이 작품은 샬롯 노스 캐롤라이나 대학 교수 우수성 Wachovia 기초 기금, 그리고 NIGMS (R15GM101571)에서 교부금에 의해 제공 자금에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. LSE 준비 <ol><li> 여성 개구리 (Xenopus laevis)는 계란 수집을 위해 두 번 주입하고 있습니다. 첫 번째 주입 (프라이밍)는 개구리 당 100 U PMSG (임산부 마레 세럼 생식샘 자극 호르몬)입니다. 유도 난자 놓고 중이오 개구리가 2 주에 사용할되기 전에 개구리는 최소한 이틀 중이오해야합니다. 주요 개구리에게, 3 ML의 주사기 27 G 바늘을 사용하여 등쪽 림프 주머니에 피하 주사 PMSG. </li><li> 누워있는 달걀을 유도하기 위해 27 G 바늘을 사용하여 등쪽 림프 주머니에 피하 중이오 개구리 당 500 U hCG (인간 Chorionic Gonadotrophin)을 주입. 1X 마크의 수정 벨소리의 솔루션 (MMR) 2 리터를 포함하는 별도의 물통에 주입 개구리를 품다. 수집하기 전에 알을 낳기 위해 개구리에게 14-20 시간을 허용합니다. </li><li> 버킷에서 개구리를 제거하고 약 100 ML가 왼쪽 때까지 MMR 솔루션을 부어. 250 ML의 비커에 달걀을 전송하여 양동이에서 알을 얻습니다. </li><li> 2 % 시스테인의 100 ML (조정을 추가하여 Dejelly 달걀10 M 코와 7.8에 PH). 역 유리 파스퇴르 pipet (직경 0.7 cm) 약 매 30 초와 부드럽게 소용돌이 계란을. 가만히 따르다과 부화하는 동안 두 번 신선한 시스테인로 교체하십시오. 달걀 비커의 맨 아래에있는 더 압축 된 층을 형성 할 때 dejellying 과정은 5-15 분 정도에 완료됩니다. </li><li> 시스테인 솔루션을 무시하고 0.25x MMR과 계란을 세 번 씻는다. 유리 pipet하여 솔루션의 소용돌이 계란합니다. &quot;나쁜&quot;달걀은 간단한 육안 검사에 의해 결정 및 외관의 &quot;띵띵 한&quot;하얀 있습니다. &quot;나쁜&quot;달걀은 회전 후 비커의 중심에 축적됩니다. 파스퇴르 pipet으로 &quot;나쁜&quot;계란을 제거합니다. </li><li> 달걀 용해 버퍼 (ELB) 세 번에 알을 씻으십시오. 파스퇴르 pipet하여 추가 &quot;나쁜&quot;계란을 제거합니다. 14 ML 팔콘 튜브에 달걀을 넣어. </li><li> 달걀을 압축 스윙 버킷 로터로 CL2 IEC 임상 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 188 XG (1,100 RPM)에서 55 초 동안 매 관을 봐. 에서 초과 버퍼를 제거계란 층의 꼭대기. Aprotinin / 류 펩틴 주식의 0.5 μl와 콤팩트 달걀 ML 당 Cytochalasin B 주식의 0.5 μl를 추가합니다. </li><li> 4에 15 분에 16,500 XG (10,000 RPM)에 달걀을 원심 분리기 ° C HB6 스윙 버킷 로터로 Sorvall RC6 플러스 빠른 속도의 원심 분리기를 사용합니다. 원심 분리 한 후, 계란은 관 3 층에 fractionated입니다 각각 지질, 추출 및 난황 / 위로부터 아래로 안료,. 21 G 바늘로 중간 추출물 층의 낮은 부분에 구멍 팔콘 튜브의 측면을. 펑 쳐링 바늘은 플라스틱에 의해 가려 수 있으므로 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 추출물을 수집 할 수있는 주사 사이트에 1 ML의 주사기에 부착 된 새로운 21 G 바늘을 삽입합니다. 천천히 지방질과 난황 / 안료 레이어 기포 및 오염을 방지하기 위해 주사기로 추출물을 대기음. </li><li> 차가운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 추출물를 놓습니다. 계란 추출물의 각 밀리리터를 들어,에서 다음 화학 주식 솔루션을 추가dicated 최종 농도 (괄호에 표시) : (1) 10 μl Cycloheximide (100 μg / ML), (2) 1 μl Aprotinin / 류 펩틴 (10 μg / ML 각), (3) 1 μl Cytochalasin B (5 μg / ML ), (4) 1 μl Dithiothreitol (1 MM) 및 (5) 0.33 μl Nocodazole (3 μg / ML). 계란이 부드럽게 적어도 10 배의 압축을 풉니 반전. 이 신선한 만들어 4 시간 이내에 사용하셔야합니다 LSE입니다. LSE의 품질은 4 시간이나 동결 - 해동 후 손상됩니다. </li></ol> 2. DNA 손상 접근법과 정자 염색질의 치료 <ol><li> 이전 13 설명한 방법에 따라 정상적인 정자 염색질을 준비합니다. </li><li> MMS - 처리 정자 염색질을 준비 <ol><li> 0.5 ML 버퍼 X.에서 정상적인 정자 염색질을 Resuspend </li><li> 100 mm의 최종 농도에 염색질을 resuspended 500 μl에 MMS의 ~ 5.5 μl (재고 9.1 M)을 추가합니다. </li><li> 회전 30 분 동안 실온에서 microcentrifuge 관 정자 염색질을 품다. </li><li> m을 돌려스윙 버킷 회 전자와 튜브 어댑터와 IEC CL2 임상 원심 분리기를 사용하여 실온에서 10 분에 686 XG (2,100 RPM)에서 icrocentrifuge 관. </li><li> 표면에 뜨는 취소하고 버퍼 X 플러스 BSA (3 %), DTT (0.1 ㎜) 및 Aprotinin / 류 펩틴 (10 μg / ML 각)의 0.5 ML에서 펠렛을 resuspend. </li><li> 단계 (4) 반복 (5) 두 번 정자 염색질을 씻어합니다. </li><li> hemocytometer로 정자 염색질의 농도를 결정하고 100,000 정자 / μl로 희석. 자세한 사용을위한 -80 ° C의 냉동고에 5 μl aliquots를 저장합니다. </li></ol></li><li> UV-처리 정자 염색질을 준비 <ol><li> Parafilm의 한 부분의 표면에 정상적인 정자 염색질의 원하는 금액을 (예 : 10 μl)를 추가합니다. </li><li> UV crosslinker로 Parafilm를 놓습니다. 실험에 따라 원하는 에너지 매개 변수를, 설정하고 UV 빛을 통해 정자 염색질을 손상하기 시작한다. 예를 들어, 1000 J / m 2에 도달하기 약 21 초 정도 소요됩니다. </li><li> UV irra 후diation, UV-처리 정자 염색질은 즉시 계란 추출물에 추가해야합니다. </li></ol></li></ol> 3. DNA 손상 -​​ 모방 구조의 준비 (AT70) <ol><li> 이 합성 oligonucleotides를 해산 폴리 - (다) 각각 70 (A70으로 지정) 및 폴리 (DT) 70 (T70로 지정) 2 μg / μl의 농도로 물에. </li><li> 한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 A70의 100 μl와 T70 100 μl를 추가합니다. heatblock에서 95시 5 분 ° C에 혼합 합성 oligo 솔루션을 끓일. </li><li> 건조 목욕 블록 아웃을 (거기에 혼합 AT가 포함 된 튜브 사용) 해,하고 실험실 벤치에 실내 온도로 식혀 보자. 이 온도 조정은 45-60 분 주위에 걸립니다. </li><li> 냉각 혼합물은 2 μg / μl의 최종 농도에 AT70입니다. 자세한 사용을위한 -20 ° C의 냉동고에 AT70 aliquots의 스토어 10 μl. </li></ol> 4. 손상된 정자 염색질 또는 DNA의 손상과 LSE에서 DNA의 손상 세키가 실행- 모방 구조 <ol><li> 손상된 정자 염색질과 LSE에 DNA 손상 검사 점을 유도 <ol><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 LSE의 50 μl를 추가하고 에너지 혼합물의 1 μl 및 손상된 정자 염색질 (최종 농도 ~ 4,000 정자 / μl 반응) 2 μl로 보완합니다. </li><li> 90 분 동안 실온에서 반응 관을 배양하고 관마다 10 분 버려야지. </li><li> 30 분 부화 후 핵 염색 솔루션의 1 μl를 보충 현미경 슬라이드에 반응 혼합물의 1 μl을 투여. 반응 혼합물을 통해 커버 슬립을 놓고 형광 현미경을 통해 핵 형성을 확인합니다. 일반적으로 둥근 핵은 DNA 복제가 시작했습니다 나타내는 부화 후 30 분 이후에 형성됩니다. </li><li> 샘플 버퍼의 90 μl로 반응 혼합물 10 μl보십시오. 샘플을 방지 Chk1 P-S344 또는 안티 Chk1 항체를 사용하여 immunoblotting을 통해 분석하고 있습니다. </li></ol></li><li> 와 LSE에 DNA 손상 검사 점을 유도AT70 <ol><li> 에너지 혼합물의 1 μl와 Tautomycin 주식의 1.6 μl를 보충 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 LSE의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 각 반응에 미리 만든 AT70 (2 μg / μl) 또는 물 (대조군) 중 1.25 μl를 추가합니다. 90 분 동안 실온에서 반응을 품다. 반응 관마다 10 분 영화. </li><li> 샘플 버퍼의 90 μl로 반응 혼합물 10 μl를 추가합니다. 샘플을 방지 Chk1 P-S344 또는 안티 Chk1 항체를 사용하여 immunoblotting을 통해 검토하고 있습니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 - 모방 구조는 Xenopus 계란 추출물 시스템에서 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다. MMS는의 지표 Ser344에서 Chk1 인산화 (Chk1 P-S344)를 유도하는 그림 2A 쇼는 ATR의 키나제의 활성화. 그림 2B는 AT70, DNA 등의 손상 - 모방 stru 보여줍니다cture도 Chk1 인산화를 트리거합니다. 총 Chk1 샘플은 두 예에서 컨트롤을로드로 사용됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> 1 그림. DNA 손상 검사 점 신호의 다이어그램. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> 그림 2. Chk1 인산화는 MMS 또는 Xenopus 달걀 추출물의 AT70 치료에 의해 ​​유도된다. (A) MMS-손상된 정자 염색질 (MMS) 또는 일반 정자 염색질 (절약)가 90 분에 계란 추출물에 incubated 수 있습니다. Chk1 Ser344의 인산화 (Chk1 P-S344)과 계란 추출물의 총 Chk1는 immunoblotting을 통해 조사하고 있습니다. (B) AT70 또는 물 (절약) 각각, 달걀 추출물에 추가됩니다. 샘플도 (A)에서와 같이 immunoblotting을 통해 분석하고 있습니다.

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	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Xenopus 계란 추출물을 사용하여 DNA 손상 검사 점을 연구의 몇 가지 장점이 있습니다. 계란 추출물의 사용은 세포주기의 계면에서 동기화 셀 - 무료 추출물 대량를 제공합니다. 계란 추출물 쉽게 저렴한 비용으로 만들 수 있습니다. 이 DNA 나 염색질을 손상하고 계란 추출물에서 대상 단백질을 immunodepleting 후 DNA 손상 검사 점의 결함을 나타 내기 위해 상대적으로 쉽습니다. 그 후, 잠재적 인 기?...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 안티 Chk1 P-S344 항체 </td><td> 셀 시그널링 </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> 안티 Chk1 항체 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> 시그마 </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> 시그마 </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-시스테인 </td><td> 시그마 </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> 류 펩틴 </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> 메틸 methanesulfonate (MMS) </td><td> 시그마 </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> 시그마 </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 버퍼 </td><td> 시그마 </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> 와코 화학 USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 누워있는 계란에 대한 버킷 </td><td> Rubbermaid 상용 제품 </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> 스윙 버킷 회와 CL2 IEC의 원심 분리기 </td><td> 열 과학 </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 스윙 버킷 회 </td><td> 열 과학 </td><td> 11,860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 플러스 빠른 속도의 원심 분리기 </td><td> 열 과학 </td><td> 46,910 </td><td></td></tr><tr><td> UV crosslinker </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 </td></tr><tr><td> 1X MMR </td><td></td><td></td><td> 100 MM NaCl, 2 MM KCl, 0.5 MM MgSO 4, 2.5 MM CaCl 2, 5 MM HEPES는 10 M NaOH를 7.8로 pH를 조정 </td></tr><tr><td> Aprotinin / 류 펩틴 재고 </td><td></td><td></td><td> 10 MG / ML 각 물 인치 -80 ° C.에 20 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> 버퍼 X </td><td></td><td></td><td> 0.2 M의 자당, 80 MM KCl, 15 MM NaCl, 5 MM MgCl 2, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM의 HEPES는 HCL에서 7.5으로 pH를 조정 </td></tr><tr><td> Cycloheximide 재고 </td><td></td><td></td><td> 1물에 0 MG / ML. -20 ° C.에 저장 한 ML의 aliquots </td></tr><tr><td> Cytochalasin B 주식 </td><td></td><td></td><td> DMSO 5 MG / ML. -20 ° C.에 20 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) 주식 </td><td></td><td></td><td> 물에 1 M. -20 ° C.에 저장 한 ML의 aliquots </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25 M의 자당, 1 MM DTT, 50 μg / ML cycloheximide, 2.5 MM MgCl 2, 50 MM KCl, 10 MM의 HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole 주식 </td><td></td><td></td><td> DMSO 10 MG / ML. -80 ° C.에서 5 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> 에너지 혼합 </td><td></td><td></td><td> 375 밀리미터 크레아틴 인산, 50 MM ATP, 25 MM MgCl 2. Aliquots는 -80 ° C.에 저장됩니다 </td></tr><tr><td> 핵 염색 솔루션 </td><td></td><td></td><td> 0.4 μg / ML Hoechst 33258, 25 % 글리세롤(V / V)에 1X PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin 재고 </td><td></td><td></td><td> DMSO 100 μM. -80 ° C.에서 10 μl aliquots를 저장 </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

매일, 세포 내생과 환경 모욕 다양한를 받게됩니다. 이러한 모욕을 방지하기 위해, 세포가 DNA 손상에 DNA 손상 및 직접 세포 반응을 감지 할 수있는 감시 장치로 신호 DNA 손상 검사 점을 발전시켜 왔습니다. DNA 손상 검사 점 신호 (그림 1)에 참여 센서, 트랜스 듀서 및 effectors라는 단백질의 여러 그룹이 있습니다. 이 복잡​​한 신호 경로에서 ATR (ATM 및 Rad3 관련)은 DNA 손상 및 복제 스트레스에 응답 할 수있는 주요 kinases 중 하나입니다. 활성화 ATR은 Chk1 아니라 그 하류 기판 (세키 키나제 1) phosphorylate 할 수 있습니다. 따라서, phosphorylated 및 세포주기 체포, 전사 활성화, DNA 손상 수리 및 apoptosis 또는 노화 (그림 1)을 포함하여 DNA 손상 검사 점의 여러 다운 스트림 효과 Chk1 리드를 활성화. DNA가 손상되면 unrep에서 DNA 손상 검사 점 결과를 활성화하기 위해 실패방송 손상과, 이후, 게놈 불안정성. DNA 손상 검사 점의 연구는 세포 게놈 무결성을 유지하는 방법 명료하게하다와 같은 암 등 인간의 질병이 개발 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. Xenopus laevis 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점의 연구에 강력한 셀 - 무료 추출 모델 시스템으로 등장하고 있습니다. 저속 추출물 (LSE)가 처음 Masui 그룹 1에 의해 설명되었다. DNA 한 번 세포주기 당 semiconservative 방식으로 복제 핵 형성에 LSE 결과 demembranated 정자 염색질의 추가. ATR/Chk1-mediated 검사 점 신호 경로는 DNA가 손상되거나 복제 스트레스를 2로 실행됩니다. DNA 손상 접근 방식과 DNA 손상 - 모방 구조 3 : 두 가지 방법은 현재 DNA 손상 검사 점을 유발하는 데 사용됩니다. DNA 손상은 자외선 (UV) 조사, γ-방사선, 메틸 나게 의해 유도 될 수esulfonate (MMS), 미토 마이신 C (MMC), 4 nitroquinoline-1-산화물 (4 NQO) 또는 aphidicolin 3, 4. MMS는 DNA 복제를 억제하고 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점은 4-7 활성화 alkylating 요원입니다. UV 조사는 또한 ATR/Chk1-dependent DNA 손상 검사 점 8 트리거합니다. DNA 손상 -​​ 모방 구조 AT70 두 oligonucleotides 폴리 (DA) 70 폴리 (DT) 70 annealed 복잡합니다. AT70 시스템은 빌 Dunphy의 연구실에서 개발 된 널리 9-12 ATR/Chk1 검사 점 (Checkpoint) 신호를 유도하는 데 사용됩니다. 여기, 우리는 (2) DNA 손상 - 모방 구조를 준비하기 위해 두 개의 서로 다른 DNA 손상 방식 (MMS와 UV), (3) Xenopus의 정자 염색질을 치료하는 세포 무료 달걀 추출물 (LSE)를 준비하는 프로토콜은 (1) 설명 AT70, 그리고 (4) 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 -​​ 모방 구조 LSE에 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.

사용하여 DNA의 손상 세키의 연구<em&gt; Xenopus</em&gt; 달걀 압축을 풉니 다

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.5K 조회수.  University of North Carolina at Charlotte. Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.

비디오: Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Fractionated Xenopus 에그 추출물을 사용하여 체외 핵 어셈블리

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-catenin의 저하의 재구성<em&gt; Xenopus의</em&gt; 계란 추출

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

사용하여 셀 - 무료 분석<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em&gt; 배아 핵 크기 규제의 메커니즘을 연구하기 위해 추출

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.

제노푸스 라에비스 동적 세포질 조직을 시각화하기 위한 계란 추출물 준비 및 라이브 이미징 방법

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.

나노 입자에 의해 유도 된 DNA 손상 및 복구 역학을 조사하기위한 DNA 섬유 분석의 시연

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>DNA 손상에서 단백질 상호 작용 및 국소화 평가

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: DNA 손상 반응에서 단백질 상호 작용을 특성화하기 위해 근접 리간드 분석과 Gamma-H2AX 염색의 결합

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...