Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave, como moderar positivamente a atividade de um gene, aproveitando-se dos mRNAs que estão presentes nas células e tecidos. Como compensar as deficiências na atividade e como alcançar alta tradução de mRNAs in vitro e in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que podemos tela global dos genes-alvo do SINEUP em células vivas, por meio de imagens sem fixação e coleta.
Assim, as implicações desta técnica se estendem à nossa terapia de haploinsufficients, porque os SINEUPs podem induzir o aumento de duas vezes em uma proteína deficiente, como a frataxina em casos de ataxia de Friedrich. Para começar, abra o navegador Zenbu e clique no banco de dados de interesse do projeto Fantom. Pesquise o gene alvo e verifique se há local de início de transcrição, ou TSS, e nível de expressão em células e tecidos desejados.
Para determinar o TSS, consulte a análise do exemplo da proteína da Doença de Parkinson sete, ou PARK7 mRNA. Verifique o TSS pela região de pico da gaiola. Para determinar os níveis específicos de expressão de transcrição de células e tecidos, selecione a região de pico da gaiola e clique na região genômica de ampliação para seleção.
Verifique a expressão PARK7 no tipo de interesse celular e tecido, explorando a lista de expressão da transcrição na parte inferior da página. Em seguida, projete sequências de domínio de ligação de vários comprimentos diferentes correspondentes a 40 bases a montante, e 32 bases a jusante da primeira methionina ou AUG. Antes da transfecção com SINEUPs, células de sementes de interesse em duas placas de poli-d-lysina revestidas de 24 placas de poço, como descrito no manuscrito.
Incubar por 24 horas a 37 graus celsius em uma incubadora de CO2 de 5% para atingir 70% de confluência. É muito importante distribuir células igualmente nos poços, para este fim agite suavemente a placa 10 vezes para frente e para trás depois de semear as células dentro de um banco limpo, e repetir na incubadora de CO2 de 5%. Após a incubação, mude o médio para 0,4mL de meio fresco.
Para analisar o SINEUP-GFP faça vários tubos de 1,5mL com 0,1mL de solução mista, com pEGFP-C2, SINEUP-GFP, reagentes de transfecção e OptiMEM em cada tubo e, em seguida, incubar o tubo à temperatura ambiente por 20 minutos. Adicione 0,1mL desta solução mista de cada tubo a um poço separado de uma placa de 24 poços, e rotule esses poços com SINEUP-GFP um, dois, três, quatro e cinco. Incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2 de 5% por 24 horas.
Após 24 horas, lave as células com 0,5mL de PBS. Adicione 25uL de 0,05% de peso por volume de trippsina, e incubar em uma incubadora de CO2 de 5% por cinco minutos. Adicione 275uL de meio celular por poço.
Para extração de proteínas, pegue uma das duas placas, e colme 225uL ou três quartos das células de um poço, e 75uL ou um quarto das células para extração de RNA, cada uma em um tubo separado de 1,5 mL. Centrífuga a 6000xg por cinco minutos a quatro graus celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenaante do tubo rotulado pelo isolamento de proteínas.
Adicione 60uL de solução de lise às células e misture por pipetar Misture bem girando em velocidade lenta por uma hora a quatro graus Celsius. Centrifugar o tubo a 14.000xg por 10 minutos a quatro graus Celsius para coletar proteína supernasal. Para determinar a concentração proteica, primeiro prepare cinco a seis vezes a diluição da proteína de gânico bovino fresco padrão em água ultra-pura, com concentrações que variam de 0,2 a 1,5mg/mL de proteína.
Para preparar o reagente de trabalho A dash mix adicione 20uL de reagente S a um mL de reagente A em um tubo de dois mL. Adicione cinco uL de água como um controle negativo. E então, bsa padrão ou amostra de proteína em cada poço.
Adicione 25uL de reagente A Dash e, em seguida, adicione cuidadosamente 200uL de reagente B por poço, evitando qualquer formação de bolha. Cubra a placa com papel alumínio para incubar em temperatura ambiente, por cinco a oito minutos. Meça a absorvância de proteína a 750nm com um espectrofotômetro.
Prepare uma curva padrão plotando concentrações proteicas padrão BSA no eixo x, e sua respectiva absorvância no eixo y. Aplique uma equação de curva padrão para calcular a concentração de proteína amostral. Para iniciar a separação da proteína, adicione um volume de corante de carga de 2x a cada volume da amostra de proteína.
Aqueça a 90 graus Celsius por cinco minutos, e esfrie imediatamente no gelo por um minuto. Carregue de 10 a 20ug de amostras de proteínas para 10% de gel de poliacrilamida SDS e separe a 100 a 150V. Transfira a proteína do gel, para uma membrana de nitrocelulose de 0,5 micrômetro, por um instrumento de transferência semi-seca.
Encha com buffer de transferência a 25V por 30 minutos. Após a transferência, coloque a membrana em um recipiente e adicione a solução de bloqueio até que a membrana esteja completamente encharcada, e incuba-a em temperatura ambiente por 30 minutos com agitação. Adicione o anticorpo apropriado à solução de bloqueio e despeje sobre a membrana.
Hibridize incubando a membrana por 30 minutos à temperatura ambiente, enquanto treme. Após a hibridização, lave a membrana adicionando 1x tampão TBST por cinco minutos à temperatura ambiente e repita mais duas vezes. Realize a próxima hibridização com um anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio sobre a membrana, em temperatura ambiente por 30 minutos enquanto treme.
Em seguida, lave a membrana adicionando 1x tampão TBST por cinco minutos à temperatura ambiente e repita mais duas vezes. Transfira a membrana para uma caixa cheia com dois mL de mistura de reagente ECL aprimorado por HRP. Cubra a caixa com papel alumínio e incubar por um a dois minutos em temperatura ambiente.
Remova cuidadosamente a membrana da mistura de reagentes ECL e exponha-a usando um instrumento de imagem de luminescência. Para analisar o efeito do SINEUP-GFP nas células por imagem, lave as células transectadas pEGFP-C2 e SINEUP-GFP da segunda placa de poço de 24 metros com 0,5mL de PBS por poço. Para manchar o núcleo, adicione 2ug de Hoechst-33342 a cada poço, e incuba as células a 37 graus Celsius, por 20 minutos.
Use um citômetro de imagem de microwell de alta produtividade para medir células manchadas de Hoechst, para contar o número total de células. Meça a intensidade da fluorescência verde para contar o número de células positivas de GFP. Para analisar, efeito regulatório de proteínas dos SINEUPs, use software de imagem para determinar uma intensidade integrada GFP Calcule-o como a soma de todas as intensidades de pixels exibindo sinais em objetos segmentados obtidos para cada canal.
Após uma transfecção bem sucedida com SINEUP-GFP, um SINEUP sintético contendo um domínio de ligação ideal e um GFP de domínio effector, a tradução mRNA foi regulada sem alterar a expressão do MRNA GFP. Um protocolo de análise de imagem semi-automatizada melhorou o tempo de detecção e aumentou o número de amostras sendo exibidas simultaneamente em comparação com uma análise convencional de manchas ocidentais. Embora tenha havido diferença na intensidade do sinal, de 2,6 vezes na análise de manchas ocidentais para 1,4 vezes na análise de imagens, foram detectados níveis significativamente mais elevados de fluorescência de GFP em comparação com o controle.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de identificar a sequência correta de mRNAs de destino para projetar o domínio de ligação correto. Os genes são frequentemente transcritos dos promotores e podem usar diferentes sites de iniciação de tradução. O navegador Zenbu é uma ferramenta muito útil para explorar essa variância de mRNA.
Sugerimos também projetar diferentes SINEUPs com locais de vinculação variável. Ao todo, acreditamos que a rápida adaptação dos SINEUPs a uma multiplicidade de metas estabelecerá um novo campo que consiste na tradução positivamente regulamentada das RNAs existentes, o que é um recíproco e gratuito para o campo do SiRNA. Uma parte dessas funções que prevemos que essa tecnologia será fundamental para produzir grandes quantidades de proteínas in vitro, como bioreatores, bem como in vivo para corrigir naturalmente a dosagem genética.
