שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח, כגון כיצד למתן באופן חיובי את הפעילות של גן, על ידי ניצול mRNAs הקיימים בתאים וברקמות. כיצד לפצות על ליקויים בפעילות, וכיצד להשיג תרגום גבוה מ mRNAs במבחנה וב-vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לסנן באופן גלובלי את הגנים היעד של SINEUP בתאים חיים, על ידי הדמיה ללא קיבעון ואיסוף.
אז ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול שלנו של מקרים haploinsufficient, כי SINEUPs יכול לגרום לעלייה כפולה בחלבון לקוי, כגון frataxin במקרים של אטקסיה של פרידריך. כדי להתחיל, לפתוח את הדפדפן Zenbu, ולחץ על מסד הנתונים פרויקט Fantom של עניין. חפש בגן היעד וחפש אתר התחלת שעתוק, או TSS, ואת רמת הביטוי בתאים וברקמות הרצויים.
כדי לקבוע TSS, עיין בניתוח לדוגמה של חלבון מחלת פרקינסון שבע, או PARK7 mRNA. בדוק TSS לפי אזור שיא כלוב. כדי לקבוע רמות ביטוי שעתוק ספציפיות לתאים ולרקמות, בחרו באזור שיא הכלוב ולחצו על הגדל את האזור הגנומי לבחירה.
בדוק ביטוי PARK7 בסוג התא והרקמות של עניין, על ידי חקירת רשימת ביטויי התמליל בתחתית הדף. לאחר מכן, עצב רצפי תחומי איגוד של מספר אורכים שונים המתאימים ל- 40 בסיסים במעלה הזרם, ו- 32 בסיסים במורד הזרם של המתיון או AUG הראשונים. לפני ההתהוות עם SINEUPs, תאי זרעים מעניינים על שני פולי-d-ליסין מצופים 24 צלחות באר, כמתואר בכתב היד.
דגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב5 אחוז CO2 אינקובטור כדי להשיג 70 אחוז קונפלונציה. חשוב מאוד להפיץ תאים באופן שווה בארות, למטרה זו בעדינות לנער את הצלחת 10 פעמים קדימה ואחורה לאחר זריעת התאים בתוך ספסל נקי, ולחזור על חמישה אחוזים חממת CO2. לאחר הדגירה, לשנות את המדיום ל 0.4mL של בינוני טרי.
לניתוח SINEUP-GFP לעשות כמה צינורות 1.5mL עם 0.1mL של פתרון מעורב, עם pEGFP-C2, SINEUP-GFP, ריאגנטים transfection ו OptiMEM בכל צינור, ולאחר מכן דגירה הצינור בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. הוסף 0.1mL של פתרון מעורב זה מכל צינור ל באר נפרדת של צלחת 24 באר, ולתייג בארות אלה עם SINEUP-GFP אחד, שתיים, שלוש, ארבע, וחמש. להתבגר בצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב5 אחוז חממת CO2 במשך 24 שעות.
לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים עם 0.5mL של PBS. הוסף 25uL של 0.05 אחוז משקל לכל טריפסין נפח, ו דגירה באינקובטור CO2 חמישה אחוזים במשך חמש דקות. הוסף 275uL של תא בינוני ל הבאר.
עבור מיצוי חלבון, לקחת אחד משני הצלחות, לקצור 225uL או שלושה רבעים של התאים מ באר אחת, ו 75uL או רבע מהתאים עבור מיצוי RNA, כל אחד לתוך צינור נפרד 1.5mL. צנטריפוגה ב 6000xg במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant מן הצינור שכותרתו על ידי בידוד חלבון.
מוסיפים 60uL של פתרון תזה לתאים ומערבבים על ידי צינורות מערבבים ביסודיות על ידי סיבוב במהירות איטית במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה הצינור ב 14, 000xg במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף חלבון על טבעי. כדי לקבוע את ריכוז החלבון, הכינו תחילה דילול פי חמישה עד שישה של חלבון בסרום טרי במים טהורים במיוחד, עם ריכוזים הנעים בין 0.2 ל-1.5 מ"ג/מ"ל חלבון.
כדי להכין עבודה reagent תערובת מקף להוסיף 20uL של reagent S למ"ל אחד של reagent A בצינור שני מ"ל. הוסף חמישה uL של מים כפקד שלילי. ואז, תקן BSA או דגימת חלבון בכל באר.
הוסף 25uL של reagent A מקף, ולאחר מכן בזהירות להוסיף 200uL של reagent B ל הבאר, הימנעות כל היווצרות בועה. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי להידגר בטמפרטורת החדר, במשך חמש עד שמונה דקות. למדוד את ספיגת החלבון ב 750nm עם ספקטרופוטומטר.
הכינו עקומה סטנדרטית על ידי התוויית ריכוזי החלבון הסטנדרטיים של BSA על ציר ה-x, והספיגה המתאימה שלהם על ציר ה-y. החל משוואת עקומה סטנדרטית כדי לחשב את ריכוז החלבון לדוגמה. כדי להתחיל בהפרדת חלבונים, הוסיפו כרך אחד של צבע טעינה של פי 2 לכל נפח של דגימת החלבון.
מחממים ב-90 מעלות במשך חמש דקות, ומיד מתקררים על קרח למשך דקה. לטעון 10 עד 20ug של דגימות חלבון ל 10 אחוז ג'ל פוליאקרילמיד SDS ונפרד ב 100 עד 150V. מעבירים את החלבון מהג'ל, לממברנה חנקתית 0.5 מיקרומטר, על ידי מכשיר העברה יבש למחצה.
מלאו במאגר העברה ב-25V למשך 30 דקות. לאחר ההעברה, מניחים את הממברנה במיכל ומוסיפים תותב חסימה עד שהממברנה ספוגה לחלוטין, ומדרגים אותה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עם רעידות. מוסיפים את הנוגדן המתאים לתומת החסימה ויוצקים מעל את הממברנה.
הכלאה על ידי דגירה של הממברנה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך כדי רעידות. לאחר ההכלאה, לשטוף את הממברנה על ידי הוספת חיץ 1x TBST במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולחזור פעמיים נוספות. בצע את ההכלאה הבאה עם נוגדן משני מדולל בתת פתרון חסימה מעל הממברנה, בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות תוך כדי רעידות.
לאחר מכן לשטוף את הממברנה על ידי הוספת חיץ 1x TBST במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולחזור פעמיים נוספות. מעבירים את הממברנה לקופסה מלאה בשני מ"ל של תערובת ריג'נט ECL משופרת של HRP. מכסים את התיבה בנייר אלומיניום, ו דגירה במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
הסר בזהירות את הממברנה מתערובת הריג'נט של ECL, וחשוף אותה באמצעות מכשיר הדמיה זוהר. כדי לנתח את ההשפעה של SINEUP-GFP בתאים על ידי הדמיה, לשטוף את pEGFP-C2, ו SINEUP-GFP תאים מחוללים מן הלוח השני 24 באר עם 0.5mL של PBS לגם. כדי להכתים את הגרעין, להוסיף 2ug של Hoechst-33342 לכל באר, ו דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, במשך 20 דקות.
השתמש ציטומטר תמונה microwell תפוקה גבוהה כדי למדוד תאים מוכתמים Hoechst, כדי לספור את המספר הכולל של תאים. למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הירוקה כדי לספור את מספר התאים החיוביים GFP. כדי לנתח, אפקט upregulatory חלבון של SINEUPs, להשתמש בתוכנת הדמיה כדי לקבוע עוצמה משולבת GFP לחשב אותו כמו הסכום של כל עוצמות פיקסל הצגת אותות אובייקטים מקולחים שהושגו עבור כל ערוץ.
לאחר ביצוע חילוף מוצלח עם SINEUP-GFP, SINEUP סינתטי המכיל הן תחום מחייב אופטימלי והן תחום משפיע GFP, תרגום mRNA היה מוסדר מבלי לשנות את הביטוי של GFP mRNA. פרוטוקול של ניתוח תמונה חצי אוטומטי שיפר את זמן הזיהוי והגדיל את מספר הדגימות המוקרנות בו זמנית בהשוואה לניתוח כתם מערבי קונבנציונלי. למרות שהיה הבדל בעוצמת האות, מ 2.6 פי בניתוח כתם מערבי ל 1.4-פי בניתוח הדמיה, רמות גבוהות משמעותית של פלואורסצנטיות GFP זוהו בהשוואה לבקרה.
בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור לזהות את הרצף הנכון של mRNAs היעד לעצב את תחום האיגוד הנכון. גנים מתמללים לעתים קרובות מיזמים, ועשויים להשתמש באתר חניכת תרגום שונה. דפדפן Zenbu הוא כלי שימושי מאוד לחקור שונות mRNA כזה.
אנו מציעים גם לעצב SINEUPs שונים עם אתרי איגוד משתנים. בסך הכל אנו מאמינים כי התאמת SINEUPs במהירות לריבוי של מטרות תקים שדה חדש המורכב תרגום מוסדר באופן חיובי של RNAs הקיימים, שהוא הדדי ומחמיא לשדה של siRNA. חלק מאותם פונקציה אנו צופים כי טכנולוגיה זו תהיה אינסטרומנטלי לייצר כמויות גדולות יותר של חלבונים במבחנה, כמו bioreactors, כמו גם ב vivo כדי לתקן באופן טבעי את המינון הגן.
