이 방법은 세포와 조직에 존재하는 mRNA를 이용해서 유전자의 활동을 긍정적으로 조정하는 방법과 같은 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 활동의 결함을 보상하는 방법, 그리고 시험관 내 및 생체 내 mRNA에서 높은 번역을 달성하는 방법. 이 기술의 주요 장점은 우리가 전 세계적으로 고정 및 수집없이 이미징하여 살아있는 세포에서 SINEUP의 표적 유전자를 스크린 할 수 있다는 것입니다.
따라서 SINEUP는 프리드리히의 운동실조의 경우 프라탁신과 같은 결핍 된 단백질의 2 배 증가를 유도 할 수 있기 때문에이 기술의 의미는 haplo부족한 인스턴스의 치료로 확장됩니다. 시작하려면 Zenbu 브라우저를 열고 관심있는 Fantom 프로젝트 데이터베이스를 클릭합니다. 대상 유전자를 검색하고, 전사 시작 부위, 또는 TSS, 원하는 세포 및 조직에서 발현 수준을 확인한다.
TSS를 결정하려면 파킨슨 병 단백질 7 또는 PARK7 mRNA의 예제 분석을 참조하십시오. 케이지 피크 영역별로 TSS를 확인합니다. 세포 및 조직별 전사 발현 수준을 결정하려면 케이지 피크 영역을 선택하고 확대된 게놈 영역을 클릭하여 선택합니다.
페이지 하단의 성적증명서 발현 목록을 탐색하여 관심 있는 세포 및 조직 유형의 PARK7 발현을 확인합니다. 그런 다음, 40개의 베이스업에 대응하는 여러 가지 길이의 결합 도메인 시퀀스와 첫 번째 메티오닌 또는 8월의 하류32개의 베이스를 설계합니다. SINEUP로 전환하기 전에, 원고에 설명된 바와 같이 2개의 폴리-d-lysine코팅 24 웰 플레이트에 관심 있는 종자 세포.
CO2 인큐베이터5%에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하여 70%의 인플루엔자를 달성합니다. 우물에서 세포를 동등하게 분배하는 것이 매우 중요하며, 이를 위해 깨끗한 벤치 내부의 세포를 시드한 후 10번 앞뒤로 플레이트를 부드럽게 흔들고 5% CO2 인큐베이터에서 반복합니다. 인큐베이션 후, 중간을 신선한 배지의 0.4mL로 변경합니다.
SINEUP-GFP를 분석하기 위해 혼합 용액0.1mL로 여러 개의 1.5mL 튜브를 만들고 각 튜브의 pEGFP-C2, SINEUP-GFP, 트랜스페션 시약 및 OptiMEM을 각 튜브에 넣고 20분 동안 실온에서 튜브를 배양합니다. 각 튜브에서 이 혼합 용액의 0.1mL을 별도의 웰에 24개의 웰 플레이트에 추가하고 SINEUP-GFP 1, 2, 3, 4 및 5로 이 우물에 라벨을 부착합니다. 24시간 동안 5%의 CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
24 시간 후, PBS의 0.5mL로 세포를 씻으라. 볼륨 트립신당 무게가 0.05%인 25uL을 추가하고 5분 동안 CO2 인큐베이터로 인큐베이션을 넣습니다. 잘 세포 매체의 275uL을 추가합니다.
단백질 추출을 위해, 2개의 플레이트 중 하나를 취하고, RNA 추출을 위해 세포의 225uL 또는 3쿼터를 수확하고, RNA 추출을 위한 세포의 1/1, 각각 별도의 1.5mL 튜브로 한다. 섭씨 4도에서 5분간 6000xg의 원심분리기. 원심 분리 후 단백질 절연에 의해 표지된 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
셀에 60uL용용액을 추가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 느린 속도로 회전하여 혼합을 철저히 배관하여 혼합합니다. 14, 000xg의 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 단백질 상류물을 수집합니다. 단백질 농도를 결정하기 위해 먼저 0.2에서 1.5mg/mL 단백질에 이르는 농도를 가진 초순수 수에서 신선한 소 세럼 알부민 단백질 표준을 5~6배 희석합니다.
작업 시약을 준비하려면 대시 믹스는 2mL 튜브에 시약 A의 1 mL에 시약 S의 20uL을 추가합니다. 5uL의 물을 음수 컨트롤로 추가합니다. 그리고, BSA 표준 또는 단백질 샘플각각의 우물.
시약 A 대시의 25uL을 추가한 다음, 거품 형성을 피하면서 200uL의 시약 B를 신중하게 추가하십시오. 알루미늄 호일로 접시를 덮어 실온에서 5~8분간 배양합니다. 분광계로 750nm에서 단백질 흡광도를 측정합니다.
X축에 BSA 표준 단백질 농도를 플로팅하고 y축에 각각의 흡광도를 플로팅하여 표준 곡선을 준비합니다. 표준 곡선 방정식을 적용하여 시료 단백질 농도를 계산합니다. 단백질 분리를 시작하려면 단백질 샘플의 각 부피에 2배 적재 염료를 1부 추가합니다.
섭씨 90도에서 5분간 가열하고 얼음위에서 1분간 즉시 식힙니다. 10~20ug의 단백질 샘플을 SDS 폴리아크라이글라미드 젤에 적재하고 100~150V로 분리합니다. 젤에서 단백질을 0.5 마이크로미터 니트로셀룰로오스 막으로, 반건조 전달 기구로 전달한다.
30분 동안 25V에서 전송 버퍼로 채웁니다. 이송 후 멤브레인을 용기에 넣고 멤브레인이 완전히 흡수될 때까지 차단 용액을 추가하고 흔들림으로 30분 동안 실온에서 배양합니다. 적절한 항체를 차단 용액에 추가하고 멤브레인 위에 붓습니다.
실온에서 30분 동안 멤브레인을 배양하고 흔들어 혼성화합니다. 혼성화 후 실온에서 5분 동안 1x TBST 버퍼를 추가하여 멤브레인을 세척하고 2회 더 반복하십시오. 흔들림이 있는 동안 30분 동안 실온에서 멤브레인을 통해 용액을 차단하는 데 희석된 이차 항체로 다음 혼성화를 수행합니다.
그런 다음 실온에서 5 분 동안 1x TBST 버퍼를 추가하여 멤브레인을 세척하고 두 번 더 반복하십시오. 멤브레인을 HRP 강화 ECL 시약 믹스의 2mL로 채워진 상자로 전송합니다. 상자를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 1~2분 간 배양합니다.
ECL 시약 혼합물에서 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 발광 이미징 기기를 사용하여 노출합니다. 이미징을 통해 세포내 SINEUP-GFP의 효과를 분석하기 위해, pEGFP-C2 및 SINEUP-GFP를 잘 합산한 PBS의 0.5mL로 제24웰 플레이트로부터 씻어낸다. 핵을 더럽히려면 각 우물에 Hoechst-33342 2ug을 추가하고 세포를 섭씨 37도에서 20 분 동안 배양하십시오.
높은 처리량 마이크로웰 이미지 세포계를 사용하여 Hoechst 염색 된 세포를 측정하여 총 세포 수를 계산합니다. 녹색 형광의 강도를 측정하여 GFP 양성 세포의 수를 계산합니다. SINEUPs의 단백질 업규제 효과를 분석하기 위해 이미징 소프트웨어를 사용하여 GFP 통합 강도를 결정하기 위해 각 채널에 대해 획득한 세그먼트 객체에 신호를 표시하는 모든 픽셀 강도의 합으로 계산합니다.
SINEUP-GFP를 통한 성공적인 전환 후, 최적의 결합 도메인과 이펙터 도메인 GFP를 모두 포함하는 합성 SINEUP, mRNA 번역은 GFP mRNA의 발현을 변경하지 않고 강화되었다. 반자동 이미지 분석 프로토콜은 검출 시간을 개선하고 기존의 서양 얼룩 분석에 비해 동시에 선별되는 샘플 수를 증가시켰다. 신호 강도의 차이가 있었지만, 서양 블롯 분석에서 2.6배에서 이미징 분석에서 1.4배로, 대조군과 비교하여 GFP 형광의 상당히 높은 수준이 검출되었다.
이 절차를 시도하는 동안 올바른 바인딩 도메인을 설계하기 위해 대상 mRNA의 올바른 시퀀스를 식별하는 것이 중요합니다. 유전자는 종종 프로모터로부터 전사되며 다른 번역 개시 부위를 사용할 수 있습니다. Zenbu 브라우저는 이러한 mRNA 분산을 탐구하는 매우 유용한 도구입니다.
또한 가변 바인딩 사이트를 통해 다른 SINEU를 디자인하는 것이 좋습니다. 전부 우리는 신속하게 대상의 복합성에 SINEUP를 적응하는 것은 siRNA의 필드에 상호 및 무료 기존의 RNA의 긍정적으로 규제 번역으로 구성된 새로운 필드를 설립 할 것이라고 생각합니다. 이러한 기능의 일부는 이 기술이 생체 반응기와 같은 체외에서 더 많은 양의 단백질을 생산하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 생체 내에서 유전자 투여량을 자연스럽게 교정하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.
