Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation.

1. Giorno 1 Prima di iniziare: Una popolazione sana di mosche devono essere mantenuti utilizzando protocolli standard di coltura: rimuovere gli adulti da bottiglie o flaconi dopo 3-4 giorni di uova laici e consentire lo sviluppo di procedere ad una temperatura costante fino a vagare 3 ° larve instar avviare pupariation. La transizione larva / pupa è caratterizzato dalla formazione del prepupae (considerato 0 ore dopo puparium formazione-APF). Pupe immobile si distinguono dai vecchi pupe per la loro colorazione bianca e dalle larve che non hanno ancora iniziato pupariation dai loro allungata, la forma arrotondata e protrusione della spiracoli anteriori. Avrete bisogno di: <ul><li> Un pennello per la raccolta delle pupe </li><li> Una camera umida per pupe coltura: una piastra di Petri foderato con un tovagliolo di carta bagnata e ricoperta con carta da filtro marcato per i vari momenti della raccolta, genotipo o il sesso delle pupe </li><li> 1X tampone fosfato salino (PBS) per il lavaggio delle pupe </li></ul> La raccolta, la coltura e messa in scena pupe <ol><li> Utilizzando un pennello bagnato rimuovere delicatamente 0hr APF pupe da bottiglie cultura / fiale e metterli nel coperchio della camera umida. </li><li> Utilizzando il pennello e PBS 1X lavare delicatamente le pupe per rimuovere i detriti dal caso pupa </li><li> Se necessario, specie le pupe per sesso. I primordi della gonade pupe può essere utilizzato per ordinare i sessi. I primordi gonade maschile sono una coppia di dischi laterali traslucidi facilmente visibile attraverso la cuticola pupale circa 2 / 3 per tutta la lunghezza del corpo 5. I primordi gonade femminile sono più piccole e non facilmente identificabili. </li><li> Mettere le pupe in posizione adeguatamente etichettati nella camera umida e tornare a temperatura costante. Cultura al punto di orario appropriato sviluppo. </li></ol> 2. 2 ° giorno: dissezione, la fissazione e l&#39;incubazione dell&#39;anticorpo primario Prima di iniziare: Avrete bisogno di: <ul><li> Dissezione stereomicroscopio </li><li> Pinze chirurgiche </li><li> Bisturi chirurgico con numero 11 lame </li><li> Due nove e vetro piatti depressione (prodotto Corning # 7220-85) <ul><li> Riempire i pozzi di un piatto con PBS 1X: Questo è il piatto risciacquo per la pulizia pupe sezionato </li><li> Riempire i pozzi di secondo piatto con il tampone di fissaggio </li></ul></li><li> Camera umida per l&#39;incubazione degli anticorpi. Utilizziamo scatole di plastica richiudibile panino foderato con carta da cucina bagnato. </li><li> Fissazione buffer: 1x PBS, paraformaldeide 4%, 0,2% di acido desossicolico (per la permeabilizzazione) </li><li> Dissezione piattaforma: vetrino da microscopio trasparente con un pezzo di nastro biadesivo aderito a un lato </li><li> PBS 1X </li><li> P100 o P200 pipettatore </li></ul> Dissezione <ol><li> Utilizzando pinze delicatamente rimuovere una pupa alla volta e metterli sulla piattaforma dissezione con la fine anteriore delle pupe di fronte alla più ampia larghezza del nastro. Se pupe sono eccessivamente umidi, prima macchia asciugare con un tovagliolo di carta. </li><li> Prima che le pupe hanno completamente aderito al nastro, utilizzare un pennello per posizionarli. </li><li> Lasciare le pupe di aria secca e aderire al nastro (5-10 minuti) </li><li> Con il bisturi sezionare ogni pupe bilateralmente. Questo è meglio realizzato con un unico taglio rapido da anteriore a posteriore la fine delle pupe. Se fatto correttamente, il taglio sarà diviso in parti uguali sia anteriore che posteriore coppie spiracoli. Sezionare non più di 10 pupe in un momento come il lavaggio e la pulizia dei campioni è rapidamente necessaria per evitare danni al tessuto proteolitici. </li><li> Utilizzando un pennello, trasferire una piccola quantità di PBS 1X ad ogni pupe sezionato in modo da separarli dal nastro. </li></ol> La pulizia, la fissazione e l&#39;incubazione dell&#39;anticorpo primario <ol start="6"><li> Con un paio di pinze chirurgiche afferrare un mezzo individuale pupa anteriormente e subito immergere in un pozzo del piatto risciacquo. La piattaforma dissezione dovrebbe essere sostituito con il piatto risciacquo sul palco microscopio. Il caso pupe dovrebbero essere lasciati sul campione fino a quando l&#39;elaborazione è completa e campioni sono pronti per il montaggio. </li><li> Mentre ancora afferrare la metà pupa utilizzare una pipetta per lavare via delicatamente il tessuto interno dell&#39;addome. Troppa pressione durante il lavaggio può portare alla perdita di cellule epiteliali. </li><li> Trasferire immediatamente la parte pulita pupa al buffer fissazione a temperatura ambiente e di processo le due metà rimanente pupa in modo simile. Con la pratica, la dissezione e il lavaggio di 20 parti pupa dovrebbe richiedere meno di 5 minuti. </li><li> Lasciare pupe ad incubare nel buffer fissazione a temperatura ambiente per 1 (una) ora. </li><li> Sciacquare fisso pupe 3x cinque minuti in PBS 1X </li><li> I campioni possono immediatamente essere trattati per immunoistochimica o possono essere conservati in 100% etanolo a -20 ° C per un massimo di 3 mesi senza perdita di cellule o di reattività epitopo. </li><li> Per conservare i campioni, campioni equilibrare attraverso una diluizioneserie di PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) a temperatura ambiente per 20 minuti in ciascuna diluizione prima di trasferire il 100% EtOH. </li><li> I campioni devono essere riequilibrati in PBS attraverso la serie inverso prima della lavorazione per immunoistochimica. </li><li> Blocco campioni in 1x PBS (integrata con il 2% di albumina sierica bovina) per 1 (una) ora prima aggiunta di anticorpo primario. </li><li> Incubare con anticorpo primario diluito a concentrazione adeguata in PBS 1X per tutta la notte a 4 ° C senza dondolo. </li></ol> 3. 3 ° giorno: l&#39;incubazione degli anticorpi secondari, di montaggio e di imaging Prima di iniziare: Avrete bisogno di: <ul><li> Due pinze chirurgiche </li><li> Mezzi di montaggio (glicerolo, Vectashield [Labs Vettoriale], o Slowfade Oro [Invitrogen]) </li><li> Depressione vetrini da microscopio bene (0,8 mm) </li><li> Coprioggetti (24 x 40 mm) </li></ul> Anticorpi incubazione secondaria e di montaggio: <ol><li> Lavare i campioni 3x 10 minuti ciascuno con PBS 1x </li><li> Blocco campioni in 1x PBS (integrata con il 2% di albumina sierica bovina) per 1 (una) ora prima aggiunta di anticorpo secondario. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito a concentrazione adeguata in PBS 1X a temperatura ambiente al buio senza dondolo per 3 (tre) ore. </li><li> Lavare i campioni 3x 10 minuti ciascuno con PBS 1x </li><li> Se del caso, di contrasto pupe (Esempio abbiamo macchia nuclei con DAPI [4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo] diluito in PBS per 10 minuti). </li><li> Equilibrare campioni (minimo di 30 minuti) nelle matrici appropriate prima del montaggio. </li><li> Preparare una diapositiva campione. La morfologia delle pupe impedisce di montaggio piatto. I campioni sono montati nel pozzo di una diapositiva depressione (scivolo goccia) per l&#39;imaging. Posto 75-100ul di mezzi di montaggio nella depressione bene. Diversi campioni può essere montato su una singola diapositiva. </li><li> Il caso pupa deve essere rimosso dai campioni prima del montaggio. Afferrare un singolo caso pupa anteriormente essere sicuri di non cogliere la membrana interna pupa. </li><li> Con un secondo paio di pinze afferrare delicatamente la membrana interna pupa per la testa e rimuoverla dalla custodia pupa. </li><li> Trasferire immediatamente il campione alla depressione bene e continuare a trattare campioni aggiuntivi. </li><li> Usando una posizione della sonda o pinze i campioni in modo uniforme alla depressione e con la superficie laterale verso l&#39;alto. Bolle d&#39;aria occasionali possono essere rimossi con una sonda. </li><li> Abbassare delicatamente il vetrino sulla campioni facendo attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Campioni preparati utilizzando questo protocollo conservano la morfologia lordo dell&#39;addome adulto. Pile immagine può essere proiettata per generare una immagine bidimensionale o 3-D di rendering può essere applicato per studiare topologia addome. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Prodotti segmentazione genica in Drosophila pupe proteine ​​senza ali e di espressione Engrailed (En-GAL4: UAS-GFP). Sono stati visualizzati a 26 ore dopo la formazione puparium (APF) con il mouse anti-Wg (4D4: Iowa Ibridoma Bank) e anti-GFP. Ingrandimento 10x, anteriore è a sinistra e dorsale è alto. Nuclei sono stati di contrasto con DAPI. Pile di circa 50 immagini (ΔZ tra le sezioni è 2.5μm) sono stati proiettati.

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le tecniche presentate in questo video può essere utilizzato per preparare Drosophila pupe da una varietà di punti di tempo dello sviluppo. Pupe lavorato durante il periodo di 24 ore a 32 ore APF APF sono più inclini alla perdita delle cellule dell&#39;epitelio. L&#39;uso di detergenti (come il Triton X-100 e Tween-20) durante le fasi di incubazione prolungato aumenta la probabilità di perdita di cellule e non è pertanto raccomandato. Piuttosto, l&#39;acido desossicolico è usato come detergente durante la fase iniziale di fissazione. Tutti i passaggi successivi sono eseguiti in PBS 1X senza detersivo. Inoltre, a dondolo campioni durante le fasi di incubazione prolungato aumenta la perdita di cellule e deve essere evitato. I campioni possono essere esposte utilizzando tecniche di microscopia confocale. Tuttavia, Drosophila pupe trattati come descritto può essere ripreso con un articolato sistema di microscopia illuminazione cedendo qualità d&#39;immagine paragonabile a tecniche confocale.

<ul><li> Dissezione stereomicroscopio </li><li> Pinze chirurgiche </li><li> Bisturi chirurgico con numero 11 lame </li><li> Nove e vetro piatti depressione (Corning prodotto # 7220-85) </li><li> Camera umida per la coltura pupe </li><li> 1X tampone fosfato salino (PBS) </li><li> # 11 bisturi </li><li> nastro biadesivo </li><li> Fissazione buffer: 1x PBS, paraformaldeide 4%, 0,2% di acido desossicolico (per la permeabilizzazione) </li><li> P100 o P200 pipettatore </li><li> Depressione vetrini da microscopio bene (0,8 mm) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

L&#39;addome Drosophila pupa è un sistema modello stabilito per lo studio della morfogenesi epiteliale e lo sviluppo di dimorfismo sessuale morfologie 1-3. Durante impupamento, che si estende su circa 96 ore (a 25 ° C), le popolazioni di cellule proliferanti immaginale sostituire l&#39;epidermide larvale per generare i segmenti addominali adulto. Queste cellule immaginale, nato durante l&#39;embriogenesi, esistono come coppie di laterali di nidi histoblast in ogni segmento addominale delle larve. Quattro paia di nidi histoblast dar luogo alla cuticola adulti dorsale (nidi dorsale anteriore e posteriore), la cuticola ventrale (nidi ventrale) e gli spiracoli associati a ciascun segmento (nidi spiraglio) 4. Su puparation, queste cellule diploidi (distinguibili in base alle dimensioni dal più grande poliploidi larvale cellule epidermiche-LEC) avviare un processo stereotipata di proliferazione, migrazione e sostituzione del LEC. Vari strumenti molecolari e genetici possono essere utilizzati per indagare i contributi di percorsi genetici coinvolti nella morfogenesi del ventre adulto. Fenotipi adulti finale sono tipicamente analizzati i seguenti dissezione degli adulti cuticole addominale. Tuttavia, dall&#39;indagine dei processi molecolari alla base richiede analisi immunoistochimica dell&#39;epitelio pupa, che presentano sfide particolari. Temporalmente morfogenesi dinamica e le interazioni di due popolazioni distinte epiteliali (larvale e immaginale) generano un tessuto fragile, soggetta a perdita di cellule eccessiva durante la dissezione e l&#39;elaborazione successiva. Abbiamo sviluppato metodi di dissezione, fissazione, montaggio e imaging del abdominem epitelio Drosophila pupa per gli studi immunoistochimici che generano coerente campioni di alta qualità adatto per un microscopio confocale o fluorescenti.

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Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Colorazione degli anticorpi della<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupe può migliorare analisi genetiche di adulti addominale genetica dello sviluppo. Vi presentiamo il nostro protocollo per la colorazione dissezione, la fissazione di anticorpi e di messa in scena<em&gt; Drosophila</em&gt; Addome pupa.

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

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Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

16.2K Views.  University of Alabama. Colorazione degli anticorpi della Drosophila Pupe può migliorare analisi genetiche di adulti addominale genetica dello sviluppo. Vi presentiamo il nostro protocollo per la colorazione dissezione, la fissazione di anticorpi e di messa in scena Drosophila Addome pupa.

Video: Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Sezionamento sottile fetta di preparativi per immunoistochimica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

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In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ hybridizations, a mainstay of developmental biology, are useful to study the spatial and temporal patterns of gene expression in developing tissues at the level of transcription. If antibodies that target the protein products of gene transcription have not yet been developed, and/or there are multiple gene copies of a particular protein in the genome that cannot be differentiated using available antibodies, in situs can be used instead. While an in situ technique for larval wing discs has been available to the butterfly community for several years, the current protocol has been optimized for the larger and more fragile pupal wings.

In order to examine gene expression in the pupal wing tissue of Bicyclus anynana, we present an optimized protocol for in situ hybridizations using riboprobes. We also provide guidelines for the further optimization of this protocol for use in pupal wings of other Lepidopteran species.

Nel protocollo in situ per Ali di farfalla pupa Utilizzando Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunoistochimica: sezioni di paraffina Utilizzando il Vectastain ABC Kit Labs Vector

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila larvali NMJ Immunoistochimica

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging attraverso il caso pupa di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Dissezione e Montaggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; pupa Dischi Eye

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.