Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der kanadischen Stiftung für Innovation (CFI), um DWA unterstützt.

1. Vorbereitung und Dissection <ol><li> Bereiten Sie das Sezieren Gericht mit Sylgard ausgekleidet. Aufnahmekammern von WPI (Sarasota, Florida, USA; Lieferanten sind in Tabelle 2 aufgeführt sind) werden als Sezieren Gerichte (Abbildung 1). Die Kammern sind so konzipiert, Glasobjektträger aufnehmen und kleine Kunststoffscheiben sind als Formen für die Sylgard verwendet. Die Scheiben werden zunächst der Schlitten mit Fett und Flüssigkeit Sylgard ist an der Mitte der Scheibe aufgenommen befestigt. Die Sylgard wird über Nacht heilen und wie sie dies tut, einen kleinen, runden Bett bildet sie auf dem Glasträger, die die Basis des Sezieren Gericht wird. Der Objektträger wird in die Aufzeichnungskammer angeordnet und dient als der Boden der Kammer zu dessen Herstellung befestigt (Fig. 1). </li><li> Bereiten Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Lösungen. Extrazelluläre Lösungen sind bei Zimmertemperatur stehen gelassen werden, während intrazellulären Lösungen sollten steril gehalten werden. Man kann auch Lu hinzufügencifer gelb (0,1%) auf die intrazelluläre Lösung, so dass die Visualisierung des M-Zellmorphologie kann am Ende des Experiments durchgeführt werden. Dies dient dazu, Zellidentität (Fig. 2) zu bestätigen. </li><li> Heben Wildtyp-Zebrafisch-Embryos in der Eier Wasser bei 28,5 ° C und sammeln und Stufe nach Kimmel et al. 10. Für Dissektionen, Transfer Embryonen in die Sezieren Gericht, das dient auch als Aufnahmeraum. Anesthetize für 7-10 min in einer Betäubung Salzlösung (0,02% Tricaine; Lösung 1, Tabelle 3), die eng angenähert physiologischer Kochsalzlösung. Man kann bestimmen, ob sie ausreichend durch Untersuchung der Reaktion auf eine sanfte Schwanz Klemm anästhesiert. </li><li> Pin die Embryonen durch die Chorda und auf die Sylgard gesäumten Gericht mit 0,001 &quot;Wolframdraht (Scientific Instrument Dienste. Inc., Ringoes, NJ, USA) unter Verwendung 25X Vergrößerung auf einem Binokular (Abbildung 1). Wolframdraht wird leicht geschnitten inauf kleine Teile mit feinen Seziersaal Schere. </li><li> Stellen Sie die Vergrößerung auf dem Binokular auf 40-50X, die Präparation durchzuführen. Sobald der Embryo in die Schüssel, den Kiefer, Augen und Vorderhirn festgesteckt werden mit einer feinen Pinzette (Dumont # 5) entfernt. </li><li> Das Hinterhirn wird sanft von der zugrunde liegenden Chorda durch sorgfältige Arbeit der Zange zwischen der Chorda und dem Gehirn abgezogen. Das Hinterhirn wird dann vorsichtig umgedreht, so dass die Bauchseite nach oben zeigt. Diese Positionierung bietet einen guten Zugang zu den M-Zellen, die in der Regel innerhalb von 5-10 um der Bauchseite sind bei jungen Embryonen und ~ 20-50 um in älteren Larven (2A). </li><li> Vorsichtig bewegen Sie die Vorbereitung auf die Aufnahme-Setup, wo der Patch-Clamp-Experiment durchgeführt werden. Die M-Zellen werden mit Nomarski Differentialinterferenzkontrast (DIC) sichtbar, obwohl andere Formen der Bildgebung (dh Hoffman Modulationskontrast oder Dodt Gradient Contrast Imaging vonLuigs und Neumann, Deutschland) können ebenfalls verwendet werden. </li></ol> 2. Patch-Clamp-Aufzeichnung (Ganzzellmodus) <ol><li> Alle Aufnahmen werden in der ganzen Zelle Patch-Clamp-Modus 11 durchgeführt. Aufnahmekammern sind auf einem Mikroskoptisch in einem Elektrophysiologie-Setup platziert. Unsere Stufen befestigt sind und die aufrechten Patch-Clamp-Mikroskop ist mit einem beweglichen Mikroskop-Plattform oder einem Mikroskop Übersetzer verschraubt. </li><li> Von dünnwandigen, Borosilikatglas von WPI erhalten; Patch-Clamp-Pipetten sind auf einer horizontalen Puller (Sutter Instruments Co. P-97) gezogen. Pipettenspitzen-Durchmesser in der Größenordnung von 0,2 bis 0,4 um nach dem Feuerpolieren zu einer glatten Kante, und die Schaftkegel ist ~ 4 mm in der Länge. </li><li> Befestigen Sie die Pipette auf die Kopfverstärker-Stufe in der Elektrophysiologie-Setup. Es ist wichtig, die Kopfstufe in etwa 45 °-Winkel zu der horizontalen Achse zu halten, da dies gewährleistet einen Eintrittswinkel für die Pipette, die für die Bildung des Hochwiderstands Dichtungs auf die Mauthner-Zelle. </li><li> Kurz vor Eintritt in die Bad-Lösung, eine kleine Menge von positiven Druck auf die Pipette, um die Wahrscheinlichkeit einer Verschmutzung die Spitze zu verringern. Bei der Aufnahme mEPSCs, Bad-Lösungen umfassen 1 uM TTX Aktionspotentiale, 5 uM Strychnin zu Glycin-Rezeptoren und 10 uM Bicucullin oder 100 uM picrotoxin an GABA A-Rezeptoren blockieren sperren blockieren. Bei der Aufnahme mIPSCs, sind der Bad-Lösungen 1 uM TTX, Kynurensäure und entweder Bicucullin oder Strychnin in Abhängigkeit von der Rezeptoraktivität von Interesse. </li><li> Ansatz der M-Zellen mit einer kleinen Menge eines Überdrucks in der Pipette. Der Überdruck drückt sanft die Zelle von einer Seite zur anderen und, wenn er unmittelbar über der Zelle positioniert ist, bildet eine kleine Vertiefung an der Zellmembran. Lassen Sie die Pipette in Ort für ein paar Sekunden, um sanft reinigen die Zelloberfläche, so dass eine starke Dichtung zwischen der Pipette und der Membran gebildet werden kann. Freigeben des Überdrucks in der Pipetteermöglicht die Abdichtung eingeleitet werden und eine kleine Menge von Unterdruck verbunden mit negativen Pipette Potentiale ergibt GigaΩ Dichtungen bilden innerhalb weniger Sekunden. </li><li> Ändern Sie den Haltepotential auf den Verstärker bis -60 mV. Bruch der Zellmembran mit einer Reihe von kurzen Impulsen von Saugen. Unmittelbar aufzeichnen Membranpotentiale zu minimieren und Kapazitäts Artefakte. Kompensieren Zellkapazität (C m) und Zugang (Serie) Widerstand (R a) von 70-85%. R ein routinemäßig überwacht werden, alle 30 Sekunden bis eine Minute, und wenn es eine Änderung von 20% oder mehr, Abbruch des Versuchs. </li><li> Nachdem das Experiment beendet ist und genügend Daten erfasst worden ist, wird die Herstellung durch das Entfernen der Hinterhirn mit einer Pinzette geopfert. An diesem Punkt kann der Datenanalyse zu beginnen. </li></ol>

<ol>
	<li>Korn, H., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+half+a+century+later:+a+neurobiological+model+for+decision-making.">The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making.</a> Neuron. 47, 13-28 (2005).</li><li>Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+miniature+glutamatergic+EPSCs+in+neurons+of+the+locomotor+regions+of+the+developing+zebrafish.">Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).</li><li>Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+spontaneous+glycinergic+currents+in+the+Mauthner+neuron+of+the+zebrafish+embryo.">Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo.</a> J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cgamma+is+a+signaling+molecule+required+for+the+developmental+speeding+of+alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate+receptor+kinetics.">Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics.</a> The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).</li><li>Kinkhabwala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+and+functional+ground+plan+for+neurons+in+the+hindbrain+of+zebrafish.">A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Das oben beschriebene Protokoll kann eine Klemm Datensatz aus der M-Zellen und seinen Homologen zu patchen. Die Technik ist anspruchsvoll und es sollte in mehreren wichtigen Bereichen während des gesamten Verfahrens getroffen werden. Wir werden nun einige dieser Bereiche zu diskutieren und hilfreiche Tipps, um den Erfolg sicherzustellen anbieten. Der Bau der Seziersaal / Aufnahme Kammer ist ein wichtiger Aspekt des Experiments. Die M-Zellen sind schwer zu sehen, es sei denn, Differentialinterferenzkontrast verwendet. Nomarski DIC funktioniert am besten mit sauberen Glasdeckgläser, aber wir fanden, dass eine sehr dünne Schicht von Sylgard (~ 1-2 mm) wird nicht die DIC in einem solchen Ausmaß, dass es mit der Identifizierung der M-Zellen behindert und zu verzerren. Deshalb verwenden wir eine Aufnahme Kammer, die ein dünnes Deckglas auf dem Boden, auf dem eine kleine Kunststoffscheibe (~ 5 mm Durchmesser) gelegt hat. Wir mischen Sylgard 184 in eine Petrischale und vorsichtig Sylgard die Flüssigkeit auf die Innenseite der Scheibe mit einer Pasteur-Pipette. Das Sylgard kann bei Raumtemperatur über einige Tage ausgehärtet werden oder kann für eine schnelle Aushärtung erwärmt werden. Die Scheibe kann nach der Sylgard Aushärten entfernt werden, obwohl dies nicht notwendig ist. Sobald die Dissektion / Aufnahme Kammer gemacht worden ist, kann es für mehrere Wochen verwendet werden, bevor eine neue Sylgard gesäumten Glasobjektträger benötigt wird. Der nächste Schritt in dem Verfahren besteht darin, bis alle relevanten Lösungen am Tag des Experiments (Tabelle 3). Intrazelluläre Lösungen alles andere als ATP und GTP enthalten, werden im Voraus bei -20 ° C hergestellt und in 5 ml Aliquots Am Tag der Aufnahme ein Aliquot wird auf Raumtemperatur aufgetaut und frisch ATP und GTP zugesetzt. Die Lösung wird auf 280 mOsm und der pH 7,4 eingestellt. In unseren Händen, so finden wir, dass die Zugabe von frischem ATP und GTP auf einer täglichen Basis zu einer guten Aufnahmen. Alle Lösungen müssen steril für die beste Chance auf Erfolg gehalten werden. Intrazelluläre Lösungen müssen throug gefiltert werdenha 0,22 um Filter (Sigma), kleine Partikel und Ablagerungen, die die Aufnahme beeinträchtigen könnten, zu entfernen. Um dies zu tun, haben wir zunächst die intrazelluläre Lösung ziehen in eine 1-ml-Spritze, bringen Sie den Filter auf das Ende der Spritze und fügen Sie eine Kunststoffpipettenspitze, die erhitzt wurde und gezogen, um feine Spitze, bis zum Ende des Filters. Dies erlaubt uns, den gefilterten intrazellulären Lösung direkt auf der Innenseite der Glaspatchpipetten anzuwenden. Sobald die Lösungen sind, kann der Embryo anästhesiert und seziert werden. Vor der Präparation, sollte darauf geachtet werden, das Alter des Organismus angemessen einzuschätzen. Jeder Embryo innerhalb Kupplung Alter zu einem etwas anderen Geschwindigkeit. Daher bei der Beurteilung des Alters des Organismus, ist es wichtig, dies nach den üblichen Verfahren 10,13, mithilfe phänotypischen Hinweise, wie die Anzahl der Somiten, die Gesamtform des Körpers, und dem Zeitpunkt der Befruchtung der Eizelle zu tun. Alle Sektionen sind mit einem feinen Dumont Nr. 5 Paar durchgeführtPinzette. Diese müssen scharf sein und in gutem Zustand sein, sonst wird es sehr schwierig, die Haut, die über der Hinterhirn und jede Bindegewebe auf der ventralen Oberfläche des Rautenhirn entfernen. Wir haben oft die Zange nach wenigen Wochen der Anwendung zu schärfen und diese selbst zu machen mit einem Schleifstein. Um die Fische an die dünne Schicht der Sylgard Pin, verwenden wir Stifte von feinen Wolframdraht 0,001 Zoll im Durchmesser gestaltet. Die Stifte werden mit einer alten, Mikro-Dissektion Schere unter einem Binokular geschnitten und sind klein genug, um direkt durch die Chorda passen. Pinning die Embryonen an jedem anderen Punkt nicht zu immobilisieren sie und macht Dissektionen fast unmöglich durchzuführen. Wenn die erste Lern ​​die Aufnahmen durchzuführen, ist es schwierig, die Identität M-Zelle von ihrer Homologen sein können (insbesondere MID2 cm, die in der benachbarten Rhombomer befindet - Rhombomer 5). In einigen Embryonen diese beiden Paare von Zellen erscheinen in der Größe ähnlich. Die Otolithen provide günstig Wahrzeichen zur Identifizierung von M-Zellen zu unterstützen. Bei 48 HPF die M-Zellen werden direkt neben den Otolithen entfernt, und auch wenn die Otolithen sind während der Präparation entfernt, hinter einer leicht beschädigt seitlichen Bereich des Hinterhirn, das als Marker für ihre ursprüngliche Position verlassen sie dient. Transgene Fische, die GFP oder eine andere Fluoreszenzmarker in der M-Zellen zu exprimieren, bieten eine ausgezeichnete Vorbereitung neuer Experimentatoren. In unseren Händen die M-Zellen eine Membrankapazität von rund 18 bis 24 pF bei 48 hpf, während die kleineren Homologen sind näher an 12-14 pF. Zellen mit größeren Oberflächenbereich größere Membrankapazitätswerte (in Picofarad (pF) gemessen), verglichen mit kleineren Zellen. Somit kann Membrankapazität als grober Indikator für die Zellgröße, wo größere Zellen größere Kapazitätswerte verwendet werden. Diese Charakteristik elektro dient als weitere Eigenschaft, durch die die M-Zellen aus ihrer Homologe identifiziert werden. Schließlich benutzen wir oft Lucifer gelb in unserer Aufnahme (intrazelluläre)-Lösungen, die uns einen festen Identifizierung des Zelltyp in Untersuchung mit Fluoreszenz-Bildgebung einmal Aufnahmen abgeschlossen sind führen können. Pipettenspitze Widerstände im Bereich von 3,5 bis 4,5 MOhm sind der beste Kompromiss zwischen Größe und Spitze niedrige Zugriffs Widerstand, der typischerweise im Bereich von 8 bis 15 MOhm. Dies ist besonders wichtig für Veranstaltungen mit schnellen Kinetik; ~ 0,1 msec (20-80%) steigen und mal ~ 0,5 msec exponentiell abklingt 12,14,15 (3A und 3B). Daten mit einer Digitalisierungsrate von 50-100 kHz erfaßt und mit einem Tiefpassfrequenz von 5-10 kHz gefiltert. Mit Blick auf die Patch-Pipetten, fanden wir, dass sie nicht brauchen, um Feuer-poliert, um eine Aufnahme zu erhalten, aber anekdotisch, scheint es etwas besser Chance auf gute Dichtungen, verglichen mit ungeschliffenen Pipetten bieten. Da die Pipettenspitzen relativ groß sind, haben wir nicht ver fügeny viel positiver Druck auf die Pipette vor dem Eintritt in die Lösung. Es braucht Übung der Entscheidung über die geeignete Menge von Überdruck als Überdruck gelten die Zelle zu viel zu bewegen, und wird Dichtung Bildung zu verhindern. Es kann auch synaptischen Kontakte beschädigen, wenn die Zelle leicht aus ihrer ursprünglichen Position verschoben. Auf der anderen Seite, hat zu wenig Druck führt zu schmutzig Tipps und nicht die Oberfläche der Zelle gut genug, um gute Dichtungen bilden reinigen. Ein Mittelweg ist nur durch erhebliche Praxis und Erfahrung erreicht. Dichtungsbildung mit Anwendungen von negativen Spannungen an der Pipette erhöht werden. Wir haben in der Regel 1,2-2 GOhm Dichtungen, die sich hervorragend für Durchbrüche in der ganzen Zelle Modus befinden. Als pharmakologische Mittel zur Zytoplasma der Zelle angewendet werden müssen, umfassen wir sie in der intrazellulären Lösung vor dem Füllen der Pipette. Es sollte bei der Vorbereitung der Pipette Lösungen, um den Verlust der Mittel zu vermeiden genommen werdenindem sie dem 0,22 um-Filter binden. Deshalb haben wir zunächst auswählen, die intrazelluläre Medium und anschließend vorsichtig die pharmakologische Mittel zur gefilterten Lösung. Anwendung der Verbindungen auf das intrazelluläre Kompartiment hat seine eigene einzigartige Herausforderungen. Beispielsweise Zugabe von Arzneimitteln an das intrazelluläre Medium Regel reduziert die Chancen eines GOhm Dichtung bildet, aber nicht bis zu dem Punkt, wo es ein großes Hindernis für das Experiment. Man sollte erkennen, dass die Anwendung von pharmakologischen Mitteln, die auf diese Weise nicht erlauben dem Experimentator, die geeignetste Steuersatz seit der Agent hat direkten Zugriff auf die Zelle vom Beginn der Ganzzellkonfiguration. Auch wenn wir Daten aufzuzeichnen in dieser Art von Experiment, muss man sich bewusst, dass die nächste beste Kontrolle ist die intrazelluläre Anwendung einer inaktiven Form des Mittels sein. In vielen Fällen geschieht dies in Form einer hitzeinaktiviertem Verbindung, eine verschlüsselte Peptid or eine inaktive Isomer vom Lieferanten erhalten. Wir erwerben die Daten in Form der synaptischen Ströme (mPSCs), spannungsabhängigen Ströme und Aktionspotentiale. Miniatur-Ströme können durch ein paar hervorragende Programme (pClamp, Axograph, etc.) analysiert werden, obwohl wir lieber Axograph X (John Clements) zu verwenden. Axograph X läuft auf Windows-und Macintosh-Plattformen und kann sowohl für die Erfassung und Analyse von elektrophysiologischen Daten verwendet werden. mEPCs mit Hilfe einer Schablone nach Wahl des Experimentators, aus der Aufnahme selbst erhalten erworben. Einzelne Ereignisse können für Eigenschaften wie Anstiegszeit, Amplitude, Halbwertsbreite und Abfallzeit, etc. Wir exportieren die Tabellenkalkulation von Daten an Kaleidagraph (Synergy Software), wo wir Persönlichkeiten, darunter Kopien von Ereignisspuren von Axograph X. produzieren analysiert werden Einer der schwierigsten Aspekte des Experiments ist die Bestimmung, ob die Aufzeichnung gut genug, um für sauberes geführt,zuverlässige Daten. Zum Beispiel kann platzKlemm Probleme bei der Aufnahme mPSCs von M-Zellen, die große und umfangreiche Axone dendritischen Prozesse entstehen. Wenn Spannungsklemm, kann man im allgemeinen die Spannung zu steuern, bei der die Pipettenspitze relativ gut (insbesondere, wenn der Eingangswiderstand (R a) niedrig ist), kann aber nicht die richtige Kontrolle des Membranpotentials in dendritischen Prozesse oder Axone, die weit weg von der Pipettenspitze. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob die Zelle war richtig Raum eingeklemmt ist, ein Streudiagramm der Anstiegszeit gegen die Amplitude der mPSCs, die aufgenommen wurden, zu produzieren. Eine Korrelation zwischen den Daten deutet auf unzureichende Klemmraum. In anderen Worten, wenn der Raum Klemme ist schlecht, dann mPSCs, die nahe an der Pipette auftreten müssen schneller Anstiegszeiten und größere Amplituden als Ereignisse von der Pipette auftretenden etwas Abstand. Wenn eine Korrelation vorhanden ist, werden die Daten ist problematisch und kann nicht verwendet werden. Ein weiterer Aspektvon elektrophysiologischen Ableitungen, die angegangen werden muss, ist, dass der Leckströme. Dies gilt insbesondere, wenn eine Klemmspannung Zelle, um spannungsabhängigen Ströme, wie Na + oder K +-Ströme aufzunehmen. Wenn das Membranpotential aus der Ruhe abweicht, können Leckströme zusammen mit spannungsabhängigen Aktivität aufgezeichnet werden. Leckströme (I L), eine Kombination von Kalium (I K), Natrium (I Na) und Chlorid (Cl I) Strom durch nichtspannungsabhängigen Kanäle, die Aktivität von Interesse zu verschleiern und muß vom Aufzeichnungs subtrahiert werden. Der Verstärker ist in der Lage diese Funktion online während der Aufzeichnung durch Ausführen was typischerweise als ein P / N-Protokoll. Bei einem P / N Protokoll der Verstärker mehrere kleine Depolarisationen (oder Hyperpolarisationen) aus der Ruhe laufen und wird das resultierende Leckstrom, der auftritt, aufzuzeichnen. Es ist wichtig, die klein genug Impulse, die nicht spannungsgesteuerte Kanäle aktivieren verwenden. Die aktuelles, die während dieser Impulse auftreten, werden aufgezeichnet und gemittelt, so dass die Leckströme aus der spannungsgesteuerten Kanalaktivität subtrahiert werden. Schließlich muss man, um der Übergangspotential, das an der Spitze der Elektrode zwischen der intrazellulären und extrazellulären Lösungen tritt nehmen. Intrazelluläre und extrazelluläre Lösungen sind typischerweise aus verschiedenen Ionen zusammengesetzt ist, mit unterschiedlichen Aktivitäten und Mobilitäten. Größere Ionen mit niedrigeren Mobilitäten eine größere Widerstandsfähigkeit gegenüber Ionenbewegung als kleinere bieten, und dies kann in einer kleinen, aber signifikanten Potentialdifferenz an dem Verbindungspunkt der Lösungen führen. Diese Übergangspotential muss bei der Bestimmung der geeigneten Spannungen von der Zelle erlebt genommen werden. Das hier vorgestellte Verfahren ist durch unser Labor seit vielen Jahren verwendet. Es gibt jedoch alternative Methoden zur Aufzeichnung von M-Zellen. Vor allem Joseph Fetcho und Kollegen haben entwickelnED eine ausgezeichnete Vorbereitung, in dem man von den M-Zellen von älteren Larven (4-5 Tage alt) in einer weniger invasiven Weise als hier, wo das M-Zelle wird von der dorsalen Oberfläche 16 vorgefahren aufzuzeichnen. Wir hatten eine ähnliche Technik versucht, aber fand es einfacher, den M-Zellen aus der Bauchseite des Hinterhirn, in dem die Zelle näher an der Oberfläche des Gehirns, insbesondere bei jungen Fischen (dh 24 bis 72 HPF HPF) zu nähern. Weiterhin ist ein Ansatz aus dem dorsalen Oberfläche erfordert gewöhnlich die Verwendung einer transgenen Linie, die eine fluoreszierende Markierung in den M-Zellen, die das Potenzial haben zusätzliche Variablen in die Aufnahme einzuführen ist äußert. Dieses Problem ist nicht vorhanden, wenn mit Wildtyp-Fisch. Doch mit der hier vorgestellten Technik, sind wir auf das Studium jüngeren Tieren (24 hpf bis 72 hpf) begrenzt. Somit hat jeder Ansatz seine Vorteile und Einschränkungen. Student-t-Test kann verwendet werden, um zwei Gruppen von Daten zu vergleichen, während eine Analyse der Variance (ANOVA) verwendet, um mehrere Gruppen zu vergleichen. Es muss darauf geachtet werden, um die entsprechenden Post-hoc-Test für die parametrische vs nicht-parametrische Daten zu wählen.

Eine der offenen Fragen in der Entwicklungsneurobiologie bezieht sich auf die Rolle der synaptischen Plastizität Phänomene während der synaptischen Reifung. Unsere Forschung konzentriert sich auf das Verständnis der Mechanismen, die synaptische Plastizität Entwicklung mit einer Gesamtziel zu verstehen das Verhalten von Tieren im Rahmen der synaptischen Entwicklung zugrunde liegen. Um dies zu tun, haben wir eine weitgehend intakte Zubereitung in einem Organismus (Zebrafisch, Danio rerio), die erhebliche Zugkraft für Entwicklungsstudien in den späten 1990er Jahren gewonnen hat. Der Zebrafisch bietet mehrere deutliche Vorteile für neurologische Entwicklungsstudien. Beispielsweise ist ihr Genom sequenziert und einer Morpholino Niederschlägen und Zinkfinger-Nuclease-Knockouts führen kann Genaktivität und Proteinexpression auszuschalten. Man kann auch eine Überexpression Studien durchführen und transgenen Linien konstruiert werden 7-9. Embryonen sind relativ leicht und reichlich zu erwerben, unddie transparente Natur der Embryo eignet sich gut zur Bildgebung und opto genetische Studien. Zusätzlich können Verhaltensanalyse durchgeführt werden, und elektrophysiologischen Experimenten kann auf die Muskelfasern, Rückenmarksneuronen und Hinterhirn-Neuronen in weitgehend intakten Organismen vorgenommen werden, so dass man die Zellfunktion in vivo zu untersuchen. Wichtig ist, dass wir in der Lage, synaptische Aktivität nicht nur in der gleichen Klasse von Zelle zu untersuchen, aber in der gleichen Paar von Neuronen, von der Vorbereitung bis Vorbereitung. Mit anderen Worten, dies ist eine der seltenen wirbel Zubereitungen, in denen man auf die gleiche Neuronen zurückzukehren, in situ, um seine Entwicklung zu untersuchen. Um neuronale Schaltkreise als lebensfähig wie möglich zu halten, entwickelten wir eine Vorbereitung, in der die Hinterhirn und Rückenmark wurden intakt gelassen, während der Patch-Clamp von den M-Zellen. In dieser Vorbereitung werden die Augen-, Kiefer-und Hautüberlagerung des Gehirns sanft entfernt und das Hinterhirn ist peeled weg von der Rückensaite, die den Zugang zu der ventralen Fläche des Hinterhirns. Die retikulospinale Neuronen nur wenige Mikrometer tief und sind relativ leicht zugänglich. Bei 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf, einige Abkürzungen sind in Tabelle 1 aufgeführt) die Zellen elektrisch kompakt und man kann getreue synaptische Aktivität (beide erregenden und hemmenden Ströme), spannungsabhängigen Ströme und Aktionspotentiale von ihnen. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass viele Aspekte der synaptischen Entwicklung und Reifung erfolgen in der 24 Stunden vor dem Schlupf und damit viel von unserer Aufmerksamkeit auf Organismen im Alter von 24 bis 72 hpf hpf konzentriert. Jedoch um 72 hpf, M-Zellen elektrisch weniger kompakt und lassen sich nur schwer richtig Klemmraum. Die Technik kann verwendet werden, um nicht nur die von den M-Zellen, sondern auch von dessen Homologen, MID2 cm und MID3 cm aufzuzeichnen. Theoretisch kann man auch durchführen Doppelaufnahmen, von einem spinal Kabel Neuron, wie einem primären motorischen Neurons und von der M-Zelle, aber das ist schwierig, und es könnte argumentieren, dass die Vorteile aus einer solchen schwierigen Technik gewonnen vielleicht nicht die außerordentlichen Anstrengungen, die erforderlich ist wert sein werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Equipment Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting Dish</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0291</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.001" Tungsten Wire</td>
			<td>Scientific Instruments Services Inc.</td>
			<td>W406</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ9.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>MF-900</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Upright Patch clamp microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMLFSA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou Inc.</td>
			<td>MX7500</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1322A</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>200B</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp9</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Axograph X</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>Axograph X</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

patch clamp recordings from embryonic zebrafish mauthner cells

Mauthner-Zellen (M-Zellen) sind große retikulospinale Neuronen im Hinterhirn der Knochenfische entfernt. Sie sind der Schlüssel-Neuronen in einem charakteristischen Verhalten wie die C-Start-oder Fluchtreaktion, wenn der Organismus eine Bedrohung wahrnimmt, tritt bekannten beteiligt. Die M-Zelle wurde umfassend in der Erwachsenengoldfisch, wo gezeigt wurde, um eine breite Palette von erregenden, hemmende und neuromodulatorischen Signale 1 erhalten sucht. Wir haben die Prüfung M-Zell-Aktivität in embryonalen Zebrafisch, um Aspekte der synaptischen bei einem Wirbeltier Vorbereitung studieren. In den späten 1990er Jahren Ali und Kollegen entwickelten eine Vorbereitung für die Patch-Clamp-Aufnahme von M-Zellen in Zebrafischembryonen, in denen das ZNS war weitgehend intakt 2,3,4. Das Ziel damals war es, synaptische Aktivität aufzeichnen von Hinterhirn-Neuronen, Nervenzellen des Rückenmarks und des Rumpfes Skelettmuskel und gleichzeitig funktionale synaptischen Verbindungen innerhalb einer intakten Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung.Diese Vorbereitung ist immer noch in unserem Labor heute verwendet. Um die zugrunde liegenden Mechanismen der synaptischen Plastizität Entwicklungs untersuchen, notieren wir erregenden (AMPA und NMDA-vermittelte) 5,6 und hemmenden (GABA und Glycin) synaptischen Ströme aus Entwicklungs M-Zellen. Wichtig ist, ermöglicht diese einzigartige Vorbereitung uns, auf der gleichen Zelle (M-Zellen) von der Vorbereitung bis Vorbereitung zurück, sorgfältig zu prüfen synaptische Plastizität und neuro-Entwicklung in einem embryonalen Organismus. Die Vorteile dieser Vorbereitung vorgesehen sind 1) intakt ist, funktionelle synaptische Verbindungen auf den M-Zellen, 2) relativ kostengünstige Präparate, 3) ein großes Angebot an leicht verfügbaren Embryonen 4) die Fähigkeit, auf den gleichen Zelltyp zurück (dh M- Zelle) in jedem Präparat, so daß die synaptische Entwicklung auf der Ebene einer einzelnen Zelle aus Fisch Fischsucht werden, und 5) Abbildungsvoll Zubereitungen wegen der Transparenz des Embryos.

In diesem Manuskript wird eine Methode für die Patch-Clamp-Aufzeichnung in der Ganzzellmodus retikulospinale Neuronen im Zebrafisch, insbesondere die sich auf die M-Zellen. Natürlich ist es auch möglich, in anderen Patch-Clamp-Modi wie Cell-Attached-, innen-außen und von außen aus zu erfassen. Die Art der Daten, die man erhalten kann, ist nicht auf das, was wir hier vorgestellt beschränkt, sondern wir versuchen, ein Beispiel von sowohl synaptische Aktivität (exzitatorische und inhibitorische) in Voltage-Clamp-Modus als auch Aktionspotentiale in Stromklemme bereitzustellen. Wie der Organismus Altersgruppen und die M-Zellen entwickeln umfangreicher und aufwendiger Dendriten, ist die Fähigkeit, angemessen Klemmspannung und Raum klemmen die Zelle beeinträchtigt und die aktuelle Clamp-Modus wird die Aufnahme der Wahl. Fig. 3 zeigt repräsentative Aufzeichnungen von exzitatorischen von HPF 48 Embryonen in Gegenwart des erhaltenen TTX (1 uM) und pharmakologische Mittel zu AMPA und NMDA-Rezeptor-Strömeblockieren GABA-und Glycin-Rezeptoren. Wenn die M-Zellen-Spannung bei -60 mV geklemmt sind die synaptischen Ströme aufgrund der Aktivierung der AMPA-Rezeptoren (Fig. 3A). Erfassung und Analyse dieser Ereignisse ermöglicht es, Parameter wie die Anstiegszeit, Abfallzeit, Amplitude und Frequenz aufzuzeichnen. AMPA Ereignisse haben typischerweise eine schnelle Anstiegszeit (20-80%-Anstiegszeit von ~ 0,1 ms) und Abfallzeit (~ 0,5 ms), und weisen eine mittlere Amplitude von etwa 25 Pa. Wenn die M-Zellen bei +40 mV geklemmt sind die resultierenden Auswärtsströme durch AMPA und NMDA-Rezeptor-Aktivität (Fig. 3C und 3D). NMDA-Rezeptor-Ströme zeigen längere Zeit Kurse als AMPA-Rezeptor-Ströme, und müssen bei positiven Potentialen oder Mg-freie Lösung aufgenommen, um die Mg-Block des NMDA-Rezeptoren zu entfernen 2,6. Die durchschnittliche mEPSC in Fig. 3D gezeigt ist, repräsentiert Misch AMPA und NMDA-Ströme bei +40 mV aufgezeichnet. Figure 4 zeigt repräsentative Ergebnisse bei der Aufnahme von mIPSCs Mauthner-Zellen. Diese Ereignisse traten in der Gegenwart von TTX (1 uM) und Kynurensäure (1 mM) auf AMPA und NMDA-Rezeptoren zu blockieren. Diese Ereignisse zeigen einigermaßen schnellen Anstiegs-und Abfall Kinetik von HPF 48 und häufig genug, um viele von ihnen über einen 2-3 min Aufzeichnungs 3 erwerben. 5 zeigt Aktionspotentiale als Folge der Injektion von depolarisierenden Strom in die Zelle aufgenommen. M-Zellen der 48 hpf Embryonen feuern normalerweise ein einzelnes Aktionspotential (5B), obwohl sie manchmal mehrere APs feuern, wenn sie mit überschwelligen Reiz (5A) eingespritzt. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Abkürzung </td><td> Vollständiger Name </td></tr><tr><td> 1. </td><td> MPSC </td><td> Miniatur postsynaptischen Strom </td></tr><tr><td> 2. </td><td> mEPSC </td><td> Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Strom </td></tr><tr><td> 2 </td><td> mIPSC </td><td> Miniatur-hemmenden postsynaptischen Strom </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MOhm </td><td> Mega Ohm (Einheit des Widerstandes; 10 6 Ohm) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> GOhm </td><td> Giga Ohm (Einheit des Widerstandes; 10 9 Ohm) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> MOsM </td><td> Milli osmolar (Einheit der Osmolarität; 10 -3 osmoles) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> TTX </td><td> Tetrodotoxin </td></tr><tr><td> 5. </td><td> ATP </td><td> Adenosintriphosphat </td></tr><tr><td> 6. </td><td> GTP </td><td> Guanosintriphosphat </td></tr><tr><td> 7. </td><td> GFP </td><td> Grün fluoreszierendes Protein </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Zubehör Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Zergliedern Geschirr </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0291 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 0,001 &quot;Wolframdraht </td><td> Scientific Instruments Services Inc. </td><td> W406 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Binokular </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ9.5 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Pipette Puller </td><td> Sutter Instruments Co. </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Microforge </td><td> Narishige Gruppe </td><td> MF-900 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Upright Patch-Clamp-Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMLFSA </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Mikromanipulator </td><td> Siskiyou Inc. </td><td> MX7500 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> 1322A </td&gt; </tr><tr><td> 8. </td><td> Verstärker </td><td> Molecular Devices </td><td> 200B </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Erfassungssoftware </td><td> Molecular Devices </td><td> pClamp9 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> Axograph X </td><td> Axograph </td><td> Axograph X </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Lösungsname </td><td> Reagenz und Konzentration (mM) </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Zergliedern Lösung </td><td> 134 NaCl, 2,9 KCl, CaCl 2 2.1, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose und 0,02% Tricaine </td></tr><tr><td> 2. </td><td> MPSC Extrazelluläre Lösung </td><td> 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose und 0,001 TTX </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MPSC Intrazelluläre Lösungtion </td><td> 134 CsCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2 ATP, 0,4 Li-GTP </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Aktionspotential Extrazelluläre Lösung </td><td> 137 NaCl, 2,9 KCl, CaCl 2 2.1, 1.2 MgCl 2, 10 und 10 HEPES Glucose (mit 10 uM D-Tubocurarin) </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Aktionspotential Intrazelluläre Lösung </td><td> 130 KCl, NaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 4 mg-ATP und 0,4 Li-GTP. </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Alle extrazellulären Lösungen werden auf 290 mOsm und der pH 7,8 eingestellt. Alle intrazellulären Lösungen werden auf 280 mOsm und der pH 7,4 eingestellt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Sezieren Gericht und intakte Hinterhirn-Rückenmark Vorbereitung. (A) Zergliedern und Aufzeichnung Gericht aus WPI erhalten. Eine dünne Scheibe wird vorsichtig auf t abgedichteter Glasplättchen an der Unterseite der Schale und Sylgard der gut angelegt ist. (B) 48 hpf Hinterhirn-Rückenmark Vorbereitung. Die ventrale Oberfläche des Rautenhirns ist nach oben und der M-Zelle direkt unter der Oberfläche des Gewebes auf der Höhe der Pfeilspitze befindet. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig2.jpg" /> 2. (A) Nomarski Differentialinterferenzkontrast Bild einer M-Zelle kurz nach dem Schlüpfen von einem 2 dpf Embryo erhalten. Das Bild wurde nach der Aufnahme spontane erregende synaptische Aktivität von der M-Zelle aufgenommen. (B) Die Zelle wurde mit Lucifer Yellow während gefüllt das Experiment. 12 Angepasst mit Erlaubnis. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig3.jpg" /> 3. (A) Spontane AMPA mEPSCs von einer M-Zelle aufgenommen<html> bei einem Haltepotential von -60 mV. (B) Durchschnitts mEPSCs vom Aufzeichnungs in (A) erhalten. (C) Spontane AMPA und NMDA (Pfeilspitzen) mEPSCs aus einem M-Zelle bei einem Haltepotential von +40 mV aufgezeichnet. (D) Durchschnittliche mEPSCs vom Aufzeichnungs erhaltenen (C). Glutamat mEPSCs wurden in Gegenwart von TTX (1 uM), um Aktionspotentiale zu blockieren, Strychnin (5 uM) und Picrotoxin (100 &amp;mgr; M) zu Glycin und GABA-Ströme zu blockieren aufgezeichnet. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig4.jpg" /> 4. (A) Spontane mIPSCs aus einem M-Zelle bei einem Haltepotential von -60 mV aufgezeichnet. (B) Durchschnitts mEPSCs vom Aufzeichnungs in (A) erhalten. mIPSCs wurden in Gegenwart von TTX (1 uM) aufgezeichnet, um Aktionspotentiale, Kynurensäure (1 mM) zu blockieren, um Glutamat-Rezeptor-Aktivität und Bicucullin (10 uM) zu blockieren, um GABA-Ströme zu blockieren. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig5.jpg" /> 5. Aktionspotentiale aus einer M-Zelle aufgezeichnet. In dieser bestimmten Zelle ein überschwelligen Reiz (0,48 NA) ausgelöst mehrere Aktionspotentiale (A), sondern ein Stimulus Schwelle führt nur die Herstellung eines einzelnen Aktionspotentials (B). (C) Diese Protokolle für die in A und B gezeigten Spuren.

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Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K Aufrufe.  University of Alberta.  Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen. 

Serie: Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...