שיטה זו מפריעה לזרימת הלימפה עם נזק מינימלי לתאי אנדותל הלימפה, ועם שליטה מדויקת בתזמון המצור, ניתן להשתמש בה כדי לחקור כיצד זרימת הלימפה משפיעה על הונוסטזיס ותגובות חיסוניות בצומת הלימפה. עוזר להדגים את ההליך יהיה ג'ינגנה שו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להכין מנגנון הזרקה, לחתוך כ 30 ס"מ של צינורות פוליאתילן.
חבר את קצה המחט A לקצה אחד של הצינור. בזהירות לנתק מחט אחרת, ולחבר את הצד השבור לקצה השני של צינורות פוליאתילן. ואז לצרף מחט A למזרק שחפת מיליליטר אחד.
מיד לפני השימוש, להכין 10:1 קטמין-xylazine תערובת מלוחים. לאחר הרדמה של העכבר על ידי הזרקת 250 מיקרוליטרים של תערובת קטמין/קסילאזין תוך-אפית, להבטיח הרדמה מלאה עם קמצוץ בוהן. לגלח את הפרווה סביב הרגליים עם קוצץ שיער, ולאחר מכן להחיל קרם depilatory סביב הרגל.
לאחר חמש דקות, לנגב את הפרווה שיורית ואת קרם depilatory באמצעות רקמה לחה, ולאחר מכן לנקות את הרגל עם מים סטריליים. יש לרסס 70% אתנול סביב הרגל כדי לעקר את אזור ההפעלה. מניחים את העכבר בתקרת נוטה, ולהשתמש בקלטת כירורגית כדי לחשוף את אזור הניתוח ברגל ימין.
מוזרקים תוך-תאית חמישה מיקרוליטרים של צבע כחול 1%Evans, או תשעה סנטימטרים של הנוזל מצנרת ההזרקה צינורות לתוך כרית הרגל הימנית של העכבר. לעסות בעדינות את כף הרגל כדי לעזור לנוזל להיכנס כלי הלימפה. תחת מיקרוסקופ לנתח, לאתר אתר חתך חמישה מילימטרים מהקצה התחתון של אופוסה popliteal.
באמצעות זוג מספריים, לעשות חתך קטן כחמישה מילימטרים אורך. לאחר מכן השתמש מלקעות פעולה בסדר כדי למתוח את החתך ולחשוף את כלי הלימפה איסוף. זהה את שני כלי הלימפה afferent המוביל בלוטות הלימפה popliteal.
באמצעות מחזיק מחט, בזהירות להכניס את מחט התפר בין כלי הלימפה afferent ואת העורק saphenous. משוך בעדינות את המחט סביב כלי הלימפה. בזהירות למשוך את חוט התפר, משאיר כשני סנטימטרים של חוט התפר מאחור.
השתמש במחזיק המחט כדי לעזור לקשור קשר של מנתח. לעסות בעדינות את כרית כף הרגל כדי להבטיח שום צבע כחול אוונס עובר את אתר התפר, ולאחר מכן לחתוך את החוט עודף עם מספריים. תפר את כלי הלימפה אדישים אחרים, ולאחר מכן לסגור את החתך בעור עם אותו תפר ששימש עבור כלי הלימפה.
לשליטה מזויפת, להזריק תוך אדרה חמישה microliters של 1% צבע כחול אוונס כרית רגל שמאל, לעסות את כרית הרגל. פתח את העור עם חתך, ולאחר מכן לסגור את הפצע מבלי לתתבוע את הכלי. בעת ניטור העכבר לאחר הניתוח, הרגל הימנית צריכה להראות בצקת, עם צבע כחול אוונס מתפשט לירך, בעוד רגל הבקרה תראה צבע כחול אוונס מוגבל כרית הרגל.
מיד לאחר הניתוח, להזריק תוך אדרה 10 microliters של 2%FITC הן כרית רגל ימין והן בצד שמאל. שעתיים, שש ו-12 שעות לאחר הזרקת FITC, אוספים את בלוטות הלימפה הפופליטיות מהפוסה של עכברים שעברו המתת לחץ. בזהירות להסיר את רקמת שומן perinodal סביב pLNs.
להטמיע את pLNs בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית עם אזור סינוס medullary פונה לצד של עובש קריו. השתמש קריוטום להכין חלקים קפואים 20 מיקרון. כדי לקבוע את התפלגות FITC ב- pLNs, צלמו את קטעי ההקפאה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
תמונות קונפוקל שנתפסו שעתיים, שש, ו 12 שעות לאחר הזרקת FITC להראות מופחת באופן משמעותי הצטברות FITC בבלוטות הלימפה popliteal לאחר תופר את כלי הלימפה afferent. FITC שיורית ב- pLNs הצטברה באופן מועדף בסינוסים הלימפה. תמונות confocal של רקמת שומן perinodal להראות כאשר כלי הלימפה נחסמים על ידי תפור, FITC נכנס לרקמה כאשר בלוטות הלימפה סינוסים, אבל זה לא מופץ ביעילות לאורך בלוטות הלימפה.
כאשר מנסים שיטה זו, חשוב לזכור כי החדרת מחט התפר בין כלי הדם לבין כלי הלימפה היא קריטית. כישלון של צעד זה עלול לשבור את כלי הדם. לאחר ביצוע שיטה זו, ניתן לחסן עכברים עם זיהום או גירוי חיסוני אחר כדי ללמוד כיצד זרימת הלימפה מווסתת את ההגנה החיסונית.
הפונקציה של זרימת הלימפה אינה מובנת היטב. שיטה זו יכולה לשמש לחקר נדידת תאים בצומת הלימפה בהעדר זרימת הלימפה.
