Ringraziamo Adelle Murell e Wolf Reik molto per condividere il loro protocollo 3C. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa e il Servizio di Ricerca del Department of Veterans Affairs.

1. Fissazione di formaldeide di interazioni a lungo raggio cromatina <ol><li> Linea cellulare cultura umana HL-60 in RPMI1640 media con FBS 15% e 1 x penicillina / streptomicina al 80-90% confluenza in un incubatore in dotazione con il 5% CO 2 a 37 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml Nunc, centrifugare a 1200 rpm per 15 minuti, quindi rimuovere il supporto per aspirazione </li><li> Aggiungere 5 ml di terreno di coltura per risospendere il pellet cellulare, e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Richiede circa 1 x 10 7 cellule ad un volume di 40 ml con RPMI1640 / 10% FBS, quindi aggiungere 1,7 ml di formaldeide al 37% per fissare la cromatina diluito. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti agitando delicatamente, e poi spegnere con 2,4 ml di 2M glicina. Centrifugare per 15 minuti a 1200 rpm a 4 ° C, e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet una volta con 40 ml di PBS freddo ghiaccio, poi rallenta il precipitato ed eliminare la PBS. </li></ol> 2. Lisi cellulare per isolare nuclei <ol><li> Risospendere le cellule in 40 ml di tampone di lisi freddo ghiaccio (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) con inibitori della proteasi appena aggiunto (diluizione 1:500) e 0,1 mM PMSF. Incubare in una stanza fredda con rotazione per 90 minuti, centrifugare a 2.500 giri per 15 minuti, e rimuovere il surnatante. </li></ol> 3. Digestione con enzimi di restrizione Bgl II <ol><li> Risospendere i nuclei in 0,5 ml di 1 x ONA tampone 3, e aggiungere 15 μlof 10% SDS. Incubare a 37 ° C per 1 ora con agitazione, poi aggiungere 45 ml di 20% Triton X-100 di segregare l&#39;SDS. Incubare a 37 ° C per 1 ora con agitazione. </li><li> Utilizzare un aliquota di 1 x 10 6 nuclei (circa 15 mg, un decimo delle cellule originali) per enzimi di restrizione. Estrarre 55 ml di soluzione di nuclei a partire dal punto 3.1 e portare a 500 microlitri con 433 ml di buffer di 1 x NEB 3 e 12 ml di Bgl II (50U/ul). Incubare a 37 ° C durante la notte. </li></ol> 4. Legatura di segmenti di DNA che interagiscono <ol><li> Inattivare l&#39;enzima di restrizione con l&#39;aggiunta di 95 ml di 10% SDS, e denaturare per riscaldamento a 65 ° C per 20 minuti in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Aggiungere 7 ml di buffer di 1 legatura x (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) e 360 microlitri del 20% Triton X-100 e incubare a 37 ° C per 1 ora . </li><li> Abbassare la temperatura a 16 ° C e aggiungere 50 ml di 400 U / mL DNA ligasi T4. Incubare il campione a 16 ° C per 4 ore e poi a temperatura ambiente per 30 minuti. </li></ol> 5. Purificazione del DNA <ol><li> Aggiungere 300 mg di proteinasi K, e incubare a 65 ° C durante la notte. </li><li> Aggiungere 5 mg di RNasi A e incubare a 37 ° C per 30 minuti </li><li> Purificare il DNA per estrazione fenolo / cloroformio, e il DNA precipitato in isopropanolo. Sciogliere il DNA in 150 ml di acqua distillata sterile. </li></ol> 6. Digestione con Msp I e legatura con linker oligonucleotide <ol><li> Incubare 2μg di DNA purificato con 5 unità di Msp io a 37 ° C per 4-6 ore. Inattivare Msp io a 65 ° C per 10 minuti, poi precipitare il DNA in etanolo con 1 ml di 5 mg / ml di glicogeno. Sciogliere il pellet di DNA in 50 ml di acqua distillata sterile. </li><li> Mescolare 50 ml di Msp I trattati di DNA con 2 ml di uno L 20 oligonucleotide mM linker (5&#39;-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 &#39;), 1 l di un oligonucleotide 20 micron S (5&#39;-cggtgaatc-3&#39;), 1 ml di acqua distillata sterile e 6 ml di buffer di 10 T4 DNA ligasi x. Coprire il composto con cera liquida. </li><li> Oligonucleotidi denaturare a 50 ° C per 1 minuto e lasciar raffreddare gradualmente a 10 ° C a 0,5 A ° C / minuto gradiente in un termociclatore. </li><li> Aggiungere 1 ml di 400 U / mL DNA ligasi T4 e incubare a 15 ° C durante la notte. Purificare il linker-legatura del DNA utilizzando un kit di purificazione QIAquick PCR, ed eluire in 50 ml di acqua distillata sterile. </li></ol> 7. PCR amplificazione e analisi di sequenza <ol><li> Scegli un fondo per la regione specifica di DNA che si vuole esaminare per interazioni a lungo raggio (cioè, il &#39;esca&#39;). In questo esempio, utilizziamo ABL-1. </li><li> Prendere 1 ml di DNA purificato per eseguire il primo round di PCR utilizzando 1 ml di 20 mM ABL -1 primer specifico # 4656 (5&#39;-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 &#39;), 1 ml di 20 mM linker primer specifico # 2963 (5&#39;- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 &#39;), 3μl di 3 x Klen Taq polimerasi del DNA I cocktail e 3 ml di acqua distillata sterile. Due ml di 32 P-dCTP è aggiunta a 100 ml di 3 x Klen DNA polimerasi Taq I cocktail prima PCR. Il ciclo termico per un inizio PCR caldo è 72 ° C per 2 minuti, 95 ° Cfor 2 minuti, 18 cicli di 95 ° C per 20 secondi, 65 ° C per 40 secondi e 72 ° C per 1 minuto, per l&#39;ultima proroga viene eseguita a 72 ° Cper 5 minuti. </li><li> Purificare il primo turno prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione QIAquick PCR e DNA eluire in 30 ml di acqua distillata sterile. </li><li> Prendere 1 ml di 100 x diluito primo prodotto della PCR per effettuare un secondo ciclo di PCR con primer nested con l&#39;aggiunta di 1 ml di 20 mM ABL-1 primer specifico # 4626 (5&#39;-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 &#39;) (Figura 1a), 1 ml di 20 mM di linker primer specifico # 2961 (5&#39;-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 &#39;), 3 ml di 3 x Klen Taq polimerasi del DNA I cocktail e 3 ml di acqua distillata sterile. Il programma cicli termici è di 25 cicli di 95 ° C per 20 secondi, 67 ° C per 40 secondi e 72 ° C per 1 minuto, seguito da un&#39;estensione a 72 ° C per 5 minuti. </li><li> Visualizza i prodotti PCR eseguendo un 5% di urea-PAGE gel e la scansione dello schermo esposti in un PhosphoImager (Figura 1b). Ogni banda PCR possono essere riciclati dal gel, sciogliendo le strisce di gel in una provetta Eppendorf contenente 60 ml di acqua distillata sterile, e incubazione a 95 ° C per 5 minuti. Centrifugare brevemente a 10.000 giri per 10 secondi per raccogliere tutti i campioni. Togliere 1 ml da utilizzare come modello di DNA per eseguire PCR con la coppia di primer 2961/4626 utilizzando le stesse condizioni sopra descritte. Analisi della sequenza può essere eseguita dopo la depurazione utilizzando un kit di purificazione QIAquick PCR. </li><li> Sequenze di DNA vengono analizzati utilizzando un tool online per determinare la loro posizione cromosomica sul sito web: http://genome.ucsc.edu (Figura 1c). Fare clic su &#39;BLAT&#39; per inserire una nuova finestra che permette di incollare una sequenza di DNA, una nuova finestra compare dopo aver cliccato su &#39;submit&#39;, e mostra la &#39;Risultati della ricerca BLAT&#39;. Fare clic su &#39;browser&#39; del colpo con il 100% di identità per entrare in una finestra accanto per mostrare la posizione della sequenza di DNA. </li></ol> 8. Rappresentante Risultati 1. ACT test con ABL-1 regione come esca per determinare le sue interazioni a lungo raggio del DNA Come illustrato nella figura 1a, due Bgl siti II e una BamH io sito sono stati scelti per il test ACT. Nel secondo turno della PCR, set di primer 4626/2961 è stato utilizzato per amplificare ABL-M1, 4630/2961 è stato utilizzato per ABL-M2, e 4636/2961 è stato utilizzato per ABL-M3. Un modello tipico mostra un gel a diverse band (Figura 1b). Ogni frammento di un test ACT si compone di due segmenti di DNA combinati: un segmento deriva dalla regione del DNA esca, mentre il secondo segmento deriva dal partner associato, che è stato unito al segmento regione esca dalla prima sequenza di riconoscimento degli enzimi di restrizione. La seconda sequenza di riconoscimento degli enzimi apparirà alla fine della sequenza partner associati (Figura 1c). Il clonato ABL-M1 frammento contiene il DNA dalla regione di ABL1 situato sul cromosoma 9q32.4 da +133,592,306-133,592,399, e il partner associati si trova al cromosoma 3p13 da +71,869,882-71,870,107. Le identità dei partner associati sono scoperti da sabbiatura loro sequenze utilizzando il browser UCSC genoma (GRCh7/hg19 rilasciato nel febbraio 2009). PROK2 è stato identificato come il partner associati a livello del locus chr3p13. Analogamente, il ABL-M2 partner associato, è stato localizzato a chr5q21.1, mentre il clone ABL-M3 è stato identificato come un intra-cromosomica associazione nei pressi della ABL-1 locus. 2. Determinazione meno diffuso interazioni a lungo raggio tramite test ACT Altri test sulla base di 3C hanno riportato molti partner di interagire più che abbiamo mostrato in figura 1 e al IGF2 / H19 locus 12. La metodologia che abbiamo delineato selezionerà le interazioni più frequenti lungo raggio. Tuttavia, aumentando il numero di cicli di PCR, è possibile individuare ulteriori, associazioni meno frequenti e (Figura 2). 3. Le differenze nelle interazioni a lungo raggio nelle cellule tumorali rispetto ai tessuti normali. Il test ACT può essere utilizzato anche per identificare le differenze di architettura nucleare e di interazioni a lungo raggio tra cellule normali e cellule tumorali (Figura 3). Queste differenze possono riflettere i cambiamenti architettura nucleare che si verificano durante la trasformazione delle cellule e, quindi, in ultima analisi, questo test può essere applicabili per scopi diagnostici. I modelli gel simili che si verificano in tessuti normali e tumorali indicano che il test ACT è affidabile e ripetibile. Mentre il test ACT in grado di identificare i partner a lungo raggio del DNA, ulteriori analisi, come il pesce e saggi ChIP, sono tenuti a verificare la presenza delle associazioni individuate fra loci distanti. Studi genetici, fisiologici e biochimici può essere eseguita per chiarire le implicazioni biologiche di queste associazioni di DNA lungo raggio. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 test ACT con ABL-1 regione del DNA esca in cellule HL-60. a. Struttura del DNAURE nella ABL-1 regione. L&#39;enzima di restrizione la prima volta nel ACT test è stato Bgl II. I primer per il secondo turno di PCR sono anche etichettati da frecce e numeri fondo corrispondenti. b. Modello Gel del test ACT 5% di urea-PAGE. Primer coppia 4626/2961 è stato utilizzato per amplificare clone ABL-M1 nel nested PCR, 4630/2961 è stato utilizzato per clonare ABL-M2, e 4636/2961 è stato utilizzato per clonare ABL-M3. c. Sequenza del DNA del clone ABL-M1. Frammento di DNA da ABL-1 DNA esca è marcato in rosso, e il partner del DNA associate è etichettato in ciano. Bgl II sito (AGACTC) è stato etichettato in verde, e io Msp sito (CCGG) è etichettato in viola. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 cicli di PCR influenzare i risultati del test ACT. Utilizzando la regione di controllo dell&#39;imprinting (ICR) a livello del locus Igf2/H19 come esca DNA in cellule di fibroblasti di topo, diversi programmi ciclistici sono stati applicati nei turni primo e secondo della PCR nel test ACT. 18-20 cicli al primo turno della PCR non amplificare il segnale abbastanza per essere visualizzati. Venticinque cicli nei risultati secondo PCR in bande chiare, mentre aumenta il numero di cicli per secondo turno della PCR indotto un modello di striscio, oltre a più bande. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 Rilevamento delle differenze di architettura nucleare tra il tessuto normale del colon e il cancro del colon in tessuto test ACT. A. Struttura del DNA della regione ICR a IGF2/H19 locus genico e IGF2. DPN siti II per test ACT sono etichettati. Primer utilizzati nel secondo turno di PCR sono etichettati da frecce e numeri in diversi colori che corrispondono a ciascuna corsia in b pannello della figura. b. Modello Gel del test ACT 5% di urea-PAGE. Tessuto del colon normale MAD03-1423 e il cancro dei tessuti del colon MAD04-149 è stato ottenuto da Cooperativa Network tessuto umano (CHTN) Western Division. Dopo ogni tessuto del colon è stato omogeneizzato, test ACT è stata effettuata seguendo le procedure descritte nel presente documento. Corsia 1 rappresenta i risultati PCR utilizzando coppia di primer 2961and # # 4161 (5&#39;-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 &#39;) etichettati in rosa nel pannello a; corsia 2 rappresenta i risultati PCR utilizzando coppia di primer # 2961 e # 4163 (5&#39;-gccgcgcggccacttccgattcc-3 &#39;) etichettati in arancione in un pannello, corsia 3 rappresenta il risultato PCR utilizzando coppia di primer # 2961 e # 5145 (5&#39;-gccatgcaggtaggatttgagctg-3&#39;) etichettati in blu nel pannello a; corsia 4 rappresenta i risultati PCR utilizzando coppia di primer # 2961 e # 5151 (5&#39;-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 &#39;) etichettati in verde nel pannello a. Gruppi unici che appaiono solo nel tessuto del colon normale sono etichettati da frecce gialle, e quelle band che è apparso solo nel tessuto del cancro del colon sono etichettati in frecce rosse. ICR, regione di controllo imprinting, DMR, diversa regione metilato.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Dekker et al. Sviluppato la conformazione cromosoma cattura (3C) approccio per rilevare la frequenza di interazione tra due loci genomici 1, e 3C è stato ampiamente utilizzato per studiare le associazioni intra-e inter-cromosomiche cromosomiche tra le due regioni del DNA in cellule di mammifero conosciuto 2 -9. Anche se di recente sviluppo Hi-C metodologia può essere applicata per lo studio del genoma del DNA associazione, test ACT è ancora una tecnica efficace per lo studio del locus-specifiche interazioni DNA 10-11. Abbiamo modificato questo approccio per identificare le regioni sconosciute del DNA che sono associati a una regione del DNA conosciuto nel topo e cellule umane in coltura (Figura 1). Abbiamo chiamato questo metodo la trappola dei cromosomi associati (ACT) saggio, come ci ha fornito un metodo affidabile e riproducibile per identificare nuovi partner DNA sconosciuto che associano con una regione del DNA bersaglio nota 12. Un test di successo 3C con controlli sia eseguito correttamente prima di eseguire il romanzo aspetti del test ACT 13. Per tofind come molte regioni del DNA associate possibile, è necessario utilizzare diverse combinazioni di enzimi di restrizione prima e seconda. E &#39;particolarmente importante utilizzare gli enzimi di restrizione che sono insensibili alla metilazione CpG di effettuare il primo passo legatura 3C. Legame con le proteine ​​e la metilazione del DNA può anche influenzare l&#39;efficienza degli enzimi di restrizione digestione e possono portare al fallimento della legatura delle regioni del DNA associate per digestioni alcuni enzimi di restrizione. Il verificarsi di legatura intra-o inter-cromosomiche dipende dalla proteina-DNA cross-linking e appropriato mappe fisiche di entrambe le regioni di DNA associate. Così, alcuni esperimenti preliminari sono essenziali per stabilire una concentrazione di formaldeide efficace e praticabile tempo di trattamento nel test ACT. Una gamma di concentrazioni finali di formaldeide (from1.5% al 2%) sono stati utilizzati in molti laboratori durante la fase 3C del dosaggio 7,9. In alternativa, gli oligonucleotidi usati come linker può essere progettato per abbinare la fine coesa tagliato dall&#39;enzima di restrizione secondo. Anche se abbiamo scoperto che i cicli di 18-20 nel primo turno della PCR e 20-25 cicli al secondo turno della PCR potrebbe fornire bande chiare, è necessario stabilire le migliori condizioni di PCR per ogni esperimento (Figura 2). Intra-molecola ricottura tra 5&#39;-end e 3&#39;-end adattatore sequenza complementare di un filamento di DNA si può verificare in PCR, inibisce l&#39;adattatore specifico fondo di ricottura con la molecola di DNA, e aumentare l&#39;efficienza dell&#39;amplificazione molto più bassa nei primi cicli diversi. Dopo che il DNA bersaglio è stato amplificato per i cicli, il suo importo può essere molto più grande di queste reazioni non specifiche, e può facilitare la concorrenza di primer ricottura di molecole di DNA bersaglio. È anche per questo possiamo vedere l&#39;amplificazione di fondo, e perché il primo prodotto della PCR turno deve essere diluito per diminuire amplification.It sfondo è importante rimuovere i primer in eccesso dalla reazione di PCR al fine di diminuire il fondo nel secondo turno della PCR. Come in tutti gli esperimenti di PCR-based, è di vitale importanza per la progettazione primer che non si trovano in regioni sequenza di ripetizione, che costituiscono la maggior parte del DNA umano e del mouse. Anche se di recente sviluppo Hi-C metodologia può essere applicata per lo studio del genoma del DNA associazione, test ACT è ancora una tecnica efficace per lo studio del locus-specifici di interazione DNA.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI1640 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400-105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15512-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP solution, 10mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM8110G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Tris pH8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM9856</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12091-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15525-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15505-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BamH I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0136T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bgl II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0144M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dpn II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0543T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Msp I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0106S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>N0447L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>P8102S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>M0202T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37% formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F8775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>146072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>50046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>93482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11754599001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KlenTaq1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ab peptides</td>
<td>1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dCTP alpha P32</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>BLU513H250UC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTC-100 Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MJ Research</td>
<td>mjptc100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>164-5056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OmniPAGE Maxi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aurogene Life Science</td>
<td>VS20D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Typhoon 9400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare </td>
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associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

Informazione genetica codificata dal DNA è organizzato in una struttura complessa e altamente regolamentato cromatina. Ogni cromosoma occupa un territorio specifico, che può cambiare a seconda dello stadio di sviluppo o del ciclo cellulare. L&#39;espressione genica può avvenire in impianti specializzati dove trascrizionale segmenti cromatina può ciclo fuori dai territori cromosoma varie, portando a co-localizzazione di segmenti di DNA che possono esistere su cromosomi diversi o distanti sullo stesso cromosoma. The Associated Trappola cromosoma (ACT) test fornisce una metodologia efficace per identificare questi a lungo raggio associazioni del DNA in modo distorti da estendere e modificare la conformazione tecnica del cromosoma cattura. Il test ACT rende possibile per noi di indagare i meccanismi di regolazione trascrizionale in trans, e può aiutare a spiegare il rapporto tra architettura nucleare per l&#39;espressione genica nella fisiologia normale e durante stati di malattia.

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Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

La trappola dei cromosomi associati (ACT) saggio è un nuovo metodo imparziale per identificare interazioni a lungo raggio del DNA. La caratterizzazione delle interazioni a lungo raggio del DNA ci permette di determinare la relazione di architettura nucleare per l&#39;espressione genica sia in fisiologia normale e in stati malati.

Cromosoma Trappola associate per identificare interazioni a lungo raggio del DNA

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Views.  Stanford University School of Medicine. La trappola dei cromosomi associati (ACT) saggio è un nuovo metodo imparziale per identificare interazioni a lungo raggio del DNA. La caratterizzazione delle interazioni a lungo raggio del DNA ci permette di determinare la relazione di architettura nucleare per l'espressione genica sia in fisiologia normale e in stati malati.

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Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Ricerca

Biologia

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l&#39;etichettatura di anticorpi

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: Genome-wide Mappatura delle interazioni proteina-DNA da High Throughput Sequencing di Adenina-metilato frammenti di DNA

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.