The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

פרוטוקול זה מתבצע בהתאם להמלצות ב&quot; המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של האגודה למחקר ברפואת עיניים וראייה &quot;. 1. טיפול בביצה וגביית עיניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן ביצי ליבורנו הלבנות ב12-14 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע 1. אם זמין, להשתמש במקרר יין קירור לאחסון הביצים המופרות. הערה: טמפרטורות גבוהות חנות להוביל להתפתחות לא תקינה של עוברים, ואילו טמפרטורות נמוכות מגבירה תמותה. זמן אחסון מורחב מגדיל שני תמותה והתפתחות לא תקינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הביצים ב37.5 מעלות צלזיוס ו -60% חממת ביצת humidified עם הנדנדה עדינה בתדירות של 5 פעמים בשעה 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הביצים מודגרות מן חממת הביצה בגיל העוברי הרצוי. הערה: גיל העובר העוף נקבע כזמן של דגירה והוא כונה כימים עובריים (E) או כשלבים (רח &#39;), על פי הסדרה של שלבי התפתחות שתוארו על ידי המבורגר והמילטון 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצים שנבחרו בזרימה למינרית. נגב את קליפת הביצה עם 70% אתנול, כדי למנוע זיהום של העובר. הערה: ניהול כל ההליכים בתנאים אספטיים עם פתרונות סטרילי <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> ומכשירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש בצד של הביצה בתקיפות כנגד משטח קשה לפיצוח פתוח הביצה. הנח את התוכן בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ. השתמש בכפית קטנה להעביר את העובר לצלחת פטרי 35 מ&quot;מ המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS כדי למנוע את הרקמות מייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את 35 מ&quot;מ צלחת פטרי המכילה את הרקמה העוברית על מיקרוסקופ לנתח stereovision משקפת בזרימה למינרית. לערוף את העובר על ידי צובט את הצוואר עם מלקחיים עדינים וזורקים את הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בסדר לעשות חתך המחוספס הפה, הגחון לעין. החל באתר של חתך, קורע את הרקמות המקיפות את כל העין. לצבוט את עצב הראייה ולהסיר את העיניים בשלמות מארובת העין. לאסוף צד השמאל ועין ימין מאותו העובר לשימוש כמו גם השליטה או עין שטופלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר את העיניים לצלחת חדשה 35 מ&quot;מ פטרי המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS. </li></ol> 2. הכנת Explants הרשתית השלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים עדינים כדי להסיר את כל הרקמה סביב העין כולל Anlage scleral. הערה: רקמת תנתק בקלות עוזבת את הרשתית על הגוף ועדשת הזגוגית עם אפיתל הפיגמנט (1A-B איור) ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים עדינים לצבוט חתך קטן לאפיתל הפיגמנט בחלק הגב של העין ללא פגיעה ברשתית העצבית (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחי קנס לקרוע בעדינות לפתוח את starti אפיתל הפיגמנטng באתר של חתך, ומשאירה את העדשה ואת כל הרשתית מחוברת לגוף הזגוגי (1D איור). שמור את העין בחם (37 מעלות צלזיוס) 1x PBS כדי להקל על הסרת האפיתל פיגמנט. הערה: אפיתל הפיגמנט עלול להיות קשה להסרת, בפרט לאורך גוף הריסים סביב התלמיד, באזור הקדמי של העין, ולאורך הבקע דמית העין. לכן, חלק מאפיתל הפיגמנט ניתן להשאיר על הרשתית העצבית (איור 1E-F). </li></ol> 3. טיפול בExplants הרשתית השלמה <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation של explants רשתית השלם הערה: Electroporation של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קובט פלסטיק חד פעמי של 1.5 מיליליטר (מ&quot;מ 12.5 מ&quot;מ x 12.5 x 45 מ &#39;מ &#39;) (או כל מיכל קטן מסוגל להחזיק פתרון 300-400 μl) כ 8 מ&quot;מ מהתחתית בעזרת מסור בסדר להב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פלסמיד דנ&quot;א של בחירה ב1xDPBS לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את הפרמטרים electroporator וסט 15 V לST20 - ST25 רשתית (E3-E4) ו -20 V לst26 - st27 רשתית (E5). הגדר את הדופק חוזר ל5 פולסים של 50 דופק באורך msec עם 1 מרווחי שניות. השתמש במחולל פעימות שיכולות להיות נשלט על ידי רגל דוושה על הרצפה כתהיינה צורך בשתי הידיים כדי להחזיק את האלקטרודות במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר (קוטר שטוח, עגול. 4 מ&quot;מ) שתי ההנעה בצורת אלקטרודות פלטינה (איור 2 א) לשקע הפלט על מחולל את הדופק. הערה: אלקטרודות הפלטינה שימוש בפרוטוקול זה נעשו על ידי סדנת האוניברסיטה. אלקטרודות נעשו מ&quot; rondelles &quot;(כיתה פלטינה: 950 Pt / 5 Cu) צלחת פלטינה 0.1 מ&quot;מ. Wi חיבור 0.8 מ&quot;ממחדש היה מבודד באמצעות צינורות פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את כל explant הרשתית מצעד 2.3 לקובט (או מיכל קטן שווה ערך) בעזרת פיפטה פסטר פוליאתילן עם הקצה מנותק לרכוש את גודל טיפ-פתיחה הנכונה עבור explant הרשתית. הימנע משימוש בטיפי פיפטה כמו הרשתית נוטה לצרף לפלסטיק ולקרוע לגזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר בעדינות את כל 1x PBS המקיף את טיפול explant לוקח רשתית שלא לגעת ברשתית כדי למנוע את הקריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פתרון פלסמיד 100 μl לקובט כדי לכסות את כל explant הרשתית. דחף בעדינות את explant הרשתית עם מלקחיים אם זה צף למעלה. שימוש במלקחיים או אלקטרודות למצב העדשה להתמודד עם כל צד אחד של קובט ועצב הראייה לחלק התחתון של קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה החיובית מול העדשה והאלקטרודה השלילית מאחורי הרשתית (איור 2 א), בלי לגעת ברקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">החל הנוכחי על ידי לחיצה הרגל על ​​הדוושה. בדקו בועות באלקטרודות המצביעות על שחרור מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר את כל תערובת פלסמיד מקובט ללא פגיעה ברשתית. תערובת פלסמיד ניתן לעשות שימוש חוזר שלושה עד חמש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את קובט עם מחומם מראש (37 ° C) 1x PBS. שימוש במלקחיים כדי לנתק עדינות explant הרשתית מהקיר של קובט. לאחר electroporation הרשתית לעתים מכוסות בבועות, מה שהופך את לדבוק בקיר של קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיפטה פסטר פוליאתילן להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24-המכילה גם (37 מעלות צלזיוס) מדיום תרבות 1 מיליליטר מחומם מראש לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explant הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל&quot;ד, בתוך תא חממה עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. הסיבוב הוא להבטיח חשיפה המרבית לבינונית ולpreveהידבקות NT של הרשתית לחלק התחתון של צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בexplants רשתית השלם עם ריאגנטים כימיים הערה: טיפול הכימי של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית מצעד 2.3 לתוך צלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר מראש חימם בינונית (37 מעלות צלזיוס) תרבות לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explant רשתית כל במשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל&quot;ד, בתוך תא חממה עם 5% CO 2 לפני הוספת מגיב כימי או רכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון הכימי, למשל Cdk1 / 2 מעכב III, מעכב התקדמות M-שלב 13, בגמרריכוז של 30 מיקרומטר בDMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 24 גם, המכיל את כל explant הרשתית, מן חממת התא. הוסף 10 μl של המגיב הכימי או הרכב (DMSO) ישירות למדיום הרשתית, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 300 ננומטר Cdk1 / 2 מעכב שלישי ב0.01% DMSO. באופן ידני לסובב את צלחת 24 גם כדי לאפשר חלוקה שווה של המגיב הכימי או רכב בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה explants הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל&quot;ד, בתוך חממה עם 5% CO 2 לזמן הרצוי (עד 24 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב 4. </li></ol></li></ol> 4. קיבוע והקפאה של כל הפריטים הרשתית Eexplants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 24 היטב המכילה את explant רשתית כל מטופלים מן חממת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם קר כקרח paraformaldehyde 4% ב1xPBS. אינקובטוריםטה על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם 1xPBS הקרח הקר לשטוף את הרשתית. דגירה על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם סוכרוז 30% קרים כקרח ב1xPBS. לדגור על קרח במשך 1-3 שעות, בהתאם ליום העוברי של הרשתית. לST20 - ST25 רשתית (E3), דגירה עבור שעה 1, רשתית מבוגרת זקוק לזמן דגירה ארוך יותר בסוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית על סרט פרפין המכיל הרכבה בינונית כ -500 הקפאת cryostat μl. הסר ככל סוכרוז ככל האפשר על ידי בעדינות להזיז את explant הרשתית במדיום ההקפאה באמצעות הכפית הקטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את explant הרשתית לעובש הטבעה מכיל מדיום הקפאה. מקם את העיניים כדי להקל על חתך בעתיד. שים עובש ההטבעה מכיל את כל explant הרשתית על ד&quot;רקרח y עד הבינוני קפוא מוצק. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בעבודה זו בפרוטוקול מפורט לנתיחה, electroporation או טיפול כימי, וculturing של explants רשתית השלם מעוברי עוף מוצג. פרוטוקול זה הוא קל, מהיר ומאפשר לשניהם שיעור הצלחה גבוה ושחזור תוצאות. Electroporation של explants רשתית השלם מייצר שטחים גדולים של...

הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית ואת זה הוא, בפשטותה היחסית ואדריכלות סלולרית מאופיינת היטב, דגם פופולרי לחקר התפתחות מערכת עצבים מרכזית. עינו של עובר העוף היא יחסית גדולות בהשוואה לשאר העובר. לכן נגיש בקלות באובו למניפולציות ניסיוניות, כגון זריקות או electroporation, ומשמש ככלי מצוין לצבור ידע על תאים ברשתית וביולוגיה התפתחותית בvivo. למרות יתרונות הגדולים אלה, הישרדות של העוברים יכולה להיות נמוכה כאשר ניסויים פולשניים כגון עם electroporations, זריקות חוזרות ונשנות, או מניפולציות ניסיוניות משולבות. Electroporation של פלסמידים DNA לעובר העוף באובו הוא טכניקה חשובה ומבוססת 1. היא מאפשרת תיוג של תאי עצב, התחקות של גורל תא, כמו גם שטחים עצביים בnerv המרכזימערכת היחידות הארגוניות והיא מאפשרת לביטוי גנים מחוץ לרחם לנתח תפקוד חלבון in vivo. הטכניקה נוצלה בעבר ללימודים של צינור עצבי 2, המוח האחורי 3, ורשתית 4. יש Electroporation של רשתית עוברית באוב כמה קשיים ניסיוניים הקשורים למצב in vivo. העמדה של העין, בשל קיפול הגולגולת של העובר, קרובה יחסית ללב. קרבה זו מגדילה את הסיכון של דום לב לאחר electroporation, והסיכון עולה עם גיל העובר. יתר על כן, כדי לגשת לעין, יש צורך לפתוח את הקרומים העובריים, ובכך להגדיל את הסיכון לדימום, מומים וכדאיות מופחתים שלאחר מכן. כאשר בודקים ואופטימיזציה פלסמיד דנ&quot;א חדש לעתים קרובות ללא תוצאה פנוטיפי ידועה, מגבלות אלה עשויות להקטין את היעילות וכוחה של השיטה אפילו בניסויים מנוסים. כפי שהוצג בפרוטוקול זה, התרבות של wexplant החור ברשתית, שהוגדר כרשתית עצבית השלמה עם אפיתל הפיגמנט הוסר, הוא שיטה יעילה המשלימה בגישת אוב. זריקות תוך עיניות של ריאגנטים כימיים קלות יחסית לביצוע באוב. עם זאת, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים שהוחדרו בתוך הרשתית העצבית עלול להיות קשה לשלוט באופן מלא. הנפח המוזרק עשוי להשתנות עקב דליפה ואתר הזרקה המדויק עשוי להשפיע הן על חלוקת מגיב בתוך העין ודיפוזיה דרך הגוף הזגוגי. ההשתנות תהיה השלכות משמעותיות על הפרשנות של התוצאות כאשר כלומר, עקומת תגובה למינון מעכב אנזים נקבעה; במיוחד אם ההשפעה היא קטנה והחלון הזמני של ההשפעה הוא צר. יתר על כן, רק עין אחת יכולה לשמש מכל עובר בעת ביצוע ניסויים באובו בשל השפעות מערכתיות פוטנציאליות דרך זרם הדםעל העין הנגדית. התאמת גיל היא חשובה כאשר לומדים פיתוח והשתנות בודדות בין מטופלים ועוברים בקרה עשויה להוביל לשונות ניסיוניות נוספות. מסיבות אלה, לשעבר אוב שיטה המבוססת על explants רשתית מעוברי עוף פותח, שברשתית העצבית יכולה להיות חשופה למדים ובשליטת תנאי ניסוי במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי פותח על בסיס פרוטוקולים קודמים 5-9. explants רשתית מבמה (רח &#39;) 20 (ימים עובריים [E] 3) לst31 (E7) עוברי עופות נותחו, תרבותי וelectroporated עם ריכוז פלסמיד דנ&quot;א מוגדר או שנחשפו למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי. הפרוטוקול המובא כאן כבר מיושם בהצלחה בפרסומים האחרונים, באמצעות כמה ריאגנטים כימיים שונים, כולל רגולטורים של מסלול הנזק לדנ&quot;א, כגון KU55933, SB 218,078, ומועצה לביטחון לאומי 109,555 דיטוsylate, ומחזור התא, כגון Cdk1 / 2 מעכב שלישי 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Local supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

הרשתית היא מודל טוב למערכת העצבים המרכזית בפיתוח. הגודל הגדול של העין והכי חשוב הנגישות למניפולציות ניסוייות באובו / in vivo הופך את הרשתית העוברית עוף מודל ניסיוני רב-תכליתי ויעיל מאוד. למרות רשתית העוף קלה למקד באוב על ידי זריקות או electroporation התוך עיני, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים בתוך הרשתית עלול להיות קשה לשליטה מלאה. זה יכול להיות בגלל וריאציות של האתר המדויק הזרקה, דליפה מהעין או דיפוזיה אחידה של החומרים. יתר על כן, בתדירות של מומים ותמותה לאחר מניפולציות פולשנית כגון electroporation היא גבוהה למדי. פרוטוקול זה מתאר לשעבר אובו הטכניקה לculturing explants רשתית שלם מעוברי עוף ומספק שיטה לחשיפה מבוקרת של הרשתית לחומרים כימיים. פרוטוcol מתאר כיצד לנתח, ניסוי לתפעל, וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. Explants יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות ויהיה נתון למניפולציות שונות כגון electroporation. היתרונות העיקריים הם כי הניסוי אינו תלוי בהישרדות של העובר וכי הריכוז של המגיב הציג יכול להיות מגוון ומבוקר על מנת לקבוע ולייעל את הריכוז האפקטיבי. יתר על כן, הטכניקה היא מהירה, זולה ויחד עם השיעור הגבוה הניסיוני שלה להצלחה, הוא מבטיח לשחזור תוצאות. יודגש כי היא משמשת כמצוינת כדי להשלים את הניסויים שבוצעו באוב.

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה (איור 1 א-ו) וculturing של explants רשתית השלם מעוברי תרנגולת. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לכל explants רשתית מעוברים של ST20 (E3) לst31 (E7). Electroporation של פלסמידים DNA לתוך explants רשתית שלם מאפשר תיוג ומעקב של תאים ברשתית או בי?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments at JoVE.com

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

whole-retinal-explants-from-chicken-embryos-for-electroporation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Views.  Uppsala University.  פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית. 

Video: Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Generation of Na&amp;#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...