Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave, come come moderare positivamente l'attività di un gene, sfruttando gli mRNA presenti nelle cellule e nei tessuti. Come compensare le carenze di attività e come ottenere un'alta traduzione dagli mRNA in vitro e in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo schermae globalmente i geni bersaglio di SINEUP nelle cellule viventi, imaging senza fissazione e raccolta.
Quindi le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia di casi aploinufficienti, perché i SINEUP possono indurre un aumento doppio di una proteina carente, come la fratassina nei casi di atassia di Friedrich. Per iniziare, apri il browser Zenbu e fai clic sul database del progetto Fantom di interesse. Cerca il gene di destinazione e controlla il sito di inizio della trascrizione, o TSS, e il livello di espressione nelle cellule e nei tessuti desiderati.
Per determinare la TSS, consultare l'analisi di esempio della proteina del morbo di Parkinson sette, o PARK7 mRNA. Controllare il TSS per regione di picco della gabbia. Per determinare i livelli di espressione di trascrizione specifici di cellule e tessuti, selezionare la regione di picco della gabbia e fare clic sull'ingrandimento della regione genomica da selezionare.
Controllare l'espressione PARK7 nel tipo di interesse cellulare e tissutale, esplorando l'elenco delle espressioni di trascrizione nella parte inferiore della pagina. Quindi, progetta sequenze di dominio di associazione di diverse lunghezze corrispondenti a 40 basi a monte e 32 basi a valle della prima metinina o AUG. Prima della trasfezione con SINEUP, le cellule di semi di interesse su due placche di poli-d-lisina rivestite con 24 polietilene, come descritto nel manoscritto.
Incubare per 24 ore a 37 gradi celsius in un incubatore di CO2 al cinque per cento per ottenere il 70 per cento di confluenza. È molto importante distribuire le cellule equamente nei pozzi, per questo scopo scuotere delicatamente la piastra 10 volte avanti e indietro dopo aver seminato le cellule all'interno di un banco pulito e ripetere nell'incubatore di CO2 al cinque percento. Dopo l'incubazione, cambiare il mezzo a 0,4 mL di mezzo fresco.
Per l'analisi di SINEUP-GFP fare diversi tubi da 1,5 ml con 0,1 ml di soluzione mista, con pEGFP-C2, SINEUP-GFP, reagenti di trasfezione e OptiMEM in ogni tubo, quindi incubare il tubo a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere 0,1 ml di questa soluzione mista da ogni tubo a un pozzo separato di una piastra di 24 pomp pouf ed etichettare questi pozzi con SINEUP-GFP uno, due, tre, quattro e cinque. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore di CO2 al cinque per cento per 24 ore.
Dopo 24 ore, lavare le cellule con 0,5 mL di PBS. Aggiungere 25uL dello 0,05% di peso per tripina volume e incubare in un incubatore di CO2 al cinque per cento per cinque minuti. Aggiungere 275uL di mezzo cellulare per pozzo.
Per l'estrazione di proteine, prendere una delle due piastre e raccogliere 225uL o tre quarti delle cellule da un pozzo, e 75uL o un quarto delle cellule per l'estrazione dell'RNA, ognuna in un tubo separato da 1,5 ml. Centrifuga a 6000xg per cinque minuti a quattro gradi celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il supernatante dal tubo etichettato dall'isolamento proteico.
Aggiungere 60uL di soluzione dilisi alle cellule e mescolare pipettando Mescolare accuratamente ruotando a bassa velocità per un'ora a quattro gradi Celsius. Centrifuga il tubo a 14.000xg per 10 minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere il supernatante proteico. Per determinare la concentrazione proteica, preparare prima da cinque a sei volte la diluizione dello standard proteico fresco di albumina del siero bovino in acqua ultra pura, con concentrazioni che vanno da 0,2 a 1,5 mg/mL di proteine.
Per preparare il reagente di lavoro A Dash mix aggiungere 20uL di reagente S a un mL di reagente A in un tubo da due ml. Aggiungere cinque uL di acqua come controllo negativo. E poi, bsa standard o campione proteico in ogni pozzo.
Aggiungere 25uL di reagente A Dash, quindi aggiungere con cura 200uL di reagente B per pozzo, evitando qualsiasi formazione di bolle. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per incubare a temperatura ambiente, per cinque o otto minuti. Misurare l'assorbanza proteica a 750nm con uno spettrofotometro.
Preparare una curva standard tracciando le concentrazioni di proteine standard BSA sull'asse x e la rispettiva assorbanza sull'asse y. Applicare un'equazione di curva standard per calcolare la concentrazione proteica del campione. Per iniziare la separazione proteica, aggiungere un volume di colorante di carico 2x ad ogni volume del campione proteico.
Riscaldare a 90 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddare immediatamente sul ghiaccio per un minuto. Caricare da 10 a 20ug di campioni proteici al 10% di gel di poliacrilammide SDS e separarlo a 100-150V. Trasferire la proteina dal gel, a una membrana di nitrocellulosa di 0,5 micrometri, con uno strumento di trasferimento semi-secco.
Riempire con buffer di trasferimento a 25V per 30 minuti. Dopo il trasferimento, posizionare la membrana in un contenitore e aggiungere la soluzione di blocco fino a quando la membrana non è completamente imbevuta e incubarla a temperatura ambiente per 30 minuti con tremori. Aggiungere l'anticorpo appropriato alla soluzione di blocco e versare sulla membrana.
Ibridare incubando la membrana per 30 minuti a temperatura ambiente, mentre si trema. Dopo l'ibridazione, lavare la membrana aggiungendo 1 tampone TBST per cinque minuti a temperatura ambiente e ripetere altre due volte. Eseguire la successiva ibridazione con un anticorpo secondario diluito in soluzione di blocco sulla membrana, a temperatura ambiente per 30 minuti durante lo scuotimento.
Quindi lavare la membrana aggiungendo 1 tampone TBST per cinque minuti a temperatura ambiente e ripetere altre due volte. Trasferire la membrana in una scatola riempita con due mL di miscela di reagente ECL migliorata HRP. Coprire la scatola con un foglio di alluminio e incubare per uno o due minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere con cura la membrana dalla miscela di reagenti ECL ed esporla utilizzando uno strumento di imaging a luminescenza. Per analizzare l'effetto di SINEUP-GFP nelle cellule mediante imaging, lavare le cellule traslavate pEGFP-C2 e SINEUP-GFP dalla seconda piastra del pozzo 24 con 0,5 mL di PBS per pozzo. Per macchiare il nucleo, aggiungere 2ug di Hoechst-33342 ad ogni pozzo e incubare le cellule a 37 gradi Celsius, per 20 minuti.
Utilizzare un citometro dell'immagine microwell ad alta velocità effettiva per misurare le celle macchiate di Hoechst, per contare il numero totale di celle. Misurare l'intensità della fluorescenza verde per contare il numero di cellule positive della FPG. Per analizzare, effetto di upregolazione proteica dei SINEUP, utilizzare il software di imaging per determinare un'intensità integrata GFP Calcolarla come la somma di tutte le intensità di pixel che visualizzano segnali in oggetti segmentati ottenuti per ogni canale.
Dopo una riuscita trasfezione con SINEUP-GFP, un SINEUP sintetico contenente sia un dominio di legame ottimale che un dominio di effettore GFP, la traduzione dell'mRNA è stata upregolata senza modificare l'espressione dell'mRNA GFP. Un protocollo di analisi semi-automatizzata delle immagini ha migliorato i tempi di rilevamento e aumentato il numero di campioni che vengono schermati simultaneamente rispetto a un'analisi convenzionale western blot. Sebbene ci fosse una differenza nell'intensità del segnale, da 2,6 volte nell'analisi western delle macchie a 1,4 volte nell'analisi di imaging, sono stati rilevati livelli significativamente più elevati di fluorescenza GFP rispetto al controllo.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di identificare la sequenza corretta di mRNA di destinazione per progettare il dominio di associazione corretto. I geni sono spesso trascritti dai promotori e possono usare diversi siti di iniziazione alla traduzione. Il browser Zenbu è uno strumento molto utile per esplorare tale varianza di mRNA.
Suggeriamo inoltre di progettare diversi SINEUP con siti di associazione variabili. Nel complesso riteniamo che l'adattamento rapido dei SINEUP a una molteplicità di obiettivi stabilirà un nuovo campo consistente in una traduzione regolamentata positivamente degliRNA esistenti, che è un reciproco e gratuito al campo del siRNA. Una parte di queste funzioni prevediamo che questa tecnologia sarà strumentale per produrre maggiori quantità di proteine in vitro, come i bioreattori, così come in vivo per correggere naturalmente il dosaggio genico.
