The authors have no acknowledgements.

1. חיידקים השעיה הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצלחת תרבות מפוספסת, סביבה נקיה מחיידקים לחסן מושבה אחת לתוך בקבוק סטרילי 250 מיליליטר מכיל של תקשורת הצמיחה המתאימה (טבלת 1) 100 מיליליטר בדרך של לולאת inoculating סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוק לתוך חממה רועדת מסלולית בתנאים המתאימים (טבלת 1) במשך 1-2 ימים, בדיקה לצמיחה מעת לעת. קבע את המהירות שייקר עד 140 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מהחיידקים להעביר את ההשעיה החיידקים לתוך צינורות שני 50 מיליליטר סטרילי חרוטי ו צנטריפוגות הצינורות ב 3000 XG במשך 20 דקות ב 23 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend כל גלולה חיידקים עם 15 מיליליטר של מים סטריליים peptone. מערבולת במידת צורך. מערבבים את תרבות חיידקים המושעית לצינור אחד / מיכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל מניית התרבות בשלושה עותקים לסעיף 4 כדי לקבוע את כייל תרבות המניה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניס למקרר לתקופה של עד 2 שבועות ב 477; עד צורך 2 מעלות צלזיוס. Re-כייל התרבות בעת השימוש, ראה שלב 4.8. </li></ol> 2. טסיות מוצרי הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מוצר טסיות סטנדרטי apheresis אדם בבנק דם מוכר. מוצר טסיות הדם חייב לעמוד במפרטי האוסף הבאים: 90-360 מיליליטר נפח וx 0.8 -3.8 10 6 טסיות דם / ריכוז μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהמוצר של טסיות דם שנח על מינימום של 2 שעות לפני עיבוד להפחתת הפתוגן. אחסן את המוצרים ב 22 ± 2 מעלות צלזיוס בחממה טסיות ללא תסיסה לשעה 2 אלה. אחרי שעות להבטיח מוצר טסיות הדם נסער ב 22 ± 2 מעלות צלזיוס בחממה של טסיות דם. השתמש במוצר לתקופה של עד 22 שעות שלאחר איסוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 3 מיליליטר להסיר מדגם 2 מיליליטר למדוד 22C pH של מוצר טסיות הדם. יש להשתמש מנתח גז דם כדי להבטיח את המוצר pH&gt; 6.6. השתמש באותו המדגם כדי למדוד את ריכוז טסיות של מוצר טסיות הדם באמצעות נתח המטולוגיות. להבטיח המוצר עומד .80-3.8 x 10 6 טסיות / דרישת ריכוז אוסף μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואלית להעריך את המערבולת של מוצר טסיות הדם. אם למוצר יש &quot;0&quot; מערבולת המוצר ייפסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את התיק של טסיות דם תחת מקור לבן-אור ישיר ולסחוט את השקית של טסיות דם לזמן קצר. מבחינה ויזואלית לבחון את הדפוס המתערבל של מדגם טסיות הדם. ציון המוצר תוך שימוש בסולם הבא. הערה: 2 - חיובית מערבולת: מסתחרר inhomogeneity הגלוי לאורך כל השקית עם ניגוד חזק. 1 - ביניים מערבולת: inhomogeneity חלק גלוי, אלא רק בכמה מקומות ועם ניגוד עני. 0 - מערבולת שלילית: הומוגניות דלוח שנותרה לפני ואחרי לסחוט את שקית טסיות הדם </li></ol> תהליך 3. אור ריבופלבין וUV: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טראןספיר מוצר טסיות הדם לשקית תאורת אור ריבופלבין וUV ואחסון באמצעות התקן עגינה צינור סטרילי. לאחר ההעברה להסיר את שקית איסוף הריקה יחידת טסיות דם באמצעות אוטם צינורות וזורקים את השקית הריקה כמו פסולת ביולוגית מסוכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כיס 35 מיליליטר של 500 מיקרומטר ריבופלבין פתרון מניות מלעטוף חיצוני מגן האור שלה. מזח סטרילי ערכת ריבופלאבין על קו הכניסה של תיק הטיפול ואחסון. לאפשר את התוכן לנקז לתוך יחידת טסיות הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתלות את תיק שקיק / טיפול ואחסון ריבופלבין להגדיר מנרתיק ריבופלבין ועדינות להביע אוויר שייר מתוך תיק הטיפול ואחסון ולתוך שקית ריבופלבין. להבטיח כמות קטנה של מוצר טסיות בא לידי ביטוי גם בכיס ריבופלאבין לשטוף כל ריבופלאבין שייר למוצר טסיות הדם. אפשר פתרון ריבופלבין וטסיות דם לנקז בחזרה לשקית הטיפול ואחסון ולאחר מכן מהדק את קו הכניסה. הסר את השקית הריקה ריבופלאביןing אוטם צינורות וזורקים את השקית הריקה כמו פסולת ביולוגית מסוכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזח סטרילי קו צינורות &quot;6 עם מחבר מזרק נקבה על קו הכניסה של תיק התאורה ואחסון. צרף חבית מזרק 10 מיליליטר (להסיר את הבוכנה) על מחבר מזרק הנקבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביבה נקיה מחיידקים להוסיף 5 מיליליטר של חיידקי המניה לתוך חבית המזרק באמצעות פיפטה. פתח את המהדק על קו הכניסה ולאפשר לחיידקים כדי לנקז לתוך מוצר טסיות דם. יש לשטוף את חבית המזרק על ידי מתן כמה מוצר טסיות דם לזרום בחזרה לחבית מזרק 10 מיליליטר. הסר את חבית מזרק 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מהחיידקים לצרף מזרק 30 מ&quot;ל ולשטוף את נמל הכניסה מינימאלית של שתי פעמים כדי להבטיח את חיידקי המניות מעורבות למוצר טסיות הדם. לאחר שהמוצר הוא גם מעורב, להשתמש במזרק 5-10 מיליליטר נקי ולהסיר מדגם טרום טיפול 2 מיליליטר. באמצעות מזרק חדש להבטיח כל אוויר הציג מהצעד החיסון או דגימת צעד מוסר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל המדגם טרום טיפול לסעיף 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קו הכניסה משקית הטיפול ואחסון ולשקול את המוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המוצר אל נורת ובצע את הפקודות על המסך כדי להתחיל טיפול טסיות סטנדרטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן בזיהוי מפעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure והר השקית לגליל דיו הפנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את קוד זיהוי לדוגמא לפנס או באמצעות הקורא ברקוד או לוח המקשים להזנה הידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג מוצר סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את מהדק קוורץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר התאורה באופן אוטומטי לספק 6.24 / מיליליטר J של אנרגיה. זמן הטיפול האופייני לוקח 5-10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מזח סטרילי טיפול קו 6 &quot;צינורות עם מחבר מזרק נקבה על קו הנורה מדגם של טיפול ושקית אחסון. ודא שהמוצר גם מעורב ולאחר מכן לצרף מזרק 5 מ&quot;ל ולהסיר מדגם לאחר טיפול 2 מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל לאחר הטיפול סםPLE לסעיף 4. </li></ol></li></ol> 4. בקטריאלי כייל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמוד את כייל של הדגימות לפני טיפול ואחרי טיפול, ולהכין את המספר המתאים של 5 מיליליטר צינורות דילול צורך לבצע דילול סדרתי נקודת סיום של כל דגימה. סביבה נקיה מחיידקים למלא את הצינורות הנדרשים עם 1.8 מיליליטר של מים peptone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל כל דגימה באמצעות תכנית דילול סדרתי של פי 10. הסביבה נקיה מחיידקים להעביר 0.2 מיליליטר מהמדגם חי לצינור הראשון דילול (10 -1). מערבולת צינור זה דילול והעברה 0.2 מיליליטר לצינור הדילול הבא. המשך דילול סדרתי דרך המספר הנדרש של דילולים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הסביבה נקיה מחיידקים של כל דילול 100 μl להיות מצופה לצלחת מתאימה אגר (טבלה 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מפזר תא סטרילי, שווה להפיץ את המדגם על כל צלחת אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דגירה הצלחות בתנאים המתאימים ( <strong&gt; לוח 1) במשך 1-2 ימי בדיקה לצמיחה מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן צלחות עם 30-300 מושבות. צלחות המכילות יותר מ -300 מושבות נחשבות רבה מספור (TNTC). צלחות המכילות פחות מ -30 מושבות נחשבות מתחת לגבול כימות (LOQ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את כייל של כל דגימת בדיקה ולהקליט את התוצאות כCFU / ml. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב CFU / מיליליטר: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין מושבות על צלחת הדילול הנמוכה ביותר, להשתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את הגבול של זיהוי (לוד): <img alt="משוואה 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> ו <img alt="משוואה 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> איפה: N = המספר הנמוך ביותר של חלקיקים (CFU) בעמ &#39;roduct שניתן לאתרם בביטחון. P = הסתברות שמיקרואורגניזם יהיה מבלי שיבחינו; לביטחון של 95% מגילוי חיידק, P = .05. V = הנפח כולל של מוצר במ&quot;ל נ &#39;רמת דילול x המצופה (מיליליטר) = נפח של צלחת </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבקרה שלילית, צלחת 0.5 מיליליטר של המים peptone המשמש לדילולי סדרתי על כל אחד משתי צלחות אגר. השתמש באותו סוג הצלחת כדגימות להיבדק. הפוך דגירה הצלחת בתנאים המתאימים ל1-2 ימי בדיקה לצמיחה מעת לעת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצמיחה הוא ציין שתי צלחת אגר, בקבוק המים peptone שימוש חייב להיות מושלך; תוצאות המחקר גם ביטלו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבקרה חיובית, מחדש כייל מניית התרבות של חיידקים שהיה בשימוש. הפוך דגירה הצלחות בתנאים המתאימים ל1-2 ימי בדיקה לצמיחה מעת לעת. כייל יהיה ± 1.0 להיכנס CFU / מיליליטר של הרשומהכייל מניית אד (ראה סעיף 1.5) למחקר כדי להיחשב חוקי. </li></ol>

<ol>
	<li>Brecher, M. E., Hay, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contamination+of+blood+components.">Bacterial contamination of blood components.</a> Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).</li><li>Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+bacteria+in+inoculated+platelets:+implications+for+bacteria+detection+and+the+extension+of+platelet+storage.">Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage.</a> Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).</li><li>Cardo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+inactivation+of+Leishmania+donovani+infantum+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).</li><li>Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+inactivation+of+Trypanosoma+cruzi+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).</li><li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+viral+risks+of+blood+and+blood+products.">Current viral risks of blood and blood products.</a> Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).</li><li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contamination+and+transfusion+safety:+experience+in+the+United+States.">Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States.</a> Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).</li><li>Dumont, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+single-donor+apheresis+platelets+for+bacterial+contamination:+the+PASSPORT+study+results.">Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results.</a> Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).</li><li>Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laboratory+comparison+of+pathogen+reduction+technology+treatment+and+culture+of+platelet+products+for+addressing+bacterial+contamination+concerns.">A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns.</a> Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).</li><li>Greco-Stewart, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+marcescens+strains+implicated+in+adverse+transfusion+reactions+form+biofilms+in+platelet+concentrates+and+demonstrate+reduced+detection+by+automated+culture.">Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture.</a> Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).</li><li>Keil, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Plasmodium+spp.+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).</li><li>Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+associated+with+transfusion+of+cellular+blood+components+in+Canada.">Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada.</a> Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).</li><li>Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+years'+experience+of+using+the+BacT/ALERT+system+to+screen+all+platelet+concentrates,+and+additional+testing+of+outdated+platelet+concentrates+to+estimate+the+frequency+of+false-negative+results.">Six years' experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results.</a> Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).</li><li>Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+Biological+Mechanisms+of+Pathogen+Reduction+Technologies.">Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies.</a> Photochem. Photobiol. , (2014).</li><li>Murphy, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+platelet+concentrates+for+bacterial+contamination:+low+numbers+of+bacteria+and+slow+growth+in+contaminated+units+mandate+an+alternative+approach+to+product+safety.">Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety.</a> Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).</li><li>Brien, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+incidence+and+residual+risk+of+HIV,+HBV+and+HCV+at+Canadian+Blood+Services.">Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services.</a> Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).</li><li>Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+platelets+for+bacterial+contamination+at+the+Welsh+Blood+Service.">Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service.</a> Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).</li><li>Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+universal+point-of-issue+assay+for+bacterial+detection+in+buffy+coat+platelet+components.">Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components.</a> Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).</li><li>Reddy, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+of+a+novel+riboflavin-based+technology+for+pathogen+reduction+and+white+blood+cell+inactivation.">Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation.</a> Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).</li><li>Ruane, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+inactivation+of+selected+viruses+and+bacteria+in+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+light.">Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light.</a> Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).</li><li>Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system+against+Babesia+microti+in+apheresis+platelets+and+plasma.">Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma.</a> Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).</li><li>Vanlandingham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+inactivation+of+chikungunya+virus+in+plasma+and+platelets+using+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system.">Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system.</a> Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).</li><li>Walther-Wenke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+bacterial+contamination+of+blood+components+in+Germany:+effect+of+contamination+reduction+measures.">Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures.</a> Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).</li></ol>

כל המחברים של מאמר זה מועסקים כיום על ידי Terumo BCT, מפתחת ויצרנית של מערכת Mirasol PRT. עמלות פרסום למאמר וידאו זה כבר שולם על ידי BCT Terumo.

הקרנת חיידקים הפכה מנהג נפוץ במוסדות בנקאיים דם ולמקומות רבים היא משמשת כשיטת העיקרית למניעת עירוי של טסיות דם מזוהמים bacterially. למרות שבדרך כלל הקרנת חיידקי מודעות חרם רוב חיידקים שליליים גרם גדלו במהירות כמו ס marcescens, א &#39; coli וא cloacae, זה נאבק כדי לזהות חיידקים חיוביים גרם גדלו איטי כמו ס aureus, spp סטרפטוקוקוס. וס epidermidis 8. למרבה הצער, חיידקים החיוביים אלה שלוש גרם הם מעורבים בלמעלה מ 50% מכלל היחידות של טסיות דם המזוהמים והעירוי של מוצרי טסיות דם המכילים שלושת אורגניזמים אלה הובילו לתמותת חולה 1. הקרנת חיידקים מסתמכת על כייל החיידקים במוצר טסיות דם להיות גבוה מספיק מספיק כדי שאורגניזם אחד לפחות הוא הכיל בתוך מדגם ההקרנה 4-8 מיליליטר הטיפוסי. אם כייל החיידקים הוא לא מספיק גבוה לחיידק להיות בשבי 4-8 מיליליטר נפח הדגימה, היחידה מסומנת באופן שגוי כשלילית והוא שוחרר לעירוי. גישה חלופית להקרנת חיידקים יכולה להיות להעסיק תהליך יזום שיכול להתבצע על כל היחידות של טסיות דם וזה יכול להפוך את אורגניזמים מזהמים כמו שאינו פונקציונלי. במחקר זה, titers הגבוה של חיידקים נוספו בכוונה ליחידות של טסיות דם על מנת לבחון את יכולת ההפחתה הכוללת של תהליך הפחתת הפתוגן אור ריבופלבין וUV. למרות עומסי חיידקים שנבדקו במחקר זה עולה בהרבה על אלה בדרך כלל נמצאים במוצרי דם בעת התרומה, מחקר זה מסייע להוכיח שתהליך ריבופלבין ואור UV יכול להפחית באופן משמעותי את כייל של חיידקי קיימא ביחידת טסיות דם מזוהם ב 2.6-5.4 יומן (הפחתת 99.7-99.9996% מזיהום חיידקים) (איור 2). כדי להשיג Accuraערך הפחתת יומן te, זה קריטי, כי יש לי המפעיל טכניקת aseptic טובה יחד עם כישורי pipetting מדויקים בעת ביצוע צעדי כייל חיידקים. pipetting מדויק בעת ביצוע דילולים סדרתי יכול להוביל להצטברות של שגיאות, כך מדידת כייל לא מדויקת. הנתונים שנאספו במחקר זה תומך בעבודה קודמת עם ריבופלבין ואור UV, שקרא תיגר על המערכת נגד רמה נמוכה, בקטרמיה הרלוונטית קליני (&lt;20 CFU / יחידה). המחקר קודם שנועד לחקות אירוע זיהום קליני בפועל והתוצאות הראו ריבופלבין ואור UV היה יעיל במניעת התפתחות חיידקים על פני תקופת אחסון טסיות 7 הימים. דוגמנות מבוססת על נתונים מהמחקר הקודם מצביעה על כך שהערכות הסיכון הנוכחיות של זיהום חיידקים של מוצרי טסיות דם יכולות להיות מופחתות על ידי ככל 98% מהרמות הנוכחיות 8. תהליך אור ריבופלבין וUV משווה לטובה למסך חיידקיםING, שרק הוכיח יעילות של 66% לזיהוי זיהום חיידקים ביחידות של טסיות דם כאשר קראו תיגר עם עומס חיידקים רלוונטי קליני 8. כמו בכל הטכנולוגיות, טיפול PRT של מוצרי טסיות דם למניעת סיבוכים הקשורים ליחידות של טסיות דם מזוהמות bacterially יש מגבלות. מערכות PRT אינן יעילות נגד חיידקי נבגים ולא להשבית רעלן פנימי, ובכך גם אם מערכת PRT יכול להשבית titers הגבוה של חיידקים שליליים גרם רעלן פנימי שנותר עדיין יכול לגרום להלם ספטי בנמען. PRT מבוצע הטוב ביותר מוקדם במהלך אחסון לפני החיידקים יכולים להפיץ לtiters הגבוה. לסיכום, כפי שהודגם על ידי השילוב של שני המחקרים הללו, תהליך ריבופלבין ואור UV הוא יעיל בהפחתת עומסי חיידקים של שני אורגניזמים החיוביים גרם שלילי וגרם ועשויה להציע חלופה להקרנה בקטריאלי. treatin באופן שגרתימוצרי טסיות דם גרם עם אור ריבופלבין וUV יש גם יתרון הנוסף של הפחתת שידור הפוטנציאל של סוכני דם נישא אחרים כמו וירוסים וטפילים.

עירוי של טסיות דם, פלזמה, תאי דם אדום ארוז ומוצרי דם כל לשחק תפקיד מרכזי ברפואה מודרנית ויכולים לשמש לטיפול במצבים רפואיים שונים, להחליף נוזלים חיוניים וסופו של דבר להציל חיים. טסיות דם הם מוצר סלולארי המבודדים או מכל דם ונקווה למנת transfusable או נאספים בתהליך של apheresis טסיות דם. תפקידו העיקרי של טסיות דם בגוף הוא כדי לעצור את הדימום באתרי פצע וכדי לסייע לשמור על עצירת דימום. חולים הסובלים מספירה נמוכה של טסיות תא (תרומבוציטופניה) רגישים לאירועי דימום ספונטניים ועירוי עם טסיות להביא תא טסיות דמם לספור חזרה לטווח נורמלי. טסיות דם שנאסף מאוחסנות לתקופה מקסימלית של 5-7 ימים ומאוחסנים בגיל 22 ± 2 מעלות צלזיוס בזמן שתחת תסיסה מתמדת. למרות הצלת החיים מאפיינים של עירויי טסיות דם נותרים קל סיכון למקבלי עירוי בשל שיתוףntamination של מוצרים אלה על ידי טפילים, חיידקים ווירוסים 11. ביצוע בדיקות חומצת גרעין נגיפיות (NAT) ירד הסיכון להעברה נגיפית של סוכני דם נישא עיקריים, כגון וירוס הצהבת מסוג C (HCV), נגיף הפטיטיס B. (HBV) ונגיף חיסוני חוסר אנושי (HIV) באופן משמעותי 5. פרסום האחרון משירותי הדם הקנדיים מעריך סיכון השיורי לסוכנים אלה להיות 1 ל8 מ&#39;תרומות ל- HIV, 1 ל-6.7 מ&#39;תרומות לHCV ו1 ל-1.7 מ&#39;תרומות עבור 15 HBV. למרות שבדרך כלל חיידקים לגייס פחות תשומת לב בציבור הרחב, בתדירות של זיהום חיידקים במוצרי טסיות דם כבר מוערכת כגבוה כמו 1: 1,000 7 וכי מיליוני מוצרי טסיות דם הם בעירוי בכל שנה נמענים רבים נחשפים לסיבוכים שעלולים להיות סכנת חיים כמו אלח דם 6. מחקר מצביע על כך שעומס החיידקים בזמןהזיהום הוא נמוך, &lt;100 יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מוצר 2,16, לעומת זאת אחסון הסביבה וטמפרטורת חדר העשיר המזינה מאפשר זיהום חיידקים להתרבות לtiters הגבוה בצורה מסוכנת לפני העירוי. נכון לעכשיו, את השיטות שאושרו רק הזמינות כדי למנוע מוצרים מזוהמים bacterially מלהגיע נמען טסיות דם היא באמצעות השימוש במערכות מבוססת תרבות ונקודת בדיקת טיפול מהירה. בקצרה, למערכות תרבות המבוססת מוצרי טסיות דם מאוחסנים על תועמלן ב 22 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות כדי לאפשר לחיידקים להתרבות במוצר, עליו מדגם 4-8 מיליליטר יוסר ממוצר טסיות הדם ומחוסן לתוך בקבוק המכיל תקשורת תזונתית. הבקבוק מושם לתוך מכשיר העוקב אחר הבקבוק להתפתחות חיידקים. אם המכשיר מזהה התפתחות חיידקים בבקבוק זה מסומן ויחידת טסיות הדם המתאימה נמחקת. בעוד תהליך זה הוא מוצלח למדי באיתור Gro המהיראורגניזמים אגף, רבים של המינים גדלו איטיים לא גדלים למספיק כייל גבוה כדי להתגלות, ובכך ליצור את הפוטנציאל ליחידות שווא שלילי להשתחרר לעירוי 7,12,14,16,22. בניגוד למערכות גילוי תרבות המבוססת, נקודת בדיקת טיפול מהירה מבוצעת בדרך כלל מאוחר יותר בתקופת אחסון טסיות דם כאשר עומס החיידקים גדל באופן משמעותי. Titers גבוה יותר נדרש מאז נקודת בדיקות טיפול היא פחות רגישה ממערכות התרבות מבוססת, ורק באופן מהימן לזהות חיידקים ברגע שהם מגיעים לכייל ≥1 x 10 3 CFU / מיליליטר 17. עם זאת בדיקות כאלה יכולים לספק תוצאות תוך שעה 1 של דגימה. השתנות בביצוע בדיקות אלה הובילו לשחרורו של מוצר שלילי כוזב, שגרמו לתגובה ספיגה קטלנית בנמען 9. דרך חלופית כדי להילחם בבעיה של זיהום חיידקים של מוצרי טסיות דם היא באמצעות השימוש השגרתי של proc הפחתת הפתוגןESS שיכול להשבית חיידקים מזהמים במקום לנסות לזהות אותם. באמצעות ריבופלאבין כהפוטוסנסיטייזר, בשילוב עם אור UV, הוכח להפחית את ההדבקה של מגוון רחב של מזהמים נישאים דם פתוגניים, כולל חיידקים 3,4,8,10,19-21 .the שימוש של ריבופלאבין וUV אור להפחתת הפתוגן אינו רעיל ואינו mutagenic, ורכיבים שטופל אור ריבופלבין וUV הוכחו כבטוח למקבלי עירוי, כמו גם לאלה טיפול במוצרי דם 18. בקצרה, מולקולות ריבופלאבין יכולות לקשר עם חומצות הגרעין (DNA ו- RNA) של חיידקים, טפילים, וירוסים וכל תא גרעיני (למשל תאי דם לבנים). חשיפה לאור UV מפעילה ריבופלאבין, גרימת שינוי כימי לקבוצות פונקציונליות של חומצות גרעין (בעיקר בסיסי גואנין), ובכך למנוע שכפול ו / או שעתוק של חומצות גרעין ועוזב את האורגניזם מומת 13. תאי Anucleated כמו צלחתמאפשר לי ותאי דם אדומים אינם מושפעים מכימית ריבופלאבין בשל חוסר חומצות גרעין. עבודה קודמת עם טכנולוגיית אור ריבופלבין וUV מוערכת קבוצה נבחרת של חיידקים באמצעות עיצוב ניסיוני שנועד לחקות מוצר טסיות דם מזוהם עם רלוונטי קליני עומס חיידקים (&lt;20 CFU / מוצר) 8. מטרת המחקר הייתה להעריך את תהליך אור ריבופלבין וUV נגד זיהום חיידקים גבוה כייל (&gt; 1.0 x 10 5 CFU / ml) במוצרים של טסיות דם שטופלו בפלזמה כדי למדוד את יכולת הפחתת חיידקים הכוללת של המערכת. בהתבסס על נתונים שנאספו ממחקרי hemovigilance 1, פנל של אורגניזמים חיוביים שליליים וגרמו גרם נפוץ המתרחשים נבחר להערכה במחקר זה וכלל את המינים הבאים: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, סטרפטוקוקוס mitis, pyogenes סטרפטוקוקוס, marcescens Serratia, Yersinia enterocolitica ,neotomae Brucella, cereus Bacillus (טופס וגטטיבי), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa וKlebsiella pneumoniae. כל היצורים, למעט ב cereus, התקבל מATCC ועדיפות הונחה על קבלת זני חיידקים שזוהו כמבודד ממרכיבי דם. ב cereus נבדק במחקר זה הוא זן קליני המבודדים פנימי ממוצר טסיות דם מזוהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

זיהום של יחידות טסיות דם על ידי חיידקים כבר הודה עוד סיכון עירוי משמעותי בשל תנאי האחסון לאחר התרומה שלהם. מוצרים מאוחסנים באופן שיגרתי על 22 מעלות צלזיוס בייקר התססה, מצב שיכול לקדם את התפתחות חיידקים. למרות שהמספר הכולל של חיידקים האמינו להיות הציג למוצר טסיות דם הוא נמוך ביותר, חיידקים אלה יכולים להתרבות לכייל גבוה מאוד לפני העירוי, שעלול לגרום בתופעות לוואי חמורות. מטרת המחקר הייתה להעריך תהליך הפחתת הפתוגן ריבופלאבין מבוסס נגד פנל של חיידקים שזוהו כמזהמים נפוצים של מוצרי טסיות דם. לוח זה כולל אורגניזמים הבאים: ס epidermidis, S. aureus, mitis ס, pyogenes ס, marcescens ס, י &#39;enterocolitica, ב neotomae, cereus ב&#39;, E. coli, פ aeruginosa וק pneumoniae. כל יחידת טסיות דם הייתה מחוסנת עם עומס חיידקים גבוה ודגימות הוסרו בoth לפני ואחרי הטיפול. מושבה להרכיב assay, באמצעות תכנית דילול נקודת סיום, שימשה כדי לקבוע titers חיידקי הטיפול מראש ולאחר טיפול. הפחתת יומן הייתה מחושבת על ידי הפחתת כייל לאחר הטיפול מכייל הטיפול מראש. ירידות היומן הבאות נצפו: ס יומן epidermidis 4.7 (99.998%), יומן S. aureus 4.8 (99.998%), ס &#39;mitis 3.7 יומן (99.98%), יומן ס pyogenes 2.6 (99.7%), יומן ס marcescens 4.0 (99.99%), י&#39; יומן enterocolitica 3.3 (99.95%), ב &#39;neotomae 5.4 יומן (99.9996%), ב&#39; cereus 2.6 יומן (99.7%), יומן E. coli ≥5.4 (99.9996%), יומן 4.7 פ aeruginosa (99.998%) ו- K . יומן pneumoniae 2.8 (99.8%). התוצאות ממחקר זה מציעות התהליך יכול לעזור להוריד את הסיכון לאירועי עירוי לוואי חמורים הקשורות לזיהום חיידקים.

ההפחתה של עשרה מיני חיידקים שונים הוערכה באמצעות תהליך PRT מבוסס אור ריבופלבין וUV. סוכנים אלה מייצגים חלק מהמזהמים הנפוצים יותר של מוצרי טסיות דם וכוללים חמש גרם חיובי ושישה אורגניזמים שליליים גרם. לפחות שישה מוצרי טסיות דם הוערכו לאורגניזם וכל מוצר היה מחוסן עם מספיק חיידקים להניב&gt; 1.0 10 5 CFU / כייל סופי מיליליטר x של חיידקים במוצר של טסיות הדם. לפני טיפול מדגם הוסר כדי לקבוע את כייל הטיפול מראש, לאחר שטופל במוצר של טסיות דם מייד עם ריבופלבין ותהליך UV. בעקבות טיפול של מוצרי טסיות דם הפחתת היומן הבא נצפו: ס יומן epidermidis 4.7 (99.998%), יומן S. aureus 4.8 (99.998%), ס &#39;mitis 3.7 יומן (99.98%), יומן ס pyogenes 2.6 (99.7%), יומן ס marcescens 4.0 (99.99%), י&#39; יומן enterocolitica 3.3 (99.95%), ב &#39;יומן neotomae 5.4 (99.9996%), יומן ב cereus 2.6 (99.7%), יומן E. coli ≥ 5.4 (99.9996%), P. יומן 4.7 aeruginosa (99.998%) וק &#39;יומן pneumoniae 2.8 (99.8%) (איור 2). כל היחידות פגשו את מפרט המערכת כאמור לעיל לריבופלבין ותהליך UV. בדיקות הפחתה נוספות בוצעו עם ס &#39; pyogenes באמצעות טסיות נגזרות מעיל באפי. לא נצפה הבדל משמעותי בהפחתה של ס pyogenes בטסיות נגזרות מעיל באפי לעומת טסיות apheresis (מידע לא מוצג). <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> טבלה 1: תנאי גידול למיני חיידקים הוערכו באמצעות ריבופלבין ואור UV. פנל של שני חיידקים החיוביים גרם שלילי וגרמתי שהוכחו לזהם מוצרי טסיות דם, שנבחרו למחקר זה. תנאי הגידול (סוג טמפרטורה ותקשורת) המשמשים להפצה וTiter אורגניזמים מוצגים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> איור 1: תהליך הפחתת הפתוגן אור ריבופלבין וUV. ריבופלבין פורקה ב מלוח 0.9% בריכוז נומינלי של 500 מיקרומטר. הפתרון היה סטרילי קשר ומנוקז לכל מוצר טסיות דם. חיידקים נוספו הסביבה נקיה מחיידקים לכל יחידת טסיות דם ולאחר מכן טופלו ב6.2 / מיליליטר J אנרגיית UV (כ 6-10 דקות). בזה במבחנה ללמוד את יחידת טסיות הדם לאחר הטיפול תדגם כדי לקבוע את כייל החיידקים הסופי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> איור 2: הפחתה של מיני חיידקים שונים כאשר טופל בריבופלבין והאור UV ריבופלבין ואור UV שימש להקטנת עומסי חיידקים מזהמים חיידקים נפוצים של מוצרי טסיות דם.. יומן 10 הפחתת ההבדלבין כייל טיפול מראש הממוצע וכייל לאחר הטיפול הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination at JoVE.com

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

טיפול במוצרי טסיות דם עם ריבופלבין ואור UV: יעילות גבוהה נגד כייל קטריאלי זיהום

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

treatment-platelet-products-with-riboflavin-uv-light-effectiveness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Views.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Video: Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types of cells. Because of safety concerns associated with these HIV-1 derived vectors, producing large quantities of LVs is challenging. In this paper, we report a method for producing high titers of self-inactivating LVs. We retrovirally transduce the tet-off stable producer cell line GPR to generate a cell line, GPRS, which can express all the viral components, including a dendritic cell-specific glycoprotein, SVGmu. Then, we use concatemeric DNA transfection to transfect the LV transfer plasmid encoding a reporter gene GFP in combination with a selectable marker. Several of the resulting clones can produce LV at a titer 10-fold greater than what we achieve with transient transfection. Plus, these viruses efficiently transduce dendritic cells in vitro and generate a strong T cell immune response to our reporter antigen. This method may be a good option for producing strong LV-based vaccines for clinical studies of cancer or infectious diseases.

Here, we use retroviral transduction and concatemeric transfection to create a cell line that can express the components of a lentiviral vector (LV) in the absence of tetracycline. This LV encodes GFP and is pseudotyped with a glycoprotein, SVGmu, which is specific for a receptor on dendritic cells.

שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

מדידה של שיעורי הטעויות הספציפיים של פטרת מערכות כתבת

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...