Bu yöntem, hücre ve dokularda bulunan mRNA'lardan yararlanarak bir genin aktivitesinin nasıl olumlu bir şekilde kontrol edilebildiği gibi anahtar soruların yanıtlatılanın yardımcı olabilir. Aktivite deki eksikliklerin nasıl giderilir, mRNA'lardan in vitro ve in vivo yüksek çeviri nasıl elde edilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, sineup'ın canlı hücrelerdeki hedef genlerini fiksasyon ve toplama olmadan görüntüleme yaparak küresel olarak tarayabilmemizdir.
Bu tekniğin sonuçları haploinsufficient örnekleri tedavimize kadar uzanır, çünkü SineuPs, Friedrich'in ataksisi vakalarında frataxin gibi eksik bir proteinde iki kat artışa neden olabilir. Başlamak için Zenbu tarayıcısını açın ve Fantom proje veritabanını tıklayın. Hedef geni arayın ve transkripsiyon başlangıç bölgesini veya TSS'yi ve istenilen hücre ve dokularda ifade düzeyini kontrol edin.
TSS'yi belirlemek için Parkinson Hastalığı proteini yedi veya PARK7 mRNA örnek analizine başvurun. Kafes tepe bölgesine göre TSS'yi kontrol edin. Hücre ve dokuya özgü transkripsiyon ifade düzeylerini belirlemek için kafes tepe bölgesini seçin ve genomik bölgeyi büyütmek için tıklayın.
Sayfanın altındaki transkript ifade listesini inceleyerek, ilgi hücre ve doku türünde PARK7 ifadesini kontrol edin. Daha sonra, akış yukarı 40 baza karşılık gelen birkaç farklı uzunlukta bağlayıcı etki alanı dizileri ve ilk metiyonin veya AUG'un 32 tabanı aşağı akışı. SineuPs ile transfection önce, iki poli-d-lizin kaplı 24 kuyu plakaları üzerinde ilgi tohum hücreleri, el yazması açıklandığı gibi.
%70 birleşme elde etmek için %5'lik CO2 kuluçka makinesinde 37 derecede 24 saat kuluçkaya yat. Bu amaçla, hücreleri kuyularda eşit olarak dağıtmak çok önemlidir, bu amaçla plakayı temiz bir tezgahın içine yerleştirdikten sonra 10 kat ileri geri sallayın ve yüzde beş CO2 kuluçka makinesinde tekrarlayın. Kuluçkadan sonra, ortayı 0.4mL taze ortama çevirin.
SINEUP-GFP analiz etmek için pEGFP-C2, SINEUP-GFP, transfeksiyon reaktifleri ve OptiMEM ile 0.1mL karışık çözelti ile birkaç 1.5mL tüpler yapmak ve daha sonra 20 dakika oda sıcaklığında tüp kuluçka. Her tüpten bu karışık çözeltinin 0,1 mL'sini 24 kuyuplakalı ayrı bir kuyuya ekleyin ve bu kuyuları SINEUP-GFP bir, iki, üç, dört ve beş ile etiketleyin. Plakayı 37 derecede, %5'lik CO2 kuluçka makinesinde 24 saat kuluçkaya yatırın.
24 saat sonra hücreleri 0.5mL PBS ile yıkayın. Hacim trypsin başına yüzde 0,05 ağırlık 25uL ekleyin ve beş dakika boyunca yüzde beş CO2 kuluçka kuluçka. Kuyu başına hücre orta 275uL ekleyin.
Protein ekstraksiyonu için, iki tabaktan birini alın ve hücrelerin 225uL veya dörtte üçünü bir kuyudan ve RNA ekstraksiyonu için hücrelerin dörtte birini ayrı bir 1,5mL tüpe ayırın. Santrifüj 6000xg beş dakika için dört derece santigrat. Santrifüjden sonra, protein izolasyonu ile etiketlenmiş tüpten süpernatantı dikkatlice çıkarın.
Hücrelere 60uL lysis çözeltisi ekleyin ve dört santigrat derecede bir saat yavaş hızda döndürerek iyice karıştırarak karıştırın. Protein supernatant toplamak için dört santigrat derece 10 dakika için 14, 000xg tüp santrifüj. Protein konsantrasyonu belirlemek için, ilk ultra saf suda taze sığır serum albumin protein standardı beş ila altı kez seyreltme hazırlamak, konsantrasyonları arasında değişen 0.2 için 1.5mg/mL protein.
Çalışma reaktifi Hazırlamak için A Dash karışımı, iki mL tüpteki bir mL reaktif A'ya 20uL reaktif S ekleyin. Negatif kontrol olarak beş uL su ekleyin. Ve sonra, BSA standart veya protein örneği her kuyuda.
Reaktif A Dash 25uL ekleyin ve sonra dikkatle iyi başına reaktif B 200uL ekleyin, herhangi bir kabarcık oluşumukaçınarak. 5-8 dakika oda sıcaklığında kuluçka için alüminyum folyo ile plaka kapağı. Bir spektrofotometre ile 750nm de protein emiciölçün.
X ekseninde BSA standart protein konsantrasyonları ve y ekseni üzerinde ilgili absorbans çizerek standart bir eğri hazırlayın. Örnek protein konsantrasyonu hesaplamak için standart bir eğri denklemi uygulayın. Protein ayrılığını başlatmak için, protein numunesinin her hacmine 2x yükleme boyası bir hacim ekleyin.
Isı 90 santigrat derecede beş dakika, ve hemen bir dakika buz üzerinde soğutun. Yük 10-20ug protein örnekleri yüzde 10 SDS poliakrilamid jel ve ayrı 100-150V. Proteini jelden, 0,5 mikrometrenitroselüloz membrana, yarı kuru bir transfer aleti ile aktarın.
30 dakika boyunca 25V'da transfer tamponu ile doldurun. Transferden sonra, bir kap içine membran yerleştirin ve membran tamamen ıslatılmış kadar engelleme çözeltisi ekleyin ve sallayarak 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Engelleme çözeltisine uygun antikor ekleyin ve membran Üzerine dökün.
Sallayarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca membran kuluçka ile hibridize. Hibridizasyondan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1x TBST tampon ekleyerek membranı yıkayın ve iki kez daha tekrarlayın. Sallarken oda sıcaklığında, membran üzerinde bloklama çözeltisi seyreltilmiş ikincil bir antikor ile bir sonraki hibridizasyon gerçekleştirin.
Daha sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1x TBST tampon ekleyerek membranı yıkayın ve iki kez daha tekrarlayın. Membranı iki mL HRP geliştirilmiş ECL reaktif karışımı ile dolu bir kutuya aktarın. Alüminyum folyo ile kutukapağı ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika kuluçka.
Membranı ECL reaktif karışımından dikkatlice çıkarın ve bir Parlaklık görüntüleme aleti kullanarak ortaya çıkarın. SİnOP-GFP'nin hücrelerdeki etkisini görüntüleme ile analiz etmek için, pEGFP-C2 ve SINEUP-GFP transekted hücreleri ikinci 24 kuyu plakasından 0.5mL PBS ile yıkayın. Çekirdeği lekelemek için, her kuyuya 2ug Hoechst-33342 ekleyin ve hücreleri 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Hoechst lekeli hücreleri ölçmek için, toplam hücre sayısını saymak için yüksek bir elde lik mikrokuyu görüntü sitometresi kullanın. GFP pozitif hücrelerin sayısını saymak için yeşil floresan yoğunluğunu ölçün. SİnEM'lerin protein yükseltme etkisini analiz etmek için, gfp entegre yoğunluğunu belirlemek için görüntüleme yazılımı kullanın Her kanal için elde edilen parçalı nesnelerde sinyalleri görüntüleyen tüm piksel yoğunluklarının toplamı olarak hesaplayın.
SİnOP-GFP, hem optimum bağlayıcı etki alanı hem de efektör etki alanı GFP içeren sentetik bir SineUP ile başarılı bir transfeksiyon sonra, mRNA çeviri GFP mRNA ifadesini değiştirmeden upregulated oldu. Yarı otomatik görüntü analizi protokolü algılama süresini artırdı ve geleneksel Batı leke analizine kıyasla aynı anda taranan numune sayısını artırdı. Sinyal yoğunluğunda bir farklılık olmasına rağmen, Batı leke analizinde 2.6 kattan görüntüleme analizinde 1.4 kata kadar, kontrole göre önemli ölçüde daha yüksek GFP floresans düzeyleri saptandı.
Bu yordamı denerken, doğru bağlama etki alanını tasarlamak için hedef mRNA'ların doğru sırasını tanımlamayı unutmamak gerekir. Genler genellikle organizatörlerden transkripsiyonu yapılır ve farklı çeviri başlatma sitesi kullanabilir. Zenbu tarayıcı sıyrık gibi mRNA varyansını keşfetmek için çok yararlı bir araçtır.
Değişken bağlama alanlarına sahip farklı SİnOP'lar tasarlamanızı da öneriyoruz. SİnEM'lerin çokluk hedeflerine hızla adapte olmasının, siRNA'nın alanına karşılıklı ve ücretsiz olan mevcut RNA'ların olumlu düzenlenmiş çevirisinden oluşan yeni bir alan oluşturacağına inanıyoruz. Bu fonksiyonun bir parçası olarak, bu teknolojinin, biyoreaktörler gibi daha büyük miktarlarda protein in vitro üretmek için ve doğal olarak gen dozajını düzeltmek için in vivo'da etkili olacağını öngörüyoruz.
