פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בהצלחה הן כדי לגרום לתגובה דלקתית ופיברוטית חשובה בשתי הריאות על ידי הזרקת אנדוטראצ'ין של Bleomycin ולאמת טיפולים מערכתיים אנטי דלקתיים ואנטי פיברוטיים חדשים על ידי עירוי וריד הזנב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי הזרקה ישירה של Bleomycin לתוך קנה הנשימה של העכבר מבטיח מיקוד מהיר של הריאות ללא כל נשפך בדרכי הנשימה העליונות המאפשר אינדוקציה בטוחה, חזקה להתרבות של דלקת ריאות פיברוזיס. הדגמת ההליך תהיה ד"ר פיורנזה אורלנדו, רופאה וטרינרית מהמעבדה שלנו.
כדי להתחיל, למקם את העכבר הרדמה שוכב על גבו על פלטפורמה כירורגית. בעדינות לתקן את רגליו עם רצועות סרט כירורגי להחזיק אותו במקום. כדי להאריך את צוואר העכבר, מניחים תמיכה כגון גליל כותנה דנטלית מתחת לאזור צוואר הרחם שלה.
לאחר מכן השתמש בסכין גילוח כדי לגלח בעדינות את הגרון. השתמש בזוג מדפים אנטומיים כדי לצבוט את העור. השתמש זוג טבעת טיפל מספריים קהה מעוקל לעשות חתך קצר כחצי סנטימטר אורך בהתכתבות לשריר sternohyoid העכבר.
השתמש מקלות צמר גפן כדי לעצור כל דימום. לאחר מכן החיצוני קנה הנשימה על ידי ניתוח קהה בעדינות לנקות אותו משומן ורקמות אחרות. סובב את הפלטפורמה הכירורגית כדי לכוון את העכבר עם ראשו לכיוון המפעיל המאפשר למפעיל במהלך ההזרקה לזווית את המזרק כראוי.
כדי לדמיין את קנה הנשימה, מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ הפעלה. התאם את התאורה והגדר הגדלה בין 1 ל- 1.2 ולאחר מכן התאם את המוקד ואת החדות. קנה הנשימה ניתן להבדיל בקלות כמו צינור שקוף לבן עם טבעות קנה הנשימה גלוי בבירור.
בעדינות פיפטה לערבב את פתרון Bleomycin ולשם 100 microliters לתוך מזרק 0.5 מיליליטר עם מחט מד 25 הימנעות היווצרות בועה. לאחר קנה הנשימה הוא דמיין בבירור, בזהירות לנקב אותו עם קצה המחט בזווית של 30 מעלות. לאט להזריק 100 microliters של Bleomycin ישירות לתוך לומן של קנה הנשימה.
לאחר המתנה של כמה שניות עבור כל נפח לנסוע במורד המחט, להסיר אותו מן קנה הנשימה. שים לב כמה שניות של דום נשימה המתרחשים כאשר המחט מוכנס כראוי לתוך קנה הנשימה המציין כי כל נפח הנוזל כבר בשאיפה. השלך בבטחה את המזרק והמחט.
סגור את fascia תת עורית ואת פצע העור עם תפר 5-0 נספג ולאפשר את החיה להתאושש. לאחר הרדמה של העכבר שוב ופעם חוסר הכרה אושר, מניחים את העכבר מתחת למכסה המנוע סטרילי. השתמשו במסכת פנים עם זרימה רציפה של 1.5% איזופלורן כדי לשמור על הרדמה עדינה לאורך כל הניסוי.
כדי לקדם vasodilation ולאפשר הזרקה קלה יותר, להשרות את הזנב במים חמים במשך שתי דקות. מערבבים השעיה של תאים סטרומה mesenchymal חבל הטבור האנושי על ידי צינור בעדינות כדי למנוע היווצרות גוש התא. שאפת 200 microliters לתוך מזרק מיליליטר אחד עם מחט 26 מד הימנעות היווצרות בועה.
החזק את הזנב בקצה ויישר אותו בעדינות. לאחר מכן אתר את הוריד האחורי של הזנב. מגרדים בעדינות את הזנב עם אזמל ומנגבים אותו עם 70% אתנול.
החל מהחלק הדיסטלי של הזנב, הכנס את המחט לווריד בזווית של 15 מעלות. לאט להחדיר 200 microliters של תאים סטרומליים חבל הטבור האנושי. כדי לפקח על עירוי תוך ורדם מוצלח, להתבונן בנוזל הנכנס לווריד ללא התנגדות וחוסר פזרנות.
לאחר המתנה של מספר שניות עד שכל אמצעי האחסון נע במורד המחט, הסר אותה מהווריד. לאחר מכן להפעיל בקצרה לחץ על פצע הכניסה עם גזה סטרילית כדי למנוע דימום ולאפשר את החיה להתאושש. השלך בבטחה את המזרק ואת המחט לאחר העירוי.
לאחר הזרקת Bleomycin, שינויים היסטופתולוגיים ריאות הוערכו על ידי Hematoxylin ו אאוסין ו Picrosirius אדום כתמים המאשר חדירה דלקתית נרחבת פיברוזיס לעומת ארכיטקטורת ריאות נורמלית לאחר הזרקת מלוחים. דלקת ריאות הנגרמת על ידי בלומיצין ופיברוזיס הוחלשו במידה רבה על ידי עירוי תאי סטרומה של חבל הטבור האנושי, אך לא על ידי תמיסת מלח. תצהיר קולגן נמדד על ידי מטח הידרוקסיפרולין.
בעקבות הזרקת Bleomycin, רמות הידרוקסיפרולין גדל בהדרגה מהיום השמיני ליום 14 ו 21. בעוד התוספת של תאים סטרומה mesenchymal חבל הטבור האנושי הפחית באופן משמעותי את ההשפעות של Bleomycin. רמות הביטוי של גן קולגן מסוג Col1A1 ב- mRNA של ריאות שלמות הראו גם עלייה הדרגתית בימים 8, 14 ו -21 אשר הופחתה חלקית על ידי טיפול בתא סטרומה של חבל הטבור האנושי.
כשל חיסוני בנוגדנים ספציפיים הראה כי תאי סטרומה של חבל הטבור האנושי החדיר במהירות וביעילות הגיעו לריאות העכבר, אם כי רק תאים מעטים זוהו. נתונים אלה מצביעים על נקע מהיר של התאים מהפגיעה באתר למרות אפקט ההגנה הממושך. השימוש במיקרוסקופ הפעלה מבטיח ביטחון גבוה בהצלחה בכך שהוא מאפשר למפעיל לנטר במדויק את המיקום הנכון של המחט לקנה הנשימה של העכבר לפני ההתקנה, ובכך למזער את הסיכון לפגיעה בו.
