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחות או מחזור התא. התבטאות גנים יכולה להתרחש במפעלים תעתיק התמחה בו קטעים הכרומטין יכול לולאה החוצה מהשטחים כרומוזומים שונים, המוביל לוקליזציה שיתוף קטעי DNA אשר עשוי להתקיים על כרומוזומים שונים או רחוקים אחד מהשני על כרומוזום זהה. מלכודת Associated כרומוזום (ACT) assay מספק מתודולוגיה יעילה לזהות אלו לטווח ארוך עמותות DNA באופן בלתי משוחד על ידי הרחבת ושינוי קונפורמציה כרומוזום טכניקת לכידת. Assay ACT מאפשר לנו לחקור את מנגנוני הרגולציה תעתיק של טרנס, ויכול לעזור להסביר את היחס של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה נורמלי במצבי מחלה.

Watch this Scientific Journal Video about Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions at JoVE.com

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

המלכודת קשורה כרומוזום (ACT) assay היא שיטה חדשנית לזיהוי משוחדת ארוכי טווח אינטראקציות-DNA. אפיון האינטראקציות DNA ארוך טווח תאפשר לנו לקבוע את הקשר של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה הן נורמליות במדינות חולה.

כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

associated-chromosome-trap-for-identifying-long-range-dna-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Views.  Stanford University School of Medicine. המלכודת קשורה כרומוזום (ACT) assay היא שיטה חדשנית לזיהוי משוחדת ארוכי טווח אינטראקציות-DNA. אפיון האינטראקציות DNA ארוך טווח תאפשר לנו לקבוע את הקשר של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה הן נורמליות במדינות חולה.

Video: Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.