Ce travail a été soutenu par le Labex MemoLife et par l&#39;ARSEP (Fondation pour l&#39;aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

1. Les solutions et matériaux <ol><li> Préparer des solutions de navires d&#39;isolement: B1, ajouter 1,5 ml de HEPES 1M à 150 ml de HBSS; B2, ajouter 3,6 g de dextrane à 20 ml de B1; B3, ajouter 1 g de BSA pour 100 ml de B1. </li><li> Modifier le porte-filtre en coupant le fond de la partie supérieure de vissage. </li><li> Préparer des solutions de immunocoloration: solution de fixation, 4% de paraformaldehyde dans PBS pH 7,4; Perméabilisation / solution de blocage, diluer du sérum de chèvre à 5% de Triton X100 et à 0,25% dans du PBS pH 7,4. Remarque: La fixation dépend du type d&#39;anticorps primaires utilisés. </li></ol> 2. Dissection Nota: Des conditions stériles ne sont pas nécessaires, à moins que les navires sont utilisés à des fins de culture de cellules. <ol><li> Préparer un bêcher de 150 ml avec 20 ml de B1. Garder sur la glace et couvrir avec du parafilm pour éviter la contamination de l&#39;air. </li><li> Profondément anesthésier la souris sous une capuche avec une petite serviette de papier trempé dans 1 ml d&#39;isoflurane pur qui est int ajoutéso la cage. L&#39;anesthésie est vérifiée par l&#39;absence de réaction à un pincement de l&#39;orteil. Tuez la souris par dislocation cervicale. Remarque: Ces étapes sont réalisées en conformité avec les réglementations nationales et institutionnelles. </li><li> Facultatif: Procédez perfusion intracardiaque avec 20 ml de PBS 1x pour éliminer le contenu de sang 24. </li><li> Section de la peau avec un scalpel à partir du cou au nez et retirez. Retirer tous les poils contaminantes avec PBS 1x. </li><li> Pour ouvrir le crâne, d&#39;abord insérer des ciseaux en avant vers le bulbe olfactif, et ouvrir les ciseaux pour rompre le crâne en deux parties. </li><li> Retirez délicatement le cerveau à l&#39;aide d&#39;une spatule de cerveau. Disséquer les plexus choroïde des ventricules latéraux comme ils contaminer le vaisseau sanguin préparation 38. NOTE: En option: La préparation finale contiendra parenchyme et les méninges navires. Dans le cas contraire on le souhaite, des méninges peuvent être décollée suivant le mode opératoire décrit par 38. </li><li> Transfert le cerveau dans le bécher contenant une solution de B1 sur la glace. Jusqu&#39;à 8 cerveaux peuvent être traités ensemble. </li></ol> 3. Homogénéisation des tissus du cerveau <ol><li> L&#39;utilisation de deux scalpels, manuellement et battre vigoureusement le cerveau dans la solution de B1 par la suite l&#39;obtention de petits morceaux d&#39;environ 2 mm. </li><li> Homogénéiser la préparation avec un homogénéisateur Dounce automatisée, effectuant 20 coups à 400 tpm. Assurez-vous que le tube de verre est maintenue dans de la glace et que la partie supérieure de la douncer est en solution lors du déplacement de haut en bas, de manière à éviter la formation de poches d&#39;air. Si plusieurs échantillons sont préparés, lavez la douncer avec de l&#39;eau ionisée entre chaque homogénéisation. </li></ol> Purification 4. navire <ol><li> Transfert de l&#39;homogénat dans un tube en plastique de 50 ml et procéder à la centrifugation à 2000 g pendant 10 min à 4 ° C. Une grande interface blanche (la plupart du temps de la myéline) se forme sur le dessus de la pastille de la cuve (rouge si aucune perfusion a été effectuée). </li><li> Jeter le surnageant. Le culot de la cuve et l&#39;interface blanc resteront attachés ensemble. Ajouter 20 ml de solution de B2 glacée et agiter le tube manuellement et vigoureusement pendant 1 min. </li><li> Passez à la deuxième centrifugation à 4400 g pendant 15 min à 4 ° C. La myéline va maintenant former une couche blanche dense à la surface du surnageant. </li><li> Détacher soigneusement la couche de myéline des parois du tube en tenant le tube et le faisant tourner lentement pour permettre au surnageant de passer le long des parois. Jeter la myéline avec le surnageant. Le culot contenant les vaisseaux reste attaché au fond du tube. </li><li> Tamponnez la paroi intérieure du tube avec un papier absorbant enroulé autour d&#39;un 5 ml en plastique pipette et retirer tous les fluides résiduels, évitez de toucher le culot de navire. Garder le tube à l&#39;envers sur un papier absorbant pour drainer tout liquide restant. </li><li> Suspendre le culot dans 1 ml de solution de B3 glacée par pipetage de haut en bas avec des pointes à faible liaison, keeping le tube sur la glace, puis ajouter encore 5 ml de solution de B3. Assurez-vous que les navires sont dispersés autant que possible et ne forment pas d&#39;agrégats. </li></ol> 5. Filtration <ol><li> Préparer un bêcher sur de la glace avec 30 ml d&#39;une solution d&#39;B3 glacée. Couvrir avec du parafilm pour éviter la contamination de l&#39;air. </li><li> Placer un filtre à mailles de 20 um sur un porte-filtre modifié sur le sommet d&#39;un flacon de Becker et équilibrer en appliquant 10 ml de solution d&#39;B3 glacée. </li><li> Verser la préparation de la cuve du filtre et rincer les récipients avec 40 ml de solution d&#39;B3 glacée. </li><li> Récupérer le filtre à l&#39;aide des pinces propres et plonger immédiatement dans le bêcher contenant la solution de B3. Détachez les navires de la filtre en le secouant doucement. </li><li> Verser le contenu du bêcher dans un tube en plastique de 50 ml et on centrifuge à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Note: Alternativement, la suspension par les vaisseaux du cerveau de l&#39;étape 4.6 peut être filtré sur un filtre de 100 um mesh.Dans ce cas, les grands navires sont préférentiellement retenues sur le filtre tandis que le flux continu contient microvaisseaux (principalement capillaires), qui sont ensuite filtrés sur un filtre de 20 um mesh comme ci-dessus. </li><li> Reprendre le culot de microvaisseaux dans 1 ml de solution de B3 glacée et le transférer à la pipette dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Centrifuger à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C. </li></ol> 6. Fixation, Perméabilisation et le blocage <ol><li> Les navires de transfert par pipetage dans 0,2 ml tubes PCR contenant du PBS en utilisant un 1,0 ml faible pointe de liaison. Veillez à ne pas toucher les navires, car ils peuvent adhérer à la partie extérieure de la pointe. Effectuez toutes les étapes suivantes sous un microscope binoculaire. </li><li> Pour chacune des modifications moyennes suivantes, laisser les tubes sur la glace jusqu&#39;à ce que les navires ont atteint le fond, et la pipette sur la plupart des liquides en utilisant les embouts de pipettes gel chargement longs et chose. </li><li> Retirer la plupart des PBS et ajouter 200 ul de solution de fixation.Suspendre les navires en agitant doucement et incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Introduire à la pipette sur la solution de fixateur et le remplacer avec 200 pi de PBS 1x (premier lavage), incuber pendant 5 min à température ambiante et répétez cette étape 3 fois. Chaque fois, vérifier que les navires ont correctement coulé au fond des tubes et pipettes sur PBS 1x, assurant que les navires ne sont pas touchés. </li><li> Après le dernier lavage, remplacer 1x PBS par le / la solution de blocage de perméabilisation et incuber 1 heure à température ambiante, la remise en suspension des vaisseaux en secouant délicatement de temps en temps. </li></ol> 7. Immunocoloration <ol><li> Remplacer la solution de perméabilisation / blocage avec le mélange d&#39;anticorps primaires (voir les références des anticorps utilisés ici et dilutions dans les matériaux modèle de tableau) dilué dans le / la solution de blocage de perméabilisation, et incuber à 4 ° CO / N. </li><li> Après 3 lavages en PBS à la température ambiante, incuber les vaisseaux avec le mélange d&#39;anticorps secondaire dilué dans du PBS pendant 2 heuresà la température ambiante. </li><li> Remarque: nous vous recommandons vivement d&#39;effectuer une coloration nucléaire avec Hoechst (1: 2000) ou DAPI (1: 2000) afin de distinguer les navires de contaminants possible poils ou de poussières sous le microscope. </li><li> Après 3 lavages dans du PBS, remettre en suspension les récipients dans 50 ul de PBS. </li></ol> 8. Montage et Observation <ol><li> Préparer une pointe avec un capillaire de verre siliconé: couper une pointe de pipette P200 aide d&#39;un scalpel et d&#39;ajuster le capillaire à l&#39;intérieur. Le volume approximatif du capillaire est de 40 ul. </li><li> Transférer les navires sur une lame de verre à l&#39;aide du capillaire de verre siliconé et retirer délicatement le liquide avec un morceau de papier absorbant. </li><li> Appliquer une seule goutte de milieu de montage sur les navires et maintenez une lamelle à 45º permettant la baisse de répandre le long du bord de la barbotine. Laissez aller au large de la lamelle et laisser moyen de se propager lentement. Laissez sécher O / N à la température ambiante à l&#39;abri de la lumière. Les navires peuvent être observées sous un Déessent microscope confocal. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La barrière hémato-encéphalique régule le passage de substances physiologiques dans et hors du système nerveux central et le protège contre des substances potentiellement nocives présentes dans le sang. Elle intervient dans plusieurs pathologies du système nerveux central, incluant les maladies neurodégénératives 2 et 28 tumeurs du cerveau. Le très faible perméabilité de la BHE entrave également le passage d&#39;agents thérapeutiques ciblant les cellules neuronales et le développement de mét...

Le bon fonctionnement du système nerveux central (SNC) nécessite un environnement extracellulaire très réglementé, et ses besoins métaboliques sont énormes par rapport à d&#39;autres organes 1. Le CNS est aussi extrêmement sensibles à un large éventail de produits chimiques, généralement inoffensifs pour les organes périphériques, mais à elle, neurotoxique. Pour assurer un fonctionnement correct, la majeure partie du système vasculaire du SNC »forme une barrière endothéliale; la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui commande l&#39;écoulement des molécules et des ions ainsi que le passage des cellules immunitaires entre le sang et le cerveau, ce qui maintient approprié homéostasie 2, mais en limitant également l&#39;entrée de médicaments thérapeutiques, les traitements entravant ainsi de troubles neurologiques 3. Au niveau cellulaire, le BBB est principalement soutenue par de vastes jonctions serrées entre les cellules endothéliales, l&#39;expression polarisée des transporteurs d&#39;efflux et un taux de transcytose très faible 4. Propriétés et fonctions de la BHE sont essentiellement induites par NEighboring 4 cellules. En particulier, les péricytes jouent un rôle important dans l&#39;induction et le maintien de la BHE 5,6. Être cellules contractiles, péricytes régulent également le flux sanguin 7 comme les cellules musculaires lisses entourant les grands navires. Enfin, les astrocytes, les principales cellules gliales du cerveau, envoient de grandes procédés mentionnés endfeet autour de la majeure partie du système vasculaire du cerveau 8 et moduler Bureau intégrité et la quiescence immunitaire 9, le transfert de metabolites de neurones 10, et induire le couplage étroit entre l&#39;activité neuronale et le flux sanguin 11,12. La possibilité d&#39;étudier les propriétés moléculaires et cellulaires du système vasculaire cérébral est crucial de mieux caractériser sa contribution à la physiologie du cerveau et de la physiopathologie. Pour aborder cette question, les stratégies visant à isoler le système cérébro-vasculaire du cerveau ont été développées, qui permettent pour la préparation de fragments des vaisseaux du cerveau intactes. Cerebral navire purification a d&#39;abord été décrite en utilisant les encéphales 13 et améliorée et adaptée à d&#39;autres espèces, en particulier les rongeurs 14. Dans cette dernière étude, l&#39;utilisation de filtres de taille variable a été introduit pour séparer les vaisseaux cérébraux pour des fractions enrichies dans des récipients de diamètres différents. Fait intéressant, dans ces préparations, les cellules endothéliales ont gardé leurs propriétés métaboliques 15, la fonctionnalité de transporteur et de polarisation 16 17. Ici, nous décrivons en détail ce protocole et démontrent en outre que les navires isolés conservent la plupart de leur dans les structures in situ. Les cellules endotheliales restent liés par des jonctions serrées et entourés par une membrane basale continue. Péricytes et les cellules musculaires lisses restent attachés à la couche endothéliale, ainsi que des membranes d&#39;astrocytes périvasculaires. Cependant, les astrocytes, les cellules de la microglie, les neurones et les oligodendrocytes sont éliminés. Enfin, nous décrivons une procédure pour effectuer immunocoloration sur les vaisseaux cérébraux isolés. </p&gt; Jusqu&#39;à présent, la plupart des études moléculaires et cellulaires du système vasculaire cérébral concernant ont été effectués sur les cellules des vaisseaux cérébraux purifiés dissociées en utilisant des souches de souris journaliste cellulaires spécifiques ou des procédures sur la base de 18,19 immunocoloration-tri cellulaire. Bien que ces techniques permettent l&#39;isolement de populations de cellules vasculaires cérébraux presque purs, des cellules isolées perdent totalement leur morphologie in situ et les interactions, qui à son tour, affecte grandement leurs propriétés moléculaires et cellulaires. Le protocole décrit ici, ce qui permet l&#39;isolement de fragments cérébrovasculaires entières sans avoir besoin d&#39;anticorps spécifiques ou les taches de souris transgéniques, offre une bonne alternative comme la structure globale des vaisseaux cérébraux isolés est conservée, ainsi, de diminuer répercussions sur leurs propriétés moléculaires. Vaisseaux isolés pourraient ensuite être utilisés pour l&#39;étude de l&#39;activité des gènes, la synthèse des protéines et de la réglementation à la BBB comme récemment décrit 20,21 </sup&gt;. Enfin, par rapport à microdissection laser 22,23 Le présent Protocole est peu coûteux, facile à réaliser et rapidement adaptable pour tout laboratoire.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

Dans le cerveau, la majeure partie du système vasculaire est constituée d&#39;une barrière sélective, la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui régule l&#39;échange des molécules et des cellules du système immunitaire entre le cerveau et le sang. En outre, l&#39;énorme demande métabolique neuronale nécessite un règlement d&#39;instant en instant de la circulation sanguine. Notamment, des anomalies de ces réglementations sont les caractéristiques étiologiques de la plupart des pathologies du cerveau; y compris un glioblastome, un accident vasculaire cérébral, l&#39;oedème, l&#39;épilepsie, les maladies dégénératives (ex: la maladie de Parkinson, la maladie d&#39;Alzheimer), les tumeurs cérébrales, ainsi que des affections inflammatoires telles que la sclérose en plaques, la méningite et dysfonctionnements cérébraux induite par le sepsis. Ainsi, la compréhension des événements de signalisation modulant la physiologie vasculaire cérébral est un défi majeur. Beaucoup de perspicacité dans les propriétés cellulaires et moléculaires des différents types de cellules qui composent le système vasculaire cérébral peut être acquise à partir de la culture ou de la cellule primaire de tri du tissu cérébral fraîchement dissociée. cependant,propriétés telles que la polarité cellulaire, la morphologie et les relations intercellulaires ne sont pas maintenus dans de telles préparations. Le protocole que nous décrivons ici est conçu pour purifier des fragments des vaisseaux du cerveau, tout en maintenant l&#39;intégrité structurelle. Nous montrons que des vaisseaux isolés constitués de cellules endothéliales scellées par des jonctions serrées qui sont entourés par une membrane basale continue. Pericytes, cellules musculaires lisses, ainsi que les astrocytes périvasculaires membranes de endfeet restent attachés à la couche endothéliale. Enfin, nous décrivons comment effectuer des expériences de immunocoloration sur les vaisseaux cérébraux purifiés.

Ici, nous décrivons un protocole permettant l&#39;isolation mécanique des vaisseaux du cerveau 14. La figure 1 résume les principales étapes de cette technique. L&#39;architecture des vaisseaux cérébraux est complexe et comprend plusieurs types de cellules, à savoir, les cellules endotheliales scellées par des jonctions serrées et les pericytes, entourés par les cellules musculaires lisses, et les procédés pour les pieds 9 astrocyte. Ainsi, suite à l&...

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Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purification de souris vaisseaux cérébraux

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K vues.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes. 

Vidéo: Purification of Mouse Brain Vessels

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Recherche

Neurosciences

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

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Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles Axon

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Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Purification de la Fraction dendritique filopodia-riche

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, and a ventricular zone niche, which generates the inhibitory GABAergic Purkinje cells, which are neurons that constitute the deep cerebellar nuclei and Bergman glia. Recently, a third stem cell niche has been described that arises as a secondary germinal zone from the ventricular zone niche. The cells of this niche are defined by the cell surface marker prominin-1 and are localized to the developing white matter of the postnatal cerebellum. This niche accounts for the late born molecular layer GABAergic interneurons along with postnatally generated cerebellar astrocytes. In addition to their developmental role, this niche is gaining translational importance in regards to its involvement in neurodegeneration and tumorigenesis. The biology of these cells has been difficult to decipher because of a lack of efficient techniques for their purification. Demonstrated here are efficient methods to purify, culture, and differentiate these postnatal cerebellar stem cells.

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrated here is an efficient and cost-effective method to purify, culture, and differentiate white matter stem cells from postnatal mouse cerebellum.

Purification de la prominine-1- Cellules souches de Cerebellum souris postnatale

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Le cerveau aigu de souris tranche pour étudier l’activité spontanée de réseau hippocampal

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol describes in vivo labeling and subsequent purification of newly synthesized proteins using an engineered mouse line to direct protein labeling to specific cellular populations. It is an inducible line by Cre recombinase expression of L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*), enabling azidonorleucine (ANL) incorporation to the proteins, which otherwise will not occur. Using the method described here, it is possible to purify cell-type-specific proteomes labeled in vivo and detect subtle changes in protein content due to sample complexity reduction.

This protocol describes how to perform cell-type-specific protein labeling with azidonorleucine (ANL) using a mouse line expressing a mutant L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*) and the necessary steps for labeled cell-type-specific proteins isolation. We outline two possible ANL administration routes in live mice by (1) drinking water and (2) intraperitoneal injections.

Purification et identification de protéines spécifiques de type cellulaire à partir de tissus complexes à l’aide d’une lignée de souris mutante d’ARNt synthétase de méthionine