Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione GM096076 dal programma AREA NIH.

1. Preparazione mosche per la dissezione <ol><li> Anestetizzare mosche sane del genotipo desiderato (per esempio, esprimendo una GFP-marcato proteina) che sono meno di una settimana fa. Selezionare 10-15 femmine di grandi dimensioni con arrotondati color crema addome. </li><li> Trasferire le mosche selezionati e alcuni (3-5) maschi in una fiala contenente nuovo cibo leggermente yeasted e permettere alle mosche di ingrassare per due giorni a 25 ° C. Fare riferimento a Weil et al. 6 per i dettagli di preparazione Drosophila. Ingrasso le mosche assicura che una serie di fasi, in particolare le fasi 8-12, sarà disponibile per l&#39;imaging. Scarsamente ingrassato o unfattened vola di solito contengono solo nelle primissime fasi (1-6) e mature (stadio 14) ovociti. </li></ol> 2. Preparazione di ovociti per l&#39;imaging utilizzo di un microscopio composto Montante <ol><li> Preparare un vetrino vetro standard apponendo due coprioggetto al vetrino, di circa 1 cm di distanza, utilizzando greas siliconee. Utilizzare solo grasso sufficiente a garantire una buona tenuta tra il coprioggetto e far scorrere. Premere con decisione su ciascuna il coprioggetto si diffonderà il grasso in modo molto sottile. Aggiungete un po &#39;olio Halocarbon 27 (Sigma) alla giunzione tra i coprioggetti e far scorrere. Essi servono come distanziatori per evitare ferimento oociti isolati in fasi successive. No. 1.5 coprioggetti lavorare bene, con uno spessore medio (0,16-,18 mm) che corrisponde a quello di ovociti fase avanzata. </li><li> Posto 2-3 gocce di olio Halocarbon 27 sulla superficie di mm 22 2 coprioggetto. Per ottenere gli ovociti sani possibili, una femmina individuo viene rimosso dal flacone alimenti utilizzando pipette a bocca e delicatamente depositato nella Halocarbon senza anestetizzante prima. </li><li> Utilizzando taglienti dissettore (come Dumont # 5), il pin al volo contro il coprioggetto ed estrarre la punta dell&#39;addome. Rimuovere le ovaie trascinandoli lungo la superficie del vetrino, sotto l&#39;olio. Ciò promuoverà adhesion degli ovociti al coprioggetto. </li><li> Delicatamente prendere in giro a parte le ovaie, alla ricerca di ovociti che sono almeno 10B fase dell&#39;oogenesi. Oociti in questa fase possono essere identificati osservando per camere d&#39;uovo in cui l&#39;ovocita occupa almeno il 50-60% del volume totale della camera uovo. A questo punto oogenesi, le cellule follicolari sovrastanti l&#39;ovocita sono diventati colonnare, e circondano l&#39;ovocita su tutti i lati tranne per una piccola regione dove i collegamenti alle cellule rimangono infermiera. Utilizzare le pinze per rimuovere singoli ovociti dalla guaina ovariole. </li><li> Procedi, con le femmine 1-3, fino al 5-8 ovociti non danneggiati sono stati isolati sul coprioggetto. Rimuovere qualsiasi tessuto inutilizzabile. </li><li> Agitare delicatamente il vetrino contenente gli ovociti sul pre-preparato diapositiva in modo che gli ovociti sono posizionate tra i due distanziatori. Non premere verso il basso sul vetrino invertita a quella danneggiare gli ovociti. Se necessario, aggiungere una piccola quantità di olio Halocarbon per tegli bordi del &quot;sandwich&quot; per garantire lo spazio è riempito. (Opzionale:. Lasciare riposare vetrino per alcuni minuti per consentire la sedimentazione di coprioggetto) Il vetrino è pronto per l&#39;imaging. </li></ol> 3. Preparazione di ovociti per l&#39;imaging utilizzo di un microscopio invertito composto <ol><li> Gli ovociti vengono sezionati essenzialmente come descritto nella sezione 2, eccetto che piccoli piatti di Petri con un inserto in fondo di vetro (MatTek, 35 mm) sono utilizzati al posto di coprioggetti. Non è necessario per coprire il campione, e dopo la dissezione, il tessuto può essere ripreso direttamente nei piatti, ma bisogna fare attenzione a garantire gli ovociti rimangono coperti con olio e non sono autorizzati ad asciugarsi. </li></ol> 4. Vivo Imaging <ol><li> Portare un ovocita a fuoco utilizzando DIC o ottica di contrasto di fase ed esaminare l&#39;ovocita non presenti segni di danni, come ad esempio perdite di citoplasma, o rigonfiamento delle cellule del follicolo. Ovociti unica immagine che appaiono sani e non danneggiati. </li><li> Streaprogrammazione può essere monitorato direttamente senza la necessità di etichettatura GFP, dal tuorlo vescicole nel citoplasma sono autofluorescente 7. Questo segnale può essere catturato nella gamma FITC della portata ma probabilmente richiederà impostazioni di guadagno più elevati rispetto a quelli utilizzati per le proteine ​​marcate con GFP. </li><li> Le migliori immagini di streaming sono ottenute da sezioni ottiche che sono appena sotto la superficie dell&#39;ovocita che tocca la coprioggetto / Petri di vetro vetro. Qui l&#39;ovocita è leggermente appiattito, rendendo per un piano di messa a fuoco migliore. Le immagini possono essere catturate a 200X - 1.000 X. Con la disposizione descritta qui, obiettivi a deve essere utilizzato, in quanto il vetrino forma una barriera tra l&#39;ovocita e obiettivo. Questo è ottimale perché riduce notevolmente la deriva e movimento del campione. </li><li> Una volta che una regione di interesse è a fuoco, spegnere l&#39;ottica brighfield e passare a confocale. Utilizzando il veloce scansione / anteprima funzione del software, la messa a fuoco e di ottenerecome necessario. </li><li> Impostazioni per la cattura variano da microscopio per microscopio, ma i parametri generali sono i seguenti: Utilizzare una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di ~ 488 nm e una lunghezza d&#39;onda di emissione di ~ 515 nm. Impostare asse Z catturare in modo che l&#39;asse Z rimane costante, con un ritardo di 10 secondi tra i frame. Acquisire una sequenza di fotogrammi di prova 5-10 per garantire l&#39;oocita è fermo e il piano di messa a fuoco è appropriato. </li><li> Una tipica sequenza di lasso di tempo di catturare fra 20 - 50 fotogrammi, e può essere rivisto immediatamente dopo il completamento per valutare la qualità del video. Il processo può essere ripetuto per altre celle nella diapositiva o femmine aggiuntivi possono essere sezionati secondo necessità. </li></ol> 5. Risoluzione dei problemi e comune <ol><li> Drift - Quando si utilizza un microscopio in posizione verticale, le cellule possono a volte alla deriva a causa di diffusione di olio. Questo può essere minimizzato utilizzando solo olio sufficiente a coprire l&#39;area sotto il coprioggetto. Se il problema persiste, utilizzare g silicone menorease di distanziali apporre alla diapositiva. </li></ol> Nota: alcuni pacchetti software confocale consentire il monitoraggio delle cellule, ma in generale è meglio abbandonare l&#39;imaging di ovociti alla deriva e di utilizzare invece un altro campione. <ol start="2"><li> Nessun segno di streaming - Se lo streaming non è evidente, è probabile causa di una delle due cause: o il piano di riferimento per l&#39;acquisizione di immagini non è corretta (in genere troppo in profondità verso l&#39;interno dell&#39;ovocita) o l&#39;ovocita è danneggiato. Il tempo e la pratica possono ridurre al minimo sia gli errori. </li></ol>

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	<li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis.">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li><li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+Drosophila+oogenesis:+Live+imaging+of+egg+development.">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li><li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ovarian development Drosophila melanogaster. , (1970).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).</li><li>Serbus, L. R., Cha, B. -. J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes.">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging.">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).</li><li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes.">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>R&#246;per, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components.">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li><li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+the+ER+and+Exu:+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations.">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li><li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium.">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li></ol>

Non ho nulla da rivelare.

Ovociti Drosophila sono un sistema modello versatile per affrontare una serie di questioni relative alla funzione e l&#39;organizzazione delle cellule e componenti subcellulari. Una comprensione completa della funzione della proteina richiede il controllo dei due aspetti spaziali e temporali di comportamento proteine. I progressi in entrambi i sistemi di imaging e gli strumenti genetiche disponibili per Drosophilists rendere possibile anche per piccoli laboratori per eseguire esperimenti di imaging di alta qualità in ovociti di vita. Qui delineare un protocollo per analizzare il comportamento di proteine ​​GFP-tag o autofluorescente e strutture durante metà a fine-oogenesi che può essere utilizzato in combinazione con una varietà di contesti genetici per sondare la funzione delle proteine. In questo protocollo I descrivere il processo con cui vengono preparati oociti per l&#39;imaging e le impostazioni di base confocali che consentano l&#39;acquisizione di video lasso di tempo di proteine ​​fluorescenti e strutture. Ulteriori details sulla preparazione ovociti sono descritti da Weil et al. 6 Una varietà di ceppi di mosca esprimono proteine ​​che sono stati contrassegnati con endogenamente esone-trapping sono disponibili 8 e varianti proteiche infinitamente più possono essere progettati e reintrodotti mosche. Nel lavoro con tessuto vivente, la salute degli esemplari è di fondamentale importanza. Camere di uova da 10B stadio possibile completare oogenesi in modo sostanzialmente autonomo 11, che li rende ideali per brevi studi di imaging termine. Si deve prestare attenzione a diversi passaggi chiave per ottenere dati di alta qualità. Durante la dissezione è importante manipolare ovaie e ovociti meno possibile, e per ridurre al minimo la quantità di tempo tra la dissezione e il completamento di imaging. Idealmente, una stazione di dissezione piccola dovrebbe trovarsi nella stessa stanza che ospita il campo di applicazione confocale, e solo un paio di camere d&#39;uovo alla volta deve essere ripreso. Il numero consigliato qui (5-8) Garantisce che il tempo dissezione è minimizzato massimizzando la probabilità di ottenere immagini di buona qualità. Vi consiglio di catturare una breve serie di immagini per valutare la qualità delle immagini e verificare che le impostazioni di cattura sono ottimizzate, prima di catturare più di una sequenza lasso di tempo. Più software consente singoli fotogrammi per essere salvato, e queste immagini possono poi essere analizzati in una varietà di modi utilizzando ImageJ 12 o altro software.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Halocarbon dell&#39;olio 27 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8773-100ML </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF Pinze </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> Grasso al silicone </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z273554-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Con fondo di vetro piatti Petri </td><td> MatTek </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of gfp-labeled proteins in drosophila oocytes

L&#39;ovocita Drosophila è stata stabilita come un sistema versatile per studiare questioni fondamentali quali la funzione del citoscheletro, l&#39;organizzazione delle cellule, e la struttura e la funzione degli organelli. La disponibilità di diverse proteine ​​GFP-etichetta significa che molti processi cellulari può essere monitorata in cellule viventi nel corso di minuti o ore, e utilizzando questa tecnica, processi come RNP trasporti, morfogenesi epiteliale, e rimodellamento tissutale sono state descritte in dettaglio in 1,2 Drosophila ovociti. La possibilità di eseguire immagini video in combinazione con un ricco repertorio di mutanti permette una grande varietà di geni e dei processi da esaminare in dettaglio incredibile. Un esempio è il processo di streaming ooplasmic, che inizia a metà oogenesi 3,4. Questo vigoroso movimento di vescicole citoplasmatiche è microtubuli e chinesina-dipendente 5 e fornisce un sistema utiletemperatura per indagare la funzione del citoscheletro in queste fasi. Qui presento un protocollo per l&#39;imaging lasso di tempo di ovociti di vita con pressoché qualsiasi configurazione microscopia confocale.

Imaging di proteine ​​marcate con GFP varierà a seconda di come fortemente la proteina marcata è espressa. Un mid-stage ovocita esprime reticulon-simile 1 (Rtnl-1), esone etichettato con GFP 8,9 produce segnale forte. Rtnl-1 sembra co-localizza con i microtubuli lunghi disponibili durante lo streaming ooplasmic 10 (Figura 1A). Rtnl-1 è un buon marcatore per osservare lo streaming, ed è anche un indicatore di organizzazione dei microtubuli in ovociti fase avanzata. Streaming Ooplasmic in una camera di uovo di tipo selvatico è evidente come movimento notevole di vescicole tuorlo autofluorescenti quando si utilizza una velocità di acquisizione di un frame ogni 10 secondi (Figura 1B). Una proiezione massimo di cinque telai possono essere generati per segnare il percorso di vescicole movimento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> Figura 1. Vivo imaging sia autoflstrutture uorescenti e GFP-tagged. A) Un singolo time-lapse immagine di un oocita stadio 11 che esprime Rtnl1-GFP a 400X. Rtnl1-GFP fibre di muoversi con un movimento ondulatorio in ovociti di streaming. B) A cinque sporgenza massima cornice di una camera 10B stadio di uova in cui sono stati ripresi i vescicole autofluorescenti tuorlo ogni 10 secondi per 50 secondi totale, con ingrandimento 400X. Barra della scala = 30 micron

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Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Un protocollo per l&#39;imaging dal vivo di proteine ​​GFP-tagged o strutture autofluorescenti nei singoli<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovociti è descritto.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

live-imaging-of-gfp-labeled-proteins-in-drosophila-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

11.2K Views.  Vassar College. Un protocollo per l'imaging dal vivo di proteine ​​GFP-tagged o strutture autofluorescenti nei singoli Drosophila Ovociti è descritto.

Video: Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Ricerca

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

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Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparazione individuale Drosophila Egg Chambers per l&#39;imaging dal vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in

Vivo Imaging delle proteine GFP-etichettati in