עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי כספים הניתנים על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בשארלוט, קרן יסוד Wachovia למצוינות סגל, ומענק מNIGMS (R15GM101571).

1. הכנת LSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפרדעי נשים (Xenopus laevis) מוזרקות פעמים לאיסוף ביצים. הזריקה הראשונה (יחול) היא 100 U PMSG (Mare הסרום גונדוטרופין הריון) לצפרדע. צפרדעים חייבות להיות דרוכות לפחות ימים לפני ביצת גרימת הנחת וצפרדעים דרוכות הן שמישות לתקופה של עד שבועות. לצפרדעי ממשלה, להזריק PMSG תת עורית בגב הצ&#39;קים הלימפה באמצעות מזרק 3 מ&quot;ל ומחט 27 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגרום להטלת ביצים, להזריק 500 U (gonadotrophin כוריוני האנושי) hCG לצפרדע דרוכה תת עורי בגב הצ&#39;קים הלימפה באמצעות מחט 27 G. דגירת צפרדעים הזריקו בדלי נפרד המכיל 2 ליטר של הפתרון של 1x מארק modified של רינגר (MMR). אפשר צפרדעים 14-20 שעות כדי להטיל את ביצים לפני שהאוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצפרדעים מהדליים ולשפוך את פתרון MMR עד לסביבות 100 מ&quot;ל שנותר. להשיג ביצים מהדליים ידי העברת ביצים לכוס 250 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי Dejelly ידי הוספת 100 מ&quot;ל של ציסטאין 2% (להתאיםpH ל -7.8 עם 10 M KOH). ערבלו בעדינות את הביצים עם pipet הפוך זכוכית פסטר (0.7 סנטימטרי קוטר) בערך כל שנייה 30. למזוג ולהחליף עם ציסטאין הטרי פעמים במהלך דגירה. תהליך dejellying יושלם בכ 5-15 דקות, כאשר את הביצים ליצור שכבה מרוכזת יותר בתחתית הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את פתרון ציסטאין ולשטוף ביצים שלוש פעמים עם MMR 0.25x. לערבל את הביצים בפתרון על ידי pipet זכוכית. ביצים &quot;רעות&quot; נקבעות על ידי בדיקה ויזואלית פשוטה ולבן &quot;נפוח&quot; בהופעה. את הביצים &quot;הרעות&quot; תצטברנה במרכז הכוס לאחר מתערבל. הסר ביצים &quot;רעות&quot; על ידי pipet פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הביצים עם ביצת תמוגה חוצצת (ELB) שלוש פעמים. הסר את כל ביצים נוספות &quot;רעות&quot; על ידי pipet פסטר. יוצק את הביצים לתוך צינור 14 מ&quot;ל פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור פלקון עבור 55 שניות ב188 XG (1,100 סל&quot;ד) באמצעות צנטריפוגות הקלינית CL2 IEC טבלה העליונה עם הרוטור דלי מתנדנד לדחוס את הביצים. הסר חיץ עודף מעליון של שכבת הביצה. הוסף 0.5 μl של / מניות Aprotinin Leupeptin ו -0.5 μl של מניית B Cytochalasin למ&quot;ל של ביצים דחוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ביצים ב16500 XG (10,000 סל&quot;ד) במשך 15 דקות ב 4 ° C באמצעות Sorvall RC6 תוספת צנטריפוגה SuperSpeed ​​עם הרוטור הדלי HB6 מתנדנד. לאחר צנטריפוגה, ביצים מופרדות לשלוש שכבות בצינור: שומנים, חילוץ וחלמון / פיגמנט מלמעלה עד למטה, בהתאמה. לנקב את הצד של צינור פלקון בחלק התחתון של שכבת תמצית האמצע עם מחט 21 G. מוציא בזהירות את המחט כפי שהכשילה את מחט הניקוב בפלסטיק. הכנס מחט טריה 21 G מחוברת למזרק 1 מ&quot;ל לאתר לנקב לאסוף את התמצית. לאט לשאוב לתוך מזרק התמצית, כדי למנוע בועות אוויר וזיהום מים עם השומנים וחלמון / פיגמנט שכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התמציות לתוך צינור microcentrifuge מצונן 1.5 מ&quot;ל. לכל מ&quot;ל של תמצית ביצים, להוסיף את פתרוני המניות הכימיות הבאים לריכוז סופי dicated (בסוגריים): (1) 10 Cycloheximide μl (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל); (2) 1 μl Aprotinin / Leupeptin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כל אחד); (3) 1 μl Cytochalasin B (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ); (4) 1 Dithiothreitol μl (מ&quot;מ 1); ו( 5) Nocodazole μl 0.33 (3 מיקרוגרם / מ&quot;ל). הפוך את הביצה לחלץ לפחות 10 פעמים בעדינות. זה LSE, שחייבת להתבצע טרי ולהשתמש בו בתוך 4 שעות. איכות LSE נפגעת לאחר 4 שעות או הקפאה, הפשרה. </li></ol> 2. טיפול בכרומטין הזרע עם DNA גישות לגרום ניזק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין זרע התקין על פי השיטה שתוארה בעבר 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין זרע MMS טופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הכרומטין זרע נורמלי ב0.5 מ&quot;ל המאגר X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ~ 5.5 μl של MMS (9.1 מ &#39;במלאי) עד 500 μl resuspended הכרומטין לריכוז סופי של 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הכרומטין זרע בצינור microcentrifuge בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ברוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מ &#39;צינור icrocentrifuge ב686 XG (2,100 סל&quot;ד) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר באמצעות צנטריפוגות הקלינית IEC CL2 עם הרוטור דלי מתנדנד ומתאמי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלול ב 0.5 מ&quot;ל של ההצפה X בתוספת BSA (3%), DTT (0.1 מ&quot;מ) וAprotinin / Leupeptin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים (4) ו (5) פעמים כדי לשטוף את הכרומטין הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הריכוז של הכרומטין זרע עם hemocytometer ולדלל ל100.000 זרע / μl. שמור 5 aliquots μl במקפיא ° C -80 לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין הזרע UV טופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סכום רצוי (10 μl למשל) של הכרומטין הזרע התקין על פני השטח של פיסת Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח Parafilm לcrosslinker UV. הגדרת פרמטר רצוי אנרגיה, בהתאם לניסוי שלך, ולהתחיל לפגוע הכרומטין הזרע באמצעות אור UV. לדוגמה, זה לוקח כ 21 שניות כדי להגיע ל1000 J / מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר UV irradiation הכרומטין, UV טופל הזרע יש להוסיף לתמציות ביצים באופן מיידי. </li></ol></li></ol> 3. הכנת מבנה ה-DNA ניזק מחקים (AT70) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 2 oligonucleotides הסינטטי פולי-(DA) 70 (מיועד כA70) ופולי-70 (dT) (מיועד כT70) במים לריכוז של 2 מיקרוגרם / μl, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של A70 ו 100 μl של T70 לצינור microcentrifuge 1 1.5 מ&quot;ל. מרתיח פתרון מעורב סינטטי Oligo למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס בheatblock. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בלוק האמבטיה היבשה החוצה (עם הצינור המכיל תערובת AT בו), ולתת לו להתקרר לטמפרטורת חדר על שולחן מעבדה. התאמת טמפרטורה זה לוקחת בערך 45-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התערובת המקוררת היא AT70 עם ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. 10 μl החנות של AT70 aliquots ב-20 ° C מקפיא לשימוש נוסף. </li></ol> 4. מפעיל מחסום הניזק לדנ&quot;א בLSE עם הכרומטין זרע הפגום או ניזק לדנ&quot;אמחקי מבנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסום לגרום ניזק לדנ&quot;א בLSE בכרומטין זרע פגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של LSE לצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 ומשלים אותו עם μl 1 מתוך תערובת אנרגיה ו2 μl של הכרומטין זרע הפגום (ריכוז סופי ~ 4000 זרע / תגובת μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צינור התגובה בטמפרטורת חדר למשך 90 דקות ולהעיף את הצינור כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר μl 1 מתוך תערובת תגובה לשקופית מיקרוסקופ השלימה עם μl 1 מתוך פתרון לצבוע גרעיני לאחר דגירה 30-דקות. הנח תלוש כיסוי מעל תערובת התגובה ולבדוק להיווצרות גרעינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל, גרעיני סיבוב יהוו לאחר 30 דקות של דגירה, המציין שכפול הדנ&quot;א יזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl של תערובת התגובה ל90 μl של חיץ מדגם. דגימות מנותחות באמצעות immunoblotting באמצעות אנטי Chk1 P-S344 או נוגדנים כנגד Chk1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום ניזק לדנ&quot;א במחסום עם LSEAT70 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של LSE לצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 בתוספת עם μl 1 מתוך תערובת אנרגיה ו -1.6 μl מניות Tautomycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.25 μl של AT70 המוכן מראש (2 מיקרוגרם / μl) או מים (כשליטה שלילית) לכל תגובה. דגירה את התגובות בטמפרטורת חדר במשך 90 דקות. פליק צינורות התגובה כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של תערובת התגובה ל90 μl של חיץ מדגם. דגימות נבדקות באמצעות immunoblotting באמצעות אנטי Chk1 P-S344 או נוגדנים כנגד Chk1. </li></ol></li></ol> 5. נציג תוצאות הכרומטין הזרע הפגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים יכול לגרום הניזק לדנ&quot;א מחסום ATR/Chk1-mediated במערכת תמצית ביצת Xenopus. מופעי 2A דמות שMMS גורם Chk1 זירחון בSer344 (Chk1 P-S344), המהווה אינדיקטור הפעלת קינאז ATR. 2B האיור מראה כי AT70, כמו ה-DNA ניזק מחקי struצלום, גם מפעיל Chk1 זרחון. דגימות Chk1 סך הכל משמשות כטעינת פקדים בשתי הדוגמות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> איור 1. תרשים של איתות מחסום הניזק לדנ&quot;א. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> איור 2. Chk1 זירחון מושרה על ידי אחד MMS או AT70 טיפולים בתמציות Xenopus ביצים. () הזרע הכרומטין MMS שהניזוק (MMS) או הכרומטין הזרע הנורמלי (קון) מודגרת בתמציות ביצים עבור 90 דקות. Chk1 זירחון בSer344 (Chk1 P-S344) וChk1 המוחלט בתמציות ביצה נבחנים דרך immunoblotting. (ב) AT70 או מים (קון) מתווסף לתמציות ביצה, בהתאמה. דוגמאות גם מנותחות באמצעות immunoblotting כמו ב().

<ol>
	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ישנם מספר יתרונות בלימוד מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות תמציות Xenopus ביצים. השימוש בתמציות ביצה מספק כמות גדולה של תמציות תא חינם מסונכרנות בשלבי ביניים של מחזור התא. ניתן תמציות הביצים בקלות ובזול. זה יחסית קל לפגוע DNA או הכרומטין ולחשוף פגם במחסום הניזק לדנ&quot;א לא?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> Anti-P-S344 Chk1 נוגדן </td><td> איתות תא </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי Chk1 </td><td> סנט קרוז </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> סיגמא </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> סיגמא </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-ציסטאין </td><td> סיגמא </td><td> C7352-1 ק&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> מתיל methanesulfonate (MMS) </td><td> סיגמא </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> סיגמא </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ מדגם </td><td> סיגמא </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako כימיקלי ארה&quot;ב </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> דלי להטלת ביצים </td><td> מוצרי Rubbermaid המסחריים </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה CL2 IEC עם הרוטור דלי מתנדנד </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> הרוטור דלי HB6 נדנוד </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 תוספת צנטריפוגה SuperSpeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> crosslinker UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרונות </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 המ&quot;מימ NaCl, 2 המ&quot;מ KCl, 0.5 mM 4 MgSO, 2.5 המ&quot;מ CaCl 2, 5 HEPES מ&quot;מ, להתאים pH ל -7.8 עם 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinin / מניות Leupeptin </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כל אחד במים. אחסן 20 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr><tr><td> X החיץ </td><td></td><td></td><td> סוכרוז 0.2 מ &#39;, 80 המ&quot;מ KCl, 15 המ&quot;מ NaCl, 5 המ&quot;מ MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 HEPES מ&quot;מ, להתאים pH ל -7.5 ידי HCl </td></tr><tr><td> מניית Cycloheximide </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים. החנות 1 aliquots המ&quot;ל ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasin B המניות </td><td></td><td></td><td> 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO. אחסן 20 aliquots μl ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> מניית Dithiothreitol (DTT) </td><td></td><td></td><td> M 1 במים. החנות 1 aliquots המ&quot;ל ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25 סוכרוז M, 1 mM DTT, 50 מיקרוגרם / המ&quot;ל cycloheximide, 2.5 המ&quot;מ MgCl 2, 50 mM KCl, 10 HEPES מ&quot;מ, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole המניות </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO. אחסן 5 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr><tr><td> תערובת אנרגיה </td><td></td><td></td><td> פוספט 375 מ&quot;מ קריאטין, 50 mM ATP, ו25 מ&quot;מ MgCl 2. Aliquots נשמרים ב-80 ° C. </td></tr><tr><td> פתרון לצבוע גרעיני </td><td></td><td></td><td> 0.4 מיקרוגרם / המ&quot;ל Hoechst 33258, גליצרול 25%(V / v), ב1x PBS </td></tr><tr><td> מניית Tautomycin </td><td></td><td></td><td> 100 מיקרומטר בDMSO. אחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

על בסיס יומי, תאים נחשפים למגוון של עלבונות אנדוגניים וסביבתיים. כדי להתמודד עם העלבונות האלה, תאים התפתחו מחסום ניזק לדנ&quot;א איתות כמנגנון מעקב לחוש ניזק לדנ&quot;א ותגובות תאיות ישירות לניזק לדנ&quot;א. ישנן מספר קבוצות של חלבונים הנקראים חיישנים, מתמר וגורמים מעורבים באיתות מחסום ניזק לדנ&quot;א (איור 1). במסלול איתות מורכבת זו, ATR (כספומט וRad3 קשור) הוא אחד מקינאזות העיקרית שיכול להגיב לניזק לדנ&quot;א, ומתח שכפול. הפעיל ATR יכול phosphorylate מצעי מורדה כגון Chk1 (קינאז מחסום 1). כתוצאה מכך, פוספורילציה והפעיל Chk1 מוביל לתופעות רבות במורד מחסום הניזק לדנ&quot;א, כוללים מעצר מחזור תא, הפעלת שעתוק, תיקון ניזק לדנ&quot;א, ואפופטוזיס או הזדקנות (איור 1). כאשר ה-DNA פגומה, שלא הצליח להפעיל את תוצאות מחסום הניזק לדנ&quot;א בunrepניזק שודר, ועקב כך חוסר יציבות, הגנומי. המחקר של מחסום הניזק לדנ&quot;א יבהיר כיצד תאים לשמור על שלמות גנטית ולספק הבנה טובה יותר של איך מחלות אנושיות, כגון סרטן, להתפתח. תמציות Xenopus laevis ביצה מתגלות כמערכת חזקה תא חינם תמצית מודל במחקר מחסום ניזק לדנ&quot;א. תמצית מהירות נמוכה (LSE) בתחילה תארה Masui קבוצת 1. התוספת של הכרומטין הזרע demembranated לתוצאות LSE בהיווצרות גרעינים שבו DNA משוכפל באופנת semiconservative פעם אחת בכל מחזור התא. מסלול איתות מחסום ATR/Chk1-mediated מופעל על ידי ניזק לדנ&quot;א או מתח כפול 2. שתי שיטות עיקריות משמשת כיום כדי לגרום הניזק לדנ&quot;א מחסום: גישות מזיקות DNA ומבני ניזק-DNA מחק 3. ניזק לדנ&quot;א יכול להיגרם על ידי קרינת אולטרה סגולה (UV), γ-קרינה, מהתיל methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-התחמוצת (4-NQO), או aphidicolin 3, 4. MMS הוא סוכן אלקילציה שמעכב שכפול הדנ&quot;א ומפעיל את מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-mediated 4-7. קרינת UV גם מפעילה 8 מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-dependent. מבנה ה-DNA ניזק מחקי AT70 הוא מורכב משני annealed oligonucleotides פולי-(DA) 70 ופולי-70 (dT). AT70 המערכת פותחה במעבדתו של ביל דאנפי ונמצאת בשימוש נרחב כדי לגרום ATR/Chk1 איתות מחסום 9-12. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים (1) כדי להכין תמציות ביצת תא חינם (LSE), (2) לטיפול בכרומטין זרע עם DNA Xenopus שתי שונים לפגוע גישות (MMS ו UV), (3) כדי להכין את מבנה ה-DNA ניזק המחקים AT70, ו( 4) כדי לעורר את מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-mediated בLSE בכרומטין זרע פגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ&quot;א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ&quot;א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ&quot;א.

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

study-of-the-dna-damage-checkpoint-using-xenopus-egg-extracts

Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.5K Views.  University of North Carolina at Charlotte. Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ"א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ"א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ"א.

Video: Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Assay חינם-נייד באמצעות<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברי מחלץ לחקור מנגנונים של תקנת גודל גרעינית

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.