The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.

כל פרוטוקולי העכבר היו בהתאם למכונים לאומי לבריאות הנחיות ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים הלימודים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון (סנט לואיס, מיזורי). 1. הכנת צלחת הבדיקה ומארזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את משטח הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure תרמי הבדיקה חוט T-הסוג אל פני השטח באמצע צלחת הזכוכית עם קלטת מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המארזים של בעלי החיים על צלחת הזכוכית בשורה אחת יחד אמצע הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השחל את תרמי הבדיקה דרך מתחם בעלי החיים המרכז ולחבר אל אוגר נתונים. הפעל אוגר נתונים על תוך כיבוי אוטומטי תכונת הכיבוי, ולצרף את אוגר נתונים למחשב באמצעות הכבל המסופק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקלטת טמפרטורת הצלחת במהלך הניסוי, לפתוח את התוכנה לוגר נתונים כדי להתחיל בהקלטת טמפרטורות צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, להתאים את התוכנה מחדשכבל טמפרטורת צלחת אחת לשנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בהקלטת טמפרטורות באמצעות התוכנה ארוזה עם אוגר נתונים התרמי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את המארז עם מוסיף שחור כדי למנוע אינטראקציה חזותית בין עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה משקפת מתחת לזכוכית כך שהחלק התחתון של המארזים גלוי ממצב של ישיבה נוח. </li></ol> 2. התחממות / קירור צלחת הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא תיבות אלומיניום עם מים מחוממים, קרח רטוב, או קרח יבש ולמקם אותם כראוי על צלחת הזכוכית (גם מנות רדיד אלומיניום מלאים בקרח יבש יכולות לשמש כדי לקרר את הזכוכית; איור 1) 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקה ב 30 מעלות צלזיוס, מקם את קופסות האלומיניום כ 0.25 &#39;&#39; ממארזי בעלי החיים (איור 2) 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר circulator מים מחומם בכל צד של צלחת הזכוכית. הגדר את circulator ל45-60 מעלות צלזיוס, ואותנודואר זה כדי למלא את תיבות אלומיניום עם זרם קבוע של מים חמים (איור 1 ג) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את circulators כך שהמים החמים מתיבות האלומיניום מנקז ישירות בחזרה למאגר של circulator בכל צד (איור 1 ג) 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקה ב RT, לעזוב את התיבות ריק (איור 2) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקה בגיל 17 ° C, למקם את התיבות כ 0.25 &#39;&#39; ממארזי בעלי החיים משני הצדדים ולמלא עם קרח רטוב (איור 2) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקה ב 12 ° C, למקם את התיבות כ -1.25 &#39;&#39; ממארזים מכל צד ולמלא עם קרח יבש (איור 2) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקה ב5 מעלות צלזיוס, למקם את התיבות כ 0.25 &#39;&#39; ממארזים מכל צד ולמלא עם קרח יבש (איור 2) 2.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קירור הכוס בקרח יבש, לוודא שיש אוורור מספיק כדי למנוע הצטברות CO 2 בחדר. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה לזכוכית להגיע לטווח הטמפרטורה הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את העכברים למארזים על הצלחת. הערה: מחולל רעש לבן ניתן להשתמש כדי להקטין מטרדי רעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה לעכברים להסתגל. הערה: במתקן שלנו זה לוקח בערך 2.5 שעות, אך עשויים להשתנות באופן משמעותי המבוסס על דיור בעלי חיים ותנאי טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על הזכוכית במגוון הטמפרטורה הרצויה על ידי הבטחה כי התיבות נשמרות מלאה מים התחממו, קרח רטוב, או קרח יבש. הערה: עם המנגנון שלנו את התיבות צריכה להיות ומילא עם קרח בערך כל 90 דקות. הערה: למצב C ° 17, זה מועיל לרוקן את רוב המים מקופסות האלומיניום דרך חורי הניקוז לפני המילוי אותו עם קרח. זה יתייצב, ויחסי ציבור הטמפרטורה טובים יותרהצפת אירוע הערה: כמות הקרח היבש המדויקת משתנות עונתית, אבל באופן כללי שמירה על קופסות יותר מ ¼ מלאים לאורך כל אורכו של התיבה ישמור טמפרטורה קבועה. </li></ol> 3. בדיקת העכברים בטמפרטורות קבועות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחוץ לחדר התנהגותיות, למלא דלי קרח כמחצית מלאה של קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפטיש או פטיש, לרסק את הקרח היבש לאבקה דקה. הערה: מילוי יתר של הדלי יקשה לרסק את הקרח היבש באופן מלא באבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח ישר או מספריים, לחתוך את החלק העליון את מזרק 3 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 21 G, לתקוע 3 חורים בצדדים מנוגדים של המזרק (הכולל של 6 חורים). הערה: חורים אלה יקטינו את הלחץ שנוצר על ידי סובלימציה תוך דחיסת הקרח היבש. המזרק החתוך ניתן לעשות שימוש חוזר בניסויים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המזרק, אבקת קרח יבשה, ושעון עצר שנערך ביד לחדר התנהגותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את תא מזרק חצי מלא של אבקת קרח יבשה. החזק את הקצוות של המזרק נגד אובייקט שטוח, ובתקיפות לדחוס את האבקה באמצעות הבוכנה. היזהר; בוכנת הפלסטיק עלולה לכופף או לשבור מהלחץ. אם זה יקרה, להחליף את הבוכנה של מזרק חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את הקצה של גלולה הקרח היבשה הדחוסה עבר הקצה של המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי מבחן כי הם מלא במנוחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על 30 מעלות צלזיוס, 23 ° C ו -17 ° C, עכברי מבחן שכל 4 כפות על הזכוכית ולא זזו, אבל לא ישן 19 באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 12 מעלות צלזיוס, 5 מעלות צלזיוס, עכברי מבחן, כי הם על 2 כפות או 4 כפות ולא זזו או לקפוץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש במראות למיקוד, בעדינות אך בתקיפות לחצו על סומק גלולה השטוח על משטח הזכוכית מתחת לhindpaw העכבר (איור 1 א) 2. התחל היד-טיימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את שעון העצר ולהסיר את הכדור כאשר העכבר מתרחק מהזכוכית מקוררת. הערה: תנועת הנסיגה יכולה להיות אנכית או אופקית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם העכבר נע לזמן קצר מאוד כפה ולאחר מכן מחזיר אותו אל פני השטח הקירור, תמשיך עיתוי וגירוי עד העכבר עושה צעד קבוע משם. הערה: המעבדה שלנו משתמשת בזמן גירוי מקסימאלי של 20 שניות לעכברים ברוב המכריע של המקרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך בדיקה זו לפחות עד 3 ערכים על כל כף רגל של כל בעלי חיים שנאספו. ניסויים נפרדים בדיקת כפות הפוכות באותו העכבר על ידי לפחות 7 דקות, ומשפטים רצופים נפרדים על כל כף רגל אחת על ידי לפחות 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להשתמש בעוביים שונים של זכוכית כדי ליצור שיעורים שונים של קירור (איור 3) 1. הערה: שיעור הקירור קשור ביחס הפוך עם העובי של הזכוכית. </li></ol> 4. בדיקת העכברים במהלך קרה הסתגלות שימו לב: זה פרוטוקול חלופי המאפשר בדיקה כplat הזכוכיתדואר מתקרר, ולא פעם אחת הצלחת התייצבה והעכברים יש להתאים באופן מלא לסביבה הקרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות המופיעות בסעיף 1 להקמת המנגנון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות המופיעות בסעיף 3 לקחת מידות בסיס בRT (איור 7 א) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לקרר את תיבות אלומיניום עם קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ששיהוי נסיגת בסיס נמדד, למקם את תיבות precooled על הצלחת כ -1.25 &#39;&#39; מהמארזים משני הצדדים (איור 7 א, חץ שכותרתו &quot;קרח יבש הוסיף&quot;) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות המופיעות בסעיף 3 כדי לבצע מדידות כצלחת הזכוכית מתקררת, במדידות לעתים קרובות ככל האפשר. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Behavioral+Assay+for+Measuring+Cold+Sensation+in+Mice.">A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice.</a> Plos ONE. 7 (6), 8 (2012).</li><li>Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+to+measure+cold+adaptation+in+freely+behaving+mice.">A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2014).</li><li>Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+signs+of+ongoing+pain+and+cold+allodynia+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain.">Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain.</a> Pain. 59 (3), 369-376 (1994).</li><li>Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+increased+expression+of+transient+receptor+potential+melastatin+8+in+oxaliplatin-induced+cold+allodynia+in+mice.">Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice.</a> Neuroscience letters. 458 (2), 93-95 (2009).</li><li>Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+manifestations+of+an+experimental+model+for+peripheral+neuropathy+produced+by+spinal+nerve+ligation+in+the+primate.">Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate.</a> Pain. 56 (2), 155-166 (1994).</li><li>Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+cold+water+tail-flick:+A+novel+analgesic+test+that+distinguishes+opioid+agonists+from+mixed+agonist-antagonists.">Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists.</a> European Journal of Pharmacology. 119 (1-2), 23-29 (1985).</li><li>Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+unpredictable+stress+inhibits+nociception+in+male+rats.">Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats.</a> Neuroscience letters. 359 (1-2), 73-76 (2004).</li><li>Karashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+acts+as+a+cold+sensor+in+vitro+and+in+vivo.">TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (4), 1273-1278 (2009).</li><li>Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM8,+but+not+TRPA1,+is+required+for+neural+and+behavioral+responses+to+acute+noxious+cold+temperatures+and+cold-mimetics+in+vivo.">TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo.</a> Pain. 150 (2), 340-350 (2010).</li><li>Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cold+pain,+cold+allodynia+and+cold+hyperalgesia+in+freely+behaving+rats.">Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats.</a> Molecular pain. 1, 36 (2005).</li><li>Colburn, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+cold+sensitivity+in+TRPM8+null+mice.">Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice.</a> Neuron. 54 (3), 379-386 (2007).</li><li>Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM8+is+required+for+cold+sensation+in+mice.">TRPM8 is required for cold sensation in mice.</a> Neuron. 54 (3), 371-378 (2007).</li><li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menthol+receptor+TRPM8+is+the+principal+detector+of+environmental+cold.">The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold.</a> Nature. 448 (7150), 204-208 (2007).</li><li>Obata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrpA1+induced+in+sensory+neurons+contributes+to+cold+hyperalgesia+after+inflammation+and+nerve+injury.">TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (9), 2393-2401 (2005).</li><li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirt+functions+as+an+endogenous+regulator+of+TRPM8.">Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8.</a> Nature communications. 4, 2179 (2013).</li><li>Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+thermal+selection+behavior+in+mice+lacking+transient+receptor+potential+vanilloid+4.">Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (5), 1304-1310 (2005).</li><li>Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+code+for+Mammalian+thermosensation.">The cellular code for Mammalian thermosensation.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (13), 5533-5541 (2013).</li><li>Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -. J., Barrot, M., Poisbeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+thermal+allodynia+and+hyperalgesia+using+dynamic+hot+and+cold+plate+in+rodents.">Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents.</a> The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10 (7), 767-773 (2009).</li><li>Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mechanical+and+thermal+nociceptive+sensitivity+in+the+laboratory+mouse+by+behavioral+state.">Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state.</a> The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9 (2), 174-184 (2008).</li><li>Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+set+point+for+thermal+adaptation+requires+phospholipase+C-mediated+regulation+of+TRPM8+in+vivo.">A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo.</a> Pain. , (2014).</li><li>Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPV1+in+the+spinal+cord+by+oxidized+linoleic+acid+metabolites+contributes+to+inflammatory+hyperalgesia.">Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18820-18824 (2009).</li><li>Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Temperature+Affects+the+Temperature+Threshold+for+TRPM8+Activation+through+Interaction+of+Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate.">Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate.</a> Journal of Neuroscience. 33 (14), 6154-6159 (2013).</li><li>Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI(4,5)P2+regulates+the+activation+and+desensitization+of+TRPM8+channels+through+the+TRP+domain.">PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain.</a> Nature neuroscience. 8 (5), 626-634 (2005).</li><li>Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+neuronal+cold+sensor+TRPM8+is+regulated+by+phospholipase+C+via+the+phospholipid+phosphoinositol+4,5-bisphosphate.">Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate.</a> The Journal of biological chemistry. 284 (3), 1570-1582 (2009).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurokinin-1+receptor+enhances+TRPV1+activity+in+primary+sensory+neurons+via+PKCepsilon:+a+novel+pathway+for+heat+hyperalgesia.">Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (44), 12067-12077 (2007).</li><li>Wang, H., Zylka, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mrgprd-expressing+polymodal+nociceptive+neurons+innervate+most+known+classes+of+substantia+gelatinosa+neurons.">Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (42), 13202-13209 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and ge...

מדידת היענות קרה במכרסמים היא חשובה לשיפור הבנתנו את המנגנונים האפשריים של רגישות קרה בבני אדם תחת שני תנאים נורמלים ופתולוגיים. קר Plantar Assay (CPA), שפותח במקור לפני מספר שנות 1, נועדה ליצור תגובות לשחזור, חד-משמעיות עכבריות התנהגות לגירוי קר נשא בRT. יותר שיפורים האחרונים של assay זה אפשרו את המדידה לשחזור של רגישות קרה במגוון רחב של טמפרטורות 2. שני הגרסאות גם נועדו להיות יחסית תפוקה גבוהה, וזול לשימוש. התקדמות רבה נעשה בהבנת המנגנונים של רגישות קרה באמצעות שיטות התנהגותיות אחרות. שיטה אחת היא מבחן אידוי אצטון, הכולל מספיג או ריסוס אצטון על כפת העכבר ומדידת משך זמן שמבלה העכבר מצליף 3,4 הכפה. לרוע המזל,התגובות לאידוי אצטון הם מבולבלות על ידי התחושה הרטובה והריח של אצטון. כמו כן, הגירוי הקר שחל במבחן אידוי אצטון יכול להשתנות בהתאם לכמות של אצטון מיושם, וקשה לכמת. לבסוף, יש לי עכברים ללא כל פגע תגובות מינימליות לאצטון בתחילת המחקר, מה שהופך את זה אי אפשר למדוד שיכוך כאבים בהיעדר רגישות יתר בשיטה זו. נוסף assay הקלאסי לתגובות קרות הוא assay קפיצי זנב, שבו זמן האחזור לנסיגה נמדד לאחר הזנב הוא שקוע ב5,6 מים קרים. בעוד התגובות התנהגותיות בassay זה הן חד משמעיות וassay מודד תגובות לטמפרטורה מסוימת, בעלי החיים חייבים להיות מרוסנים במהלך בדיקה, אשר יכולה לשנות את היענות קרה באמצעות מנגנוני מתח מושרה היטב תיארו משכך כאבים 7. כלי נוסף נפוץ הוא מבחן הצלחת הקר, המודד את ההתנהגותתגובות של עכברים אחרי שהם מונחים על צלחת מקורר פלטייה 8-10. בעוד כלי זה מספק מידע על תגובות של בעלי חיים בטמפרטורות מסוימות, יש לו גם נעשה שימוש לא עקבי; קבוצות שונות מדדו סוגים שונים של תגובות הכוללים מספר הקפיצות 8,11, חביון התגובה הראשונה 8,11- 13, ומספר הכפה מרים 11,13,14 עם תוצאות שונות מאוד. Assay הצלחת הקר הוא גם תפוקה נמוכה יחסית כמו שרק חיה אחת יכול להיבדק בכל פעם, וזה דורש מכשיר פלטייה יקר ושביר. מבחן העדפת טמפרטורת 2-הצלחת הוא נגזר נפוץ של מבחן הצלחת הקרה שמודד את הכמות היחסית של זמן שבעלי חיים להוציא על 2 צלחות מחוברות של טמפרטורות שונות 9,15- 17. assay הנפוץ דומה נוסף הוא assay שיפוע התרמית, שבו כמות הזמן שמבלים עכברים באזורי טמפרטורה שוניםהנע בין 5 ° C ו -45 ° C על צלחת מתכת ארוכה נמדד 16. בעוד מבחני אלה מאפשרים השוואה של טמפרטורות, לא ברור אם ההתנהגות מייצגת סלידת טמפרטורה או להעדפת טמפרטורה. לבסוף, assay הצלחת קרה הדינמי נעשה שימוש כדי למדוד כמה עכברים להגיב לשינויים בטמפרטורות הסביבה 18. שיטה זו כוללת הצבת עכברים במכשיר פלטייה RT וramping אותו עד 1 ° C תוך מדידה כמה העכברים לקפוץ או ללקק את כפותיהם בטמפרטורות צלחת שונות. אמנם זה בוחן כיצד עכברים להסתגל לסביבת קירור, הוא אינו מספק דרך לבדוק כמה עכברים להגיב לגירוי קר בהגדרה של טמפרטורת סביבה קרירה. בנוסף, הוא דורש ציוד יקר לביצוע ואינו מספק דרך להסתגל לעכברי ציוד הבדיקה לפני מדידת הרגישות הקרה שלהם. כדי להשלים את מבחני האלה, רו&quot;ח בדיקות acclimaתגובות טד לגירוי קור מוגדר היטב במגוון רחב של תחומי טמפרטורה, או בתהליך של הסתגלות לטמפרטורות סביבה קרה. זה יכול לבדוק עד 14 עכברים בכל פעם עם המנגנון הנוכחי שלנו, עם הפוטנציאל להיות scaled עד בזול לבדיקת תפוקה גבוהה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1209">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Name</td>
			<td style="width:320px;">Company</td>
			<td style="width:353px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:303px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-type thermocouple probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>IT-24p</td>
			<td>Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass plate</td>
			<td>Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4&#39;&#39;, but 3/16&#39;&#39; and 1/8&#39;&#39; are also useful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal Data logger</td>
			<td>Extech</td>
			<td>EA15</td>
			<td>Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&#38;prodid=408)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309657</td>
			<td>The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td>If using Extech logger, any Pcwill work</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum boxes</td>
			<td>Washington University in St. Louis machine shop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>boxes are 3&#39; long, 4.5&#39;&#39; wide, and 3&#39;&#39; tall with a sealed lid.&#160; There is a 1/2&#39;&#39; hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated water circulator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Any water circulator model with a pump will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">305165</td>
			<td>The exact needle size is not important</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hand timer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Any hand timer will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mirror</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Any flat mirror will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and inexpensive method for determining cold sensitivity and adaptation in mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

התגובות התנהגותיות שהושרו מעכברים מתחילים ב 30 מעלות צלזיוס, 23 ° C, 17 ° C, ו- 12 ° C הן (איור 4 א) 20 לשחזור מאוד. על מנת למדוד את הגירוי הקר המופק תחת hindpaw, עכברים מורדמים עם קטמין / xylazine / קוקטייל acepromazine וכפותיהם הובטחו על הזכוכית על גבי תרמי נימה T-הסוג (איור 4...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice at JoVE.com

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

a-simple-inexpensive-method-for-determining-cold-sensitivity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  Washington University in St. Louis. The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Video: A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

רומן Apparatus ואת שיטת חיזוק והתרופות

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

שיטה כללית להערכת דגירה של השתוקקות סוכרוז בחולדות

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Assay זול, Scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב<em&gt; דרוזופילה</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of these afferent neurons are located within the sensory ganglia. Sensory ganglia innervate a specific organ or portion of the body. For instance, the dorsal root ganglia (DRG) are located in the vertebral column and extend processes throughout the body and limbs. The trigeminal ganglia are located in the skull and innervate the face, and upper airways. Vagal afferents of the nodose ganglia extend throughout the gut, heart, and lungs. The nodose neurons control a diverse array of functions such as: respiratory rate, airway irritation, and cough reflexes. Thus, to understand and manipulate their function, it is critical to identify and isolate airway specific neuronal sub-populations. In the mouse, the airways are exposed to a fluorescent tracer dye, Fast Blue, for retrograde tracing of airway-specific nodose neurons. The nodose ganglia are dissociated and fluorescence activated cell (FAC) sorting is used to collect dye positive cells. Next, high quality ribonucleic acid (RNA) is extracted from dye positive cells for next generation sequencing. Using this method airway specific neuronal gene expression is determined.

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

שיטה לכוון ולבודד Airway-innervating עצב סנסורי של עכברים

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...