פלואורו-רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של שרירי השלד של סוסים

פרוטוקולים אלה מאפשרים לחוקרים ללכת מעבר למדידת צריכת חמצן מיטוכונדריאלית בלבד, ובמקום זאת מאפשרים מדידה של תוצרי קצה מיטוכונדריאליים מרכזיים, ATP ומיני חמצן תגובתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהחוקר יכול למדוד את יעילות המיטוכונדריה על ידי השוואה ישירה של קצב צריכת החמצן לקצב ייצור המוצר הסופי. בין אם המוצר הסופי הוא ATP או חמצן תגובתי.

הטכניקות דורשות תשומת לב קפדנית מאוד לפרטים, במיוחד בהימנעות מבועות. בין אם הם נמצאים בתא הנשימה או מזרקי טיטרציה, בועות הן האויב שלך מכיוון שהן הופכות את המדידות לפחות מדויקות. לאחר קבלת ביופסיות שריר השלד.

מלאו את תאי הרספירומטר במדיה נטולת מגנזיום ואטמו את תא הדגירה. הגדר את טמפרטורת הדגירה של המכשיר ל -38 מעלות צלזיוס כדי לייצג את הטמפרטורה הבסיסית של שרירי השלד של סוסים. ולהגדיר את הערבוב של אמצעי הנשימה על 750 סל"ד באמצעות ערבוב מגנטי מסתובב בתחתית תא respirometer.

לאחר מכן, כבה את תאורת התא כדי למנוע הפרעה לחיישני פלורסנט. הפעל את אלקטרודת החמצן עם מתח קיטוב של 800 מיליוולט והגבר את האות המתקבל עם הגדרת רווח של אחד. רשום את ריכוז החמצן כל שתי שניות וחשב את שטף החמצן כשיפוע השלילי של מדידת החמצן במהלך 40 השניות.

לאחר מכן כייל את חיישן החמצן על ידי מתן אפשרות למדיה להתאזן עם אוויר החדר. חשב את הלחץ החלקי של חמצן הייחוס בהתבסס על לחץ ברומטרי שנמדד על ידי רספירומטר ברזולוציה גבוהה וריכוז חמצן אטמוספרי סטנדרטי. השתמש בחיישנים פלואורסצנטיים ירוקים כדי לכמת את האות הפלואורסצנטי מתא הנשימה.

הפעל את החיישנים ב 400 עד 500 מיליוולט והאות המתקבל מקבל מוגבר עם רווח של 1 עד 1, 000. לאחר מכן, הוסיפו TMRM לתא הנשימה לפני הוספת מיטוכונדריה וכיילו את האות הפלואורסצנטי באמצעות כיול פשוט של שתי נקודות של האות הפלואורסצנטי לעומת כמות הפלואורופור שנוספה לפני הוספת המיטוכונדריה. בצע את הכיול הסופי של אות TMRM לאחר השלמת פרוטוקול הטיטרציה של הספירומטריה על ידי העברת מספר טיטרציות של סוכן uncoupling עד שלא נצפו עליות נוספות באות הפלואורסצנטי של TMRM המצביעות על קריסה מוחלטת של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית.

השתמש בחיישנים פלואורסצנטיים כחולים כדי לכמת את האות הפלואורסצנטי מתא הנשימה ולהמריץ חיישנים אלה עבור מכשירים בודדים כדי ללכוד את האות הצפוי בטווח הליניארי של החיישן. הוסף שמונה מיקרוליטרים של EDTA שני מילימולרי לתא הנשימה לקטיוני כלאט שיתחרו עם יוני מגנזיום על קשירה למגנזיום ירוק. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיקרוליטרים של מילימולר מגנזיום ירוק לתא הנשימה.

כיילו את האות הפלואורסצנטי הגולמי עם טיטרציות רציפות של 10 על 2 מיקרוליטר של מגנזיום כלורי 100 מילימולרי, ואפשרו דקה אחת בין הטיטרציות לייצב את האות הפלואורסצנטי. קבע את קצב הסינתזה של ATTP שהוא שיפוע ריכוז ה- ATP לאורך זמן לאורך כל הפרוטוקול. השתמש בחיישנים פלואורסצנטיים ירוקים כדי לכמת את האות הפלואורסצנטי מתא הנשימה.

הפעל את החיישנים במהירות של 300 עד 400 מיליוולט. ואת האות המתקבל מקבל מוגבר עם רווח של 1 עד 1, 000. מטב הגדרות ספציפיות עבור מכשירים בודדים כדי ללכוד את האות הצפוי בטווח הליניארי של החיישן.

לפני הוספת המיטוכונדריה, בצע את ההתקנה הכימית והכיול הראשוני של בדיקת Amplex UltraRed. הוסף 30 מיקרומול של DTPA לקטיוני כלאט שעלולים להפריע לתגובה. לאחר מכן הוסף סופראוקסיד דיסמוטאז או סרטוס פרוקסידאז ו- Amplex UltraRed בתא הספירומטריה.

אפשרו לאות הפלואורסצנטי להתייצב. לאחר מכן להוסיף 0.2 מיקרומול של מי חמצן פעמיים עם פער של חמש דקות. בצע כיול נוסף של שתי נקודות לאורך הבדיקה כדי לאפשר התאמה של תגובת הבדיקה כאשר הכימיה של הרספירומטריה משתנה לאורך הבדיקה עם העיתוי הספציפי של נקודות כיול אלה לפי שיקול דעתו של החוקר.

מערבלים את הדגימה כדי לשמור על תרחיף דגימה אחיד ומוסיפים 15 מיקרוליטר של תרחיף מיטוכונדריה מבודד לכל תא דגירה של שני מיליליטר כך שהתוצאות מייצגות את התפוקה המיטוכונדריאלית של 18.75 מיליגרם שריר. לפני הוספת מצעים כלשהם, מדדו את צריכת החמצן השיורית והפחיתו ערך זה מערכי צריכת החמצן של כל שלב בטיטרציה המעכבת הבלתי מצומדת של המצע או בפרוטוקול SUIT לאחר השלמתו. השתמש בחליפה לשימוש כללי המאפשרת אפיון ראשוני של תפקוד מיטוכונדריה של שרירי השלד של סוסים.

התחילו עם טיטרציות רציפות של פירובט, גלוטמט ומלאט זה לתוך זה לתוך כל תא כדי לייצר ניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד ולעורר נשימה לא-זרחנית הנתמכת על ידי NADH מחומצן באמצעות דליפה מורכבת על בסיס אחד. לאחר מכן הוסף ADP כדי לעורר נשימה זרחני באמצעות נשימה זרחני אחד מורכב. הוסף succinate כדי לייצר נשימה phosphorylating על ידי שילוב מורכב אחד מורכב מורכב שתי phosphorylating נשימה להוסיף rotenone לחסום אחד מורכב.

שטף החמצן שנוצר מייצג את היכולת של קומפלקס שניים לתמוך בצריכת חמצן מיטוכונדריאלית על ידי חמצון של סוקצינט בלבד. מוצג מעקב רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של שרירי השלד של סוסים, נשימה מיטוכונדריאלית ופוטנציאל קרום יחסי. ערכי הנשימה של מיטוכונדריה המודגרת עם TMRM נמוכים יותר עקב השפעה מעכבת של אותו פלואורופור.

נשימה מיטוכונדריאלית וסינתזה ATTP של שרירי שלד סוסים המכילים אחוז גבוה של סיבי שריר שלד עשירים במיטוכונדריה מסוג אחד ומודגרים בתנאים הקרובים לחילוף חומרים במנוחה מוצגים. עקבות רספירומטריה של נשימה מיטוכונדריאלית של שרירי השלד של סוסים וייצור מי חמצן מוצגים. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה דורשת סבלנות רבה.

לאדם שמפעיל את הבדיקה יהיו נקודות זמן רבות שבהן הוא צריך לבצע שיחת שיפוט לגבי האם הושג מצב יציב והצעד הבא יכול להתרחש. הדגמנו רק פרוטוקול טיטרציה אחד. ישנם עוד עשרות פרוטוקולים שניתן ליישם באותו אופן כדי לענות על שאלות ספציפיות לגבי חילוף החומרים במיטוכונדריה.