פרוטוקול זה מסייע לאמת את קיומה של וולבצ'יה בתאים, המהווה את הבסיס להבנת האינטראקציה בין וולבצ'יה לפונדקאי שלה. בפרוטוקול זה, ארבע שיטות שימשו כדי לזהות בהצלחה זיהום וולבצ'יה תוך תאי, אשר אימת ושיפר את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של תאים. המדגים את ההליך יהיה Qiuqiu Xiao, בוגר תואר שני מהמעבדה המרכזית לביולוגיה ומאפיינים מודרניים של פתוגנים.
התחל על ידי התבוננות בתאי Aa23 ו- Aa23-T שאינם מוכתמים בהגדלה של פי 100 באמצעות מיקרוסקופ אור. תרבית את התאים במשך חמישה עד שבעה ימים כדי להגיע ל-70%-80% מפגש לכל בקבוקון. באמצעות פיפטה, להעביר 1 מ"ל של מדיום התרבית לצינור microcentrifuge.
צנטריפוגה ב 100 RCF במשך חמש דקות כדי לקצור את התאים. הסר את הסופרנטנט ואחסן את גלולת התא המתקבלת במינוס 20 מעלות צלזיוס. תרבית את התאים במשך חמישה עד שבעה ימים כדי להגיע ל-90%-100% מפגש לכל בקבוקון.
החזירו את הכדורים ב-0.40 מ"ל של PBS והעבירו 50 מיקרוליטרים של פתרון זה לצינור מיקרו-סנטריפוג'. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של 20 מ"ג/מ"ל פרוטאינז K ודגירה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן דגירו את הצינורות בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשיג את הדנ"א הגולמי ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס.
כדי לבצע PCR, הכינו תערובת תגובה כוללת של 20 מיקרוליטרים וקבעו את תנאי ה-PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט. זהה את הדנ"א על ג'ל אגרוז 1% באמצעות מדמה ג'ל. בצע הגברה כמותית של PCR באמצעות TB Green במערכת PCR בזמן אמת ורשום את התוצאות של כל תגובה.
נתחו את הדנ"א בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטרים וקבעו את תנאי ה-PCR הכמותיים כמתואר בכתב היד של הטקסט. חשב את מספרי העתקת הגנים WSP ו- RPS6 בתאים על פי עקומת התקן שנקבעה. לאחר מכן חשב את הצפיפות היחסית של וולבצ'יה לפי מספר העותק של wsp/RPS6.
נתח את הנתונים באמצעות מבחן t דגימות עצמאי. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר ליזה לכדור התא ודגרו על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה את הליזאטים ב 12, 000 RCF במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשאוף את supernatant.
נתחו את ריכוז ה-wsp של ה-supernatant באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA, בהתאם להוראות היצרן. טענו כמויות שוות של חלבון על ג'ל SDS-PAGE של 15%. מעבירים את החלבון לקרומי ניטרוצלולוז וחוסמים את הקרומים עם 5% חלב דל שומן למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST. דגירה של הממברנות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם 100 מיקרוליטרים של נוגדן פוליקלונלי נגד wsp שהוכן על ידי דילול הנוגדן העיקרי עם 5% חלב דל שומן. לשטוף את הנוגדן העיקרי שלוש פעמים עם TBST.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים של נוגדן משני מצומד של חזרת פרוקסידאז לממברנות והדביקו אותו על שייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST ולערבב 20 microliters של פתרון A ו 20 microliters של פתרון B בערכת זיהוי chemiluminescence ביחס של אחד לאחד. לטבול את כל הממברנה לתוך תמיסת luminescence בו זמנית ולצפות באותות באמצעות מערכת הדמיה רב תכליתית.
על צלחת פטרי קונפוקלית בלייזר, הדגירה של תאי Aa23 ו-Aa23-T למשך שלושה עד ארבעה ימים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני אטמוספרי. כאשר התא מגיע למפגש של 60 עד 70%, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לתקן את התאים במ"ל אחד של 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שטפו את התאים הקבועים באמצעות PBST במשך חמש דקות ושטפו מחדש את התאים פעמיים באמצעות PBS. הדגירה של צלחת הפטרי במ"ל אחד של אלבומין בסרום 3% בקר למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים לשקופיות 100 מיקרוליטרים של נוגדנים פוליקלונליים נגד wsp עכברים וסרום עכברים ומדגרים אותו למשך הלילה בקופסה רטובה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
מוציאים את צלחת הפטרי מהקופסה הרטובה ומחזירים אותה לטמפרטורת החדר. לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS ולהסיר את PBS. הגן על ההליכים הבאים מפני אור.
הדגירו את צלחת הפטרי עם 100 מיקרוליטרים של נוגדן נגד עכברים מצומדים של אלקסה פלואור 488 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. דגירו את צלחת הפטרי לדוגמה עם 50 מיקרוליטרים של DAPI מדוללים ב-PBS ל-10 מיקרוגרם/מ"ל ב-37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ואז שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS. התבונן בכישרון החיסוני תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
לפני גילוי וולבצ'יה, נצפו תאי Aa23 ו-Aa23-T תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע הבדלים מורפולוגיים בין שני קווי התאים. לתאי Aa23 ו-AA23-T היו לפחות שתי מורפולוגיות של תאים, אך לא נצפו הבדלים מורפולוגיים נראים לעין בין שני סוגי התאים. באמצעות פריימרים אבחנתיים 81F/691R, הגברה חיובית של הגן Wolbachia wsp זוהתה בתאי Aa23 אך לא בתאי Aa23-T.
הניתוח של צפיפות וולבצ'יה בקווי התאים הראה יחס wsp/rps6 של 2.4 בתאי Aa23 אך ללא וולבצ'יה בתאי Aa23-T. ניתוח כתמים מערביים של תמציות חלבון הראה אות wsp חזק עבור Aa23, אך לא זוהה אות עבור Aa23-T. בדיקת האימונופלואורסצנציה העקיפה זיהתה את חלבון ה-wsp בתאי Aa23, בעוד שרק דנ"א מוכתם ב-DAPI זוהה בתאי Aa23-T.
ודא שבקבוקי התרבית דוגרים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני אטמוספרי למשך חמישה עד שבעה ימים. הליך זה יכול להיות מלווה במיקרוסקופיית אלקטרונים שבה יש לשים לב במיוחד להכנת דגימה ולחתך. ארבע השיטות הניסוייות ששימשו במחקר זה אישרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה בתאים, אשר חל גם על סוגים אחרים של תאים ורקמות.
